法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2015-12-09
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C12N1/20 授权公告日:20090527 终止日期:20141014 申请日:20031014
专利权的终止
2009-05-27
授权
授权
2006-03-01
实质审查的生效
实质审查的生效
2006-01-04
公开
公开
本发明涉及一种新的条件性复制DNA分子，该DNA分子可以用于基因治疗或重组蛋白质的产生。在下文中，将根据本发明的新DNA分子指定为pCORTM。
基因治疗在于通过将遗传信息引入受影响的器官或细胞而修正缺陷或异常。该信息可以通过体外引入从器官提取的细胞，然后再输入到体内；或者在体内直接引入靶组织。作为高分子量和负电荷分子，DNA自发穿过磷脂细胞膜是有困难的。因此使用多种载体使基因转移发生：另一方面为病毒载体，另一方面为天然或合成的化学和/或生物化学载体。
病毒载体(逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒等)是非常有效的，尤其用于穿过膜，但是存在某些风险，例如病原性、重组、复制和免疫原性。
化学和/或生物化学载体避免了这些风险(见Behr，1993，Cotton和Wagner 1993综述)。例如，它们是通过与DNA形成沉淀物而起作用的阳离子(磷酸钙、DEAE-葡聚糖等)，这些沉淀物可以被细胞“吞噬”。它们也可以是能与细胞膜融合的脂质体，DNA分子整合于其中。合成的基因转移载体通常为脂类或阳离子聚合物，它们与DNA复合，并与其形成具有表面正电荷的粒子。作为该类型载体的实例，可以特别提及双十八烷基酰胺甘氨酰精胺(DOGS，TransfectamTM)或N-[1-(2，3-二油基氧基)丙基]-N，N，N-三甲基胺(DOTMA，LipofectinTM)。
然而，使用化学和/或生物化学载体或裸露DNA，意味着生产大量药理学纯DNA的可能性。对此的理由是，在基因治疗技术中，医学产物由DNA本身组成，以适当量制造具有适于人类基因治疗用途的特性的DNA是必须的。
在非病毒载体学的情况下，所用载体为细菌起源的质粒。用于基因治疗的质粒通常携带(i)复制起点，(ii)标志基因，例如抗生素抗性基因(卡那霉素、氨苄青霉素等)以及(iii)一个或多个转基因，这些转基因具有其表达所必需的序列(增强子、启动子、聚腺苷酸化序列等)。然而，目前可利用的技术并非完全令人满意。
一方面，保持在体内传播的风险。因此，存在于体内的细菌可以以低频率接受该载体。如果涉及体内基因治疗，该风险的可能性将更大，在所述体内基因治疗中，DNA可以传播到患者体内，并可以与感染该患者的细菌或共生菌落的细菌接触。如果接受此质粒的细菌为肠细菌，例如大肠杆菌(E.coli)，该质粒可以进行复制。这类事件导致治疗基因的传播。如果用于基因治疗处理的治疗基因编码例如淋巴因子、生长因子、抗癌基因、或其在宿主内功能缺陷但可能修正遗传缺陷的蛋白质，这些基因中部分的传播可能具有不可预见的令人担忧的作用(例如，如果病原细菌获得了人类生长因子基因)。
另一方面，通常用于非病毒基因治疗的质粒也具有抗生素抗性标志(氨苄青霉素、卡那霉素等)。由于任何抗生素治疗(使用与选择质粒抗性基因相同家族的抗生素)将导致对讨论中的质粒的选择，因此获得这类质粒的细菌由此拥有了无法否定的选择优势。从这个角度，氨苄青霉素属于在世界范围内使用最频繁的α-内酰胺家族。作为非抗生素抗性基因的选择标志在细菌中的用途因此将特别有利。它将避免对可能接受了携带这类标志的质粒的细菌的选择。
因此，尽可能的寻求对治疗基因和抗性基因的传播限制格外重要。
本发明的主题是明确地建议一种新的DNA分子，该DNA分子可以用于基因治疗或用于在体外产生重组蛋白质，并且仅在可以弥补这些非病毒载体的某些功能的细胞中复制。
本发明也涉及用于制备这些DNA分子的特别有效的方法。
所述DNA分子具有去除了质粒传播相关风险的优点，这些风险例如(1)复制和传播，可以导致治疗基因不受控制地过表达，(2)抗性基因的传播和表达。根据本发明的DNA分子中含有的遗传信息有效地包括了治疗基因以及调节其表达的信号，大大限制该质粒宿主细胞谱的有效的条件性复制起点，长度缩短的、优选不同于赋予抗生素抗性的基因的选择标志，如果合适，还可以含有使质粒多聚体解离的DNA片段。这些分子(及其含有的遗传信息)转移至微生物并稳定保持的可能性非常有限。
最后，根据本发明的载体(由于其环形结构、缩短的长度以及超螺旋形式，本发明的载体也称为小质粒)具有如下额外的优点：由于其与常规使用的ColE1衍生质粒相比具有缩短的长度，根据本发明的DNA分子具有较好的体内生物利用度，而且该DNA分子或pCOR以稳定的染色体外形式停留在不含起始蛋白质的原核或真核宿主细胞中。它们特别具有改善的细胞穿透或分布能力。因此，公认组织扩散系数与分子量成反比(Jain，1987)。类似的，在细胞中，高分子量的分子具有更低的穿过细胞膜的渗透性。另外，为了使质粒进入其表达所必需的核，高分子量也是一个缺点，核孔对扩散入核加以了大小限制(Landford等，1986)。根据本发明的DNA分子非治疗部分(特别是复制起点和选择基因)的长度缩短，也使缩短DNA分子长度成为可能。使该质粒在细菌中复制并选择的部分(1kb)降低了三倍，例如，计算3kb为复制起点和抗性标志载体部分。上述在(i)分子量和(ii)负电荷方面的降低，赋予本发明分子以提高的组织、细胞和核生物利用度以及扩散。
更精确地，本发明涉及可用于基因治疗的环形DNA分子，该分子包括至少一个目的核酸序列，其特征在于允许其复制的区域包括复制起点，该复制起点在宿主细胞中的功能需要存在至少一种该宿主细胞的外源特定蛋白质。
该DNA分子可以以单链或双链形式存在，并且有利地具有超螺旋形式。
对于本发明目的，所用宿主细胞可以是多种来源。它们可以是真核或原核细胞。根据本发明的优选方案，它们是原核细胞。
细菌质粒的复制传统上需要至少一种由宿主细胞编码的RNA聚合酶、RNA酶、DNA聚合酶等类型的蛋白质。因为上文所解释的原因，使用这种类型的复制，不可能完全克服任何在治疗机体中传播的可能风险。有利的是，根据本发明的DNA分子复制起点的功能需要特定的宿主细胞外源蛋白质。该特征的意义在于，将所述质粒的宿主谱减小为表达该起始蛋白质的特定菌株。在本发明上下文中发展的DNA分子因此有利的具有所谓的条件性复制起点。
根据本发明使用的条件性复制起点可以来源于具有下述特征的质粒或噬菌体：在其复制起点中含有重复序列或重复子，它们编码至少一种对其特异的复制起始蛋白质(Rep)。作为举例，可以提及下述质粒或噬菌体的条件性复制系统：
根据本发明的优选方案，所述DNA分子中使用的复制起点来自被称为R6K的天然大肠杆菌质粒。
R6K的复制功能集中在5.5kbp的DNA片段中(图1)，该片段含有3个复制起点α、β和γ(γ和α提供90％的复制)和编码П复制起始蛋白质和蛋白质Bis的操纵子。将上述质粒保持在其特征性拷贝数(每个基因组15拷贝)所需的最小量遗传信息包括在两个元件中：400bp的oriγ和基因pir，该基因产物为П起始蛋白质。
Oriγ可以划分为两个功能部分：核心部分和激活元件(图1)。复制所必需的核心部分含有重复子(7个正向重复，每个22bp)和侧翼序列，SEQ ID No.1中描述的П蛋白质与该重复子结合，侧翼序列是宿主蛋白质(IHF，DnaA)的靶标。
根据本发明的优选模式，所述载体的复制起点完全或部分由质粒R6K的γ复制起点组成，更优选完全或部分由SEQ ID No.1或其衍生物之一组成。
上述复制起点具有长度非常有限的优点，只在特定的起始蛋白质(即由基因pir(SEQ ID No.2)产生的Pi蛋白质)的存在下才有功能。由于该蛋白质以反式作用，将oriγ与pir基因物理分离是可能的，可以将pir基因引入选为这些质粒特定宿主的细胞的基因组中。П的突变可以改变其抑制功能(Inuzuka和Wada，1985)，并导致R6K衍生物拷贝数增加至初始拷贝数的10倍以上。这些置换可以在40个氨基酸的结构域中，或者在П蛋白质的其他区域中，因此40个氨基酸的结构域内的突变似乎通过П来负责对质粒拷贝数的控制(图2)。
根据本发明的有利的实施方案，在宿主细胞中表达的П蛋白质源于SEQ ID No.2中描述的基因或如上定义之衍生物之一的表达，特别是与pir基因相比含有突变的基因pir116的表达。该突变对应于在从起始密码子开始的106位由亮氨酸取代脯氨酸。在这种情况下，R6K衍生物的拷贝数约为每个基因组250个拷贝。
对于本发明目的，术语衍生物表示有别于所考虑的序列、通过一个或多个遗传和/或化学性质的修饰而获得的任何序列，以及与这些序列或片段杂交并且其产物具有复制起始蛋白质П的活性的任何序列。术语遗传和/或化学性质的修饰，可以理解为指一个或多个残基的任何突变、置换、缺失、添加和/或修饰。术语衍生物也包括与所考虑的序列同源、得自其它细胞来源(特别是人源或来自其他生物细胞)并具有相同类型活性的序列。这些同源序列可以通过杂交实验获得。杂交可以从核酸文库开始，使用天然序列或其片段作为探针，在传统的严紧性条件下进行(Maniatis等，cf.General techniques of molecular biology)，或者优选在高严紧性条件下进行。
除了如上定义的条件性复制起点，所述DNA分子还含有包括一个(或多个)确保DNA分子在所选宿主内被选择的基因的区域。
该基因可以是赋予抗生素抗性(例如卡那霉素、氨苄青霉素、氯霉素、链霉素、壮观霉素、青紫霉素等)的基因类型的传统标志。
然而，根据本发明的优选实施方案，该区域不同于赋予抗生素抗性的基因。因此它可以是这样一个基因：在确定的培养条件下，其产物对宿主的存活是必需的。例如，它可以是：
-编码天然或合成起点的抑制型tRNA的基因。其更优选为琥珀密码子tRNA(TAG)
-其产物是在某种培养条件下的细胞代谢所必需的基因，即参与代谢物(氨基酸、维生素等)的生物合成的基因、或者是使细胞可吸收存在于培养基中的物质(特定的氮源或碳源)的分解代谢基因等。
根据本发明的优选模式，该区域含有编码特定密码子的抑制型tRNA的基因表达盒。后者可以特别从编码苯丙氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、丙氨酸和组氨酸的那些中被选择。更特别为琥珀密码子抑制型tRNA(TAG)。
在此特定情况下，用于在宿主细胞中选择本发明主题的DNA分子的系统包括两个元件：1)DNA分子上编码琥珀密码子(TAG)的抑制型转运RNA的基因，该基因构成选择标志，即所知的(sup)基因，以及2)特定宿主，其在确定培养条件下必需的基因含有琥珀密码子TAG。在含有TAG密码子基因的产物是必需的培养条件下，只有在允许sup表达的质粒存在于细胞中时，该细胞才可以生长。培养条件从而构成该DNA分子的选择压力。所用sup基因可以为天然来源(Glass等，1982)或来自任何合成的构建体(Normanly等，1986，Kleina等，1990)。
依赖于含有琥珀突变的基因，就其确定多种选择性培养基而言，这样的系统提供了巨大的灵活性。例如在细菌乳酸乳球菌(Lctococcuslactis)中，琥珀密码子位于嘌呤生物合成基因中。当细菌在乳中繁殖时，允许携带编码抑制型tRNA的基因的质粒的选择。这样的标志具有非常短小不含起源于噬菌体或转座子的非“外源”序列的优点。
根据本发明的特定实施方案，DNA分子也包括位点特异性重组酶的靶DNA片段，该片段使质粒多聚体解离。
因此，引入到复制起点例如为oriγ的环形DNA分子中的这类片段，使此类质粒的多聚体解离。特别是从携带突变的pir等位基因(例如pir 116)的菌株制备DNA分子时，可以观察到这样的多聚体，突变的pir等位基因可能使R6K衍生物的拷贝数增加。
可以使用多种在序列之间产生位点特异性重组的系统实现所述重组。更优选使用特定的分子内重组序列获得本发明的位点特异性重组，该分子内重组序列可以在特定蛋白质(通常指重组酶)的存在下彼此重组。在此特定情况下，这些特定蛋白质为重组酶XerC和XerD。因此，根据本发明的DNA分子通常也含有允许所述位点特异性重组的序列。在根据本发明的基因构建体中存在的特定重组系统(重组酶和特异性识别位点)可以是不同起源。特别地，使用的特定序列和重组酶可以属于不同的结构类型，尤其是属于转座子Tn3解离酶家族或噬菌体λ整合酶家族。在属于转座子Tn3家族的重组酶中，特别要提到转座子Tn3或转座子Tn21和Tn522解离酶(Stark等，1992)；噬菌体μ的Gin转化酶或质粒(例如RP4par片段)解离酶(Abert等，Mol.Microbiol.12(1994)131)。在属于噬菌体λ整合酶家族的重组酶中，特别要提到噬菌体λ(Landy等，Science 197(1977)1147)、P22和Φ80的整合酶(Leong等，J.Biol.Chem.260(1985)4468)；流感嗜血杆菌(Haemohilus influenzae)的HP1(Hauser等，J.Biol.Chem.267(1992)6859)；噬菌体P1的Cre整合酶；质粒pSAM2整合酶(EP 350341)或2μ质粒FLP重组酶和大肠杆菌XerC和XerD重组酶。
构成本发明主题的DNA分子优选含有天然的大肠杆菌质粒ColE1的片段cer。所用的cer片段是来自ColE1的382bp HpaII片段，已经证实该片段导致顺式质粒多聚体解离(Summers等，1984；Leung等，1985)。也可以使用更小长度的HpaII-TaqI片段(280bp)，或在HpaII中含有的更小片段(约220bp)，所述片段具有同样的性质(Summers和Sherratt，1988)。所述解离通过特定的分子内重组而发生，涉及四个由大肠杆菌基因组编码的蛋白质：ArgR、PepA、XerC和XerD(Stirling等，1988，1989；Colloms等，1990；Blakely等，1993)。天然大肠杆菌质粒ColE1的cer片段的插入可以获得质粒多聚体的高度解离，从而产生高比例的可复制形式的单体。已经证实，cer位点插入到含有pBluescript SK+的ColE1复制起点的微环中，并未引起有效的多聚体解离(Kreiss等，Appl.Microbiol.Biotechnol，49：560-567(1998))，因此这一点尤其出乎意料，质粒顺式的有效解离是不可预测的，似乎依赖于质粒构型。对于pCOR质粒，当pCOR中存在cer时，实现了有效的顺式解离，从而产生未预料到的高度的可复制形式的单体。
从该角度，使用全部或部分ColE1 cer片段或其如上所述之衍生物之一是特别有利的。
根据执行变化，本发明的DNA分子也可以包括能够特异地与配体相互作用的序列。优选能够通过杂交与特定寡核苷酸形成三螺旋的序列。该序列因此可能通过与固定在支持物上的互补寡核苷酸的选择性杂交来纯化本发明的分子。(见申请WO 96/18744及WO 02/07727)。所述序列可以是天然存在于美国申请人的公开申请2003/186268中说明的质粒复制起点中，或者天然存在于WO02/07727中说明的转基因中，作为选择，如果不影响目的基因和复制起点的功能，其可以定位于本发明DNA分子的任何位点。经杂交形成的三螺旋因此发生在寡核苷酸和存在于所述DNA中的特定互补序列之间。就此而言，为了获得最佳产量和最佳选择性，在本发明中使用完全互补的寡核苷酸和特定序列。特别的，它们可以是寡核苷酸聚(CTT)和特定序列聚(GAA)。例如，含有例如CTT重复基序的寡核苷酸能够和含有互补单元(GAA)的特定序列形成三螺旋。讨论的序列尤其可以是含有7、14或17个GAA单元的区域，在寡核苷酸中含有相应数量的重复CTT。在此情况下，寡核苷酸与多嘌呤链以反平行方向结合。这些三螺旋仅在Mg2+存在下稳定(Vasquez等，Biochemistry，34：7243-7251(1995)；Beal和Dervan，Science，251：1360-1363(1991))。
如上所述，该特定序列可以是天然存在于pCOR中的序列、或是随后人工引入后者的合成序列。使用能够与天然存在于pCOR中的序列(例如质粒复制起点或标志基因中)形成三螺旋的寡核苷酸尤其有利。合成能够与这些天然同嘌呤-同嘧啶区域形成三螺旋的寡核苷酸是特别有利的，因为其可用于未经修饰的pCOR质粒中。特别优选的可以与特定寡核苷酸形成三螺旋的靶序列已在ColE1和pCOR复制起点中确定。ColE1衍生质粒含有12聚体同嘌呤(homopurine)序列(5′-AGAAAAAAAGGA-3′)(SEQ ID NO：33)，其上游被参与质粒复制的RNA-II转录物加帽(Lacatena等，Nature，294：623(1981))。该序列与12聚体互补寡核苷酸5′-TCTTTTTTTCCT-3′(SEQ ID NO：34)形成稳定的三螺旋结构。pCOR骨架含有14个非重复碱基的同嘌呤片段(5′-AAGAAAAAAAAGAA-3′)(SEQ ID NO：35)，其位于pCORγ复制起点的A+T富集片段(Levchenko等，Nucleic Acids Res.，24：1936(1996))。该序列与14聚体互补寡核苷酸5′-TTCTTTTTTTTCTT-3′(SEQ ID NO：36)形成稳定的三螺旋结构。相应的寡核苷酸5′-TCTTTTTTTCCT-3′(SEQID NO：37)和5′-TTCTTTTTTTTCTT-3′(SEQ ID NO：38)有效并特异地靶向分别位于ColE1 ori复制起点或pCOR(复制起点γ)内的互补序列。使用能够与复制起点或标志基因中存在的序列形成三螺旋的寡核苷酸也是特别有利的，因为使用相同的寡核苷酸，使含有所述复制起点或所述标志基因的任何DNA的纯化成为可能。因此，没有必要为了将特定的人工序列整合其内而对质粒或双链DNA进行修饰。
尽管优选完全互补的序列，仍然可以理解，倘若不导致亲合力的过多损失，寡核苷酸序列和存在于DNA内的序列之间的一些错配是可以容忍的。可以提及存在于大肠杆菌β-内酰胺酶基因中的序列5′-AAAAAAGGGAATAAGGG-3′(SEQ ID NO：39)。在此情况下，打断多聚嘌呤序列的胸腺嘧啶可以被第三链的鸟嘌啉识别，从而形成G*TA三体，当其与两个T*AT三体在侧翼相接时，该G*TA三体是稳定的(Kiessling等，Biochemistry，31：2829-2834(1992))。
根据特定的实施方案，使用的寡核苷酸可以包括序列(CCT)n、序列(CT)n或序列(CTT)n，其中，n为1-15的整数。使用(CT)n或(CTT)n型的序列尤其有利。寡核苷酸也可以结合(CCT)、(CT)或(CTT)单元。
使用的寡核苷酸可以是天然的(由未经修饰的天然碱基形成)或经过化学修饰的。特别地，寡核苷酸可以具有某些化学修饰，使其具有核酸酶抗性或保护性、或对特定序列的亲合力增加。
作为本发明的DNA分子的代表，可以最特别地提及质粒pXL2774及其衍生物。对于本发明目的，将术语衍生物理解为指任何衍生自pXL2774、并且含有除荧光素酶基因之外的一个或多个目的基因的构建体。也可以提及含有治疗基因表达盒的质粒pXL3029、pXL3030，以及质粒pXL3179或NV1FGF。在最优选的实施方案中，本发明涉及包括FGFa或FGF-1基因的pCOR，该质粒指定为pXL3179或NV1FGF，美国申请人的专利4,686,113中对其进行了说明。
本发明也涉及特定宿主细胞构建方法的开发，该宿主细胞对产生这些治疗性DNA分子特别有效。
本发明的另一个主题涉及产生环形DNA分子的方法，该方法特征在于：在允许对转化所述DNA分子的宿主细胞进行选择的条件下，培养含有至少一种如上定义之DNA分子和蛋白质的宿主细胞，该蛋白质可以在或不在原位表达、对所述宿主细胞是外源且特异的并调节所述DNA分子复制起点的功能。
更优选从相应基因原位表达调节该DNA分子复制起点功能的蛋白质。可以使用辅助复制子携带编码复制起始蛋白质的基因，该辅助复制子与条件性复制起点的衍生物兼容，或者可以使用转座子、噬菌体或其他任何载体重组引入宿主细胞基因组中。在表达蛋白质的基因被置于辅助复制子中的特定情况下，后者也含有可用于细胞中有效转录的启动子区，以及位于3’末端、指明转录终止信号的区域。关于启动子区，当所考虑的基因能在细胞中发挥功能时，可以是天然负责表达该基因的启动子区。也可以是不同起源的区域(负责表达其他蛋白)、或者甚至是合成来源。特别地，可以是原核或噬菌体基因的启动子。例如，可以是从细胞基因组获得的启动子。
作为编码复制起始蛋白质的基因，可以使用野生型基因或突变的等位基因，它们可能为起始蛋白质获得特异性质粒(或衍生物)的增加的拷贝数，其中所述起始蛋白质调节了所用DNA分子中复制起点的功能。
特别对质粒R6K(Inuzuka和Wada，1985；Greener等，(1990)、Rtsl(Terawaki和Itoh，1985；Terawaki等，1990；Zeng等，1990)、F(Seelke等，1982；Helsberg等，1985；Kawasaki等，1991)、RK2(Durland等，1990；Haugan等，1992，1995)和pSC101(Xia等，1991；Goebel等，1991；Fang等，1993)描述了这类突变。
当使用的DNA分子具有来源于质粒R6K的复制起点的情况下，起始蛋白质是同一质粒的П蛋白质的衍生物。表达能够显著增加初始拷贝数的该蛋白质的突变形式是特别有利的。为了做到这一点，整合到宿主细胞中的基因优选由SEQ ID No.2中描述序列或其衍生物的全部或部分所代表，最优选为pir 116基因。相关突变对应于以亮氨酸替换脯氨酸。根据本发明的特定实施方案，所述pir 116基因直接整合到宿主细胞基因组中。
在所选培养条件下必需的特定宿主细胞基因有利的含有被所选DNA分子中抑制型tRNA识别的特定密码子。根据本发明的优选模式，所述特定密码子为琥珀TAG密码子。在此特定情况下，在含有TAG密码子的基因产物为必需的培养条件下，只有在宿主细胞中存在允许sup表达的质粒的情况下，细胞才能生长。培养条件因而构成该DNA分子的选择压力。
含有琥珀密码子的基因优选为参与氨基酸精氨酸生物合成的基因。该基因即argE，编码N-乙酰鸟氨酸酶(N-acetylornithinase)(Meinnel等，1992)，在此情况下含有对应于点突变Gln-53(CAG)- ＞TAG的TAG密码子；通过在M9基本培养基中培养，提供携带sup基因的质粒的选择压力(Maniatis等，1989)。然而，也可以是例如维生素或核酸碱基的生物合成基因，或者是允许使用特定氮源或碳源的基因、或是在选择的培养条件下其功能是细胞存活所必需的基因。
宿主细胞优选选自大肠杆菌菌株，更优选以菌株大肠杆菌XAC-1为代表。
根据本发明的特定实施方案，在所术方法中使用的宿主细胞为基因组中含有pir 116基因并用质粒pXL2774或其衍生物之一转化的大肠杆菌菌株XAC-1。
根据本发明的有利变体，在所述方法中使用的宿主细胞是原核细胞，其endA1基因或同源基因被失活。endA基因编码大肠杆菌核酸内切酶I。这种周质酶具有非特异性剪切双链DNA的活性(Lehman，I.R.，G.G.Roussos和E.A.Pratt(1962)J.Biol.Chem.237：819-828；Wright M.(1971)J.Bacteriol.107：87-94)。对多种大肠杆菌(野生型或endA)进行的研究显示，在这些细菌菌株提取物中孵育的质粒DNA的降解，在endA+菌株中存在，但是在endA突变株中不存在(WnendtS.(1994)BioTechniques 17：270-272)。由Promega公司使用其纯化系统(Shoenfeld，T.，J.Mendez，D.Storts，E.Portman，B.fPatterson，J.Frederiksen和C.Smith，1995.Effects ofbacterial strains carrying the endA1 genotype on DNA qualityisolated with Wizard plasmid purification systems.Promega notes53)，对从endA+菌株或endA突变株中分离的质粒的质量进行研究。其结论如下：从endA突变体制备的DNA质量整体优于从测试的endA+菌株制备的DNA质量。
因此，该质粒DNA制剂的质量受任何所述核酸内切酶的污染所影响(该DNA的相对长期降解)。
不难设想endA基因的缺失或突变使不再具有所述核酸内切酶活性的突变体在整体上与野生型一样。(Dürwald，H.和H.Hoffmann-Berling(1968)J.Mol.Biol.34：331-346)。
可以通过突变、全部或部分缺失、断裂等失活endA1基因。选作产生pCOR质粒的大肠杆菌菌株endA基因的失活，可以更特别地通过如下方法实现：使用P1噬菌体转移由Cherepanov和Wackernagel描述的ΔendA∷TcR删除(Cherepanov，P.P.和W.Wackernagel.1995.Genedisruption in Escherichia coli：TcR and KmR cassettes with theoption of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistancedeterminant.Gene 158：9-14)；或通过同源重组，用突变或缺失的endA等位基因交换存在于目的细菌基因组中的野生型等位基因。本发明中这种类型菌株的使用，可以有利地改进产生的DNA的质量。
本发明也涉及含有如上所述之DNA分子的任何重组细胞。所述细胞可以是真核、原核类型等多种起源的细胞。
根据本发明的另一个实施方案，在所述方法中使用的大肠杆菌XAC-1宿主细胞指定为TEX1，包括失活的traD基因或其同源基因，以去除F′转移。traD在tra操纵子之一的5′末端，编码直接参与DNA转移和DNA代谢的81.7kDa膜蛋白(Frost等，Microbiology Reviews，1994，58：162-210)。traD突变体不转移DNA(Panicker等，J.Bacteriol.，1985，162：584-590)。可以使用本领域熟知的方法，通过突变、完全或部分缺失或断裂来失活游离的traD基因(见实施例9)。失活该基因的一种方法在实施例1中得到说明，将由此获得的大肠杆菌XAC-1 pir116 endA-traD-菌株指定为TEX1(Soubrier等，Gene Therapy，1999，6：1482-1488)。
根据本发明的一个实施方案，在所述方法中使用的宿主细胞，是含有pri42突变和pir116突变的大肠杆菌菌株XAC-1。pir116和pir42突变影响pi蛋白质的不同结构域。pir116突变影响拷贝数控制区，而pir42突变影响推定的亮氨酸拉链基序，如图11所示。含有pir116和pir42突变的pir基因，分别在图12、SEQ ID NOs：21和22中说明其核酸和氨基酸序列。pir42突变包括从蛋氨酸密码子开始第124位C到T的转换，因此导致第42位脯氨酸被亮氨酸置换。pir42突变由Miron等描述(Proc Natl Acad Sci USA，1994.91(14)：p.6438-42；EMBOJ，1992.11(3)：p.1205-16)，据报导，与含有野生型pir基因的相同质粒相比，“oriγR6K-KmR-pir42”质粒的拷贝数增加了2.5倍。然而，pir42突变从不与pir116突变联合使用或描述，尽管其他拷贝增加型突变(copy-up mutation)(例如pir基因中的cop21)与pir116联合时，没有表现出质粒拷贝数的增加，但是在大肠杆菌XAC-1 endA-traD-菌株中，pir116和pir42突变的联合令人惊讶地显示出质粒拷贝数的显著增加。从而，与单独含有pir116的菌株或与含有联合其他pir基因突变cop21(例如突变(Inuzuka等，FEBS Lett，1988：228(1)：p.7-11))的pir116突变的宿主细胞相比，在包括突变pir116和pir42基因的大肠杆菌宿主菌株中，申请人表明这种联合在产生的质粒拷贝数方面取得了未曾预料的结果。例如，与pir116菌株或含有pir116和cop21突变的菌株相比，大肠杆菌TEX1 pir42(＝XAC-1 endA-traD-pir116pir42)显示出质粒拷贝数增加2至5倍(见实施例11)。在另一个实施方案中，pir基因包括至少一个突变，该突变可以出现在例如拷贝数控制区、亮氨酸拉链样基序、DNA结合区、或一个或多个这些区域或由pir基因编码的蛋白质pi的其它区域。
根据本发明的原核宿主细胞，也包括由pir基因拷贝编码的蛋白质pi中相同或不同结构域内的一个或多个突变，例如DNA结合域、和/或拷贝数控制区和/或亮氨酸拉链基序。原核重组宿主细胞可以在质粒或宿主细胞基因组中包括异源pir基因。
根据本发明其后说明的一个方面，这类突变可以通过使用以荧光为基础的筛选方法进行筛选。如实施例13中显示，使用根据本发明以荧光为基础的筛选方法，对包括pir基因中至少一个突变、突变pir116和DNA结合域中的突变的宿主细胞进行筛选。使用以荧光为基础的筛选方法检测宿主细胞产生高拷贝数质粒的能力，所述宿主细胞含有出现在DNA结合域和pir116的突变，即，例如在构建体100B中，其中292位酪氨酸(K)被蛋氨酸(M)置换；在构建体114C中，其中130位谷氨酸(E)被缬氨酸(V)置换；或在构建体201C中，其中117位天冬氨酸(D)被甘氨酸(G)置换(图26)。
根据本发明另一个实施方案，在所述方法中使用的宿主细胞是原核宿主细胞，其recA基因或同源基因被失活。根据本发明的宿主细胞优选为包括突变pir116、pir42、endA-、traD-、recA-的大肠杆菌菌株XAC-1。将这种菌株指定为TEX2pir42。可以使用本领域技术人员熟知的方法将recA失活。recA编码主要的重组蛋白质，该基因的突变降低了能够导致质粒多聚化、由重组介导的质粒变异和分子间重组频率。如实施例12所说明，可以通过PCR获得在5’末端含有3个终止密码子(每个读码框一个)的缺失的recA基因。随后通过基因置换将产生的失活基因引入TEX1基因组(实施例12.1)。
使用本领域技术人员所知的将所述质粒引入给定细胞的任何技术获得这些细胞。特别地，这些技术特别可以是转化、电穿孔、接合、原生质体融合或其他本领域技术人员所知的任何技术。
菌株XAC-1pir116在布达佩斯条约下，于2003年10月10日、以保藏号I-3108保存于Collection Nationale De Cultures deMicro-organismes(CNCM)，Institut Pasteur，28，rue Dr.Roux，75724 Paris Cedex 15，法国。
菌株TEX2pir42在布达佩斯条约下，于2003年10月10日、以保藏号I-3109保存于Collection Nationale De Cultures deMicro-organismes(CNCM)，Institut Pasteur，28，rue Dr.Roux，75724 Paris Cedex15，法国。
在任何疫苗接种或基因和细胞治疗实施中，根据本发明的DNA分子可以用于将基因转移至给定的细胞、组织，或机体，或者用于在体外产生重组蛋白质。
它们特别可以用于体内直接使用或细胞的体外或离体修饰以将它们移植入患者。
从这个方面，本发明的另一个主题涉及任何药物组合物，该组合物包括至少一种如上定义的DNA分子。该分子可以或不可以与化学和/或生物化学转染载体联合。所述载体特别可以包括阳离子(磷酸钙、DEAE-葡聚糖等)或脂质体。联合的合成载体可以是阳离子聚合物或脂类。这类载体可以提及的实例为DOGS(TransfectamTM)或DOTMA(lipofectinTM)。
根据本发明的药物组合物可以设计成用于局部、口服、胃肠外、鼻内、静脉内、肌肉、皮下、眼内或透皮施用。所述质粒优选以可注射形式或药膏(in application)使用。质粒可以与任何药理学上接受用于可注射剂型(特别是接受治疗部位的直接注射)的媒介物(vehicle)混合。这特别可以包括消毒的等渗溶液或干粉组合物，特别是冻干的组合物，根据情况，通过添加灭菌水或生理盐水配成可注射溶液。这尤其可以包括以葡萄糖或氯化钠稀释的Tris或PBS溶液。对患者受影响的部位直接注射是有利的，因为这样使治疗作用集中在受影响组织的水平。使用的剂量可以作为多个参数的函数被调节，尤其是作为基因、载体、使用的给药模式、相关药理学或治疗所需时期的函数。
本发明的DNA分子可以含有一个或多个目的基因，即一个或多个核酸(合成的或半合成的DNA、gDNA、cDNA等)，其在靶细胞中的转录以及可能的翻译，产生治疗性、疫苗性、农艺或兽医目的的产物。
在治疗性目的基因中，可以更特别提及的是编码酶、血液衍生物、激素和淋巴因子：白介素、干扰素、TNF等(FR 92/03120)；生长因子；神经递质或其前体、或合成酶、以及营养因子(BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、NT3、NT5、VEGF-B、VEGF-C等)；载脂蛋白：ApoAI、ApoAIV、ApoE等(FR 93/05125)；肌营养不良蛋白或小肌营养不良蛋白(minidystrophin)(FR 91/11947)的基因；肿瘤抑制基因：p53、Rb、Rap1A、DCC、k-rev等(FR 93/04745)；编码涉及凝血的基因：因子VII、VIII、IX等；自杀基因：胸腺嘧啶激酶、胞嘧啶脱氨酶等；或编码所有或部分天然或人工免疫球蛋白(Fab、ScFv等)、RNA配体(WO 91/19813)的基因等。治疗基因也可以是反义序列或基因，其在靶细胞内的表达可以控制基因的表达或细胞mRNA的转录。例如，根据专利EP 140,308中说明的技术，这类序列可以在靶细胞内被转录为与细胞mRNA互补的RNA，从而阻止其翻译为蛋白质。可以被本发明pCOR携带的目的插入物是RNAi，RNAi可以干扰靶基因的翻译(Wilson等，Curr Opin Mol Ther.2003Aug；5(4)：389-96)，从而调节该基因的表达。
出于产生疫苗的目的，目的基因也可以是疫苗基因，即编码抗原性肽、能在人或动物体内产生免疫反应的基因。这些抗原性肽特别可以是Epstein-Barr病毒、HIV病毒、乙型肝炎病毒(EP 185,573)或假狂犬病毒的特异性抗原性肽，或是肿瘤的特异性抗原性肽(EP 259,212)。
通常，本发明的DNA分子中，治疗性、疫苗性、农艺或兽医目的的基因也含有用于在靶生物或细胞内有效转录的启动子区，以及位于3′末端、指定转录终止信号和聚腺苷酸化位点的区域。关于启动子区，当某启动子区能够在有关细胞或机体内运行时，该启动子区可以是天然负责所考虑的基因的表达的启动子区。该启动子区也可以是不同来源的区域(负责其他蛋白质的表达)，或者甚至是合成来源的区域。特别地，它们可以是来自真核或病毒基因的启动子序列。例如，它们可以是从靶细胞基因组获得的启动子序列。可以使用的真核启动子是以特异性或非特异性、可诱导或不可诱导、强或弱的方式刺激或抑制基因转录的任何启动子或衍生序列。真核启动子尤其可以是遍在启动子(ubiquitouspromoters)(HPRT、PGK、α-肌动蛋白、微管蛋白等基因启动子)、中间纤维启动子(GFAP、结蛋白、波形蛋白、神经丝蛋白、角蛋白等基因启动子)、治疗基因启动子(例如MDR、CFTR、因子VIII、ApoAI等基因启动子)、组织特异性启动子(丙酮酸激酶、绒毛蛋白、肠脂肪酸结合蛋白、平滑肌α-肌动蛋白等基因启动子)或刺激应答启动子(甾体激素受体、视黄酸受体等)。类似地，它们可以是从病毒基因组获得的启动子序列，例如腺病毒E1A和MLP基因的启动子、CMV早期启动子或RSV的LTR启动子等。另外，通过增加激活或调节序列、或允许组织特异性表达或明显的组织特异性表达的序列，可以对这些启动子区进行修饰。
此外，目的基因也可以含有引导合成产物进入靶细胞分泌路径的信号序列。该信号序列可以是合成产物的天然信号序列，但是也可以是任何其他有效的信号序列或人工信号序列。根据本发明，使用的优选信号序列是由Taniguchi等说明的人类干扰素分泌信号肽(Gene，1980，233(4763)：541-5)。
依赖于目的基因，本发明的DNA分子可以用于医疗或预防一些疾病，包括遗传性疾病(肌营养不良、囊性纤维化等)、神经退行性疾病(阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、ALS等)、癌症、凝血功能紊乱或异常脂蛋白血症相关疾病、病毒感染相关疾病(肝炎、AIDS等)、或用于农艺和兽医领域等。
根据优选的实施方案，本发明的DNA分子用于治疗严重的肢体缺血疾病(例如外周动脉闭塞性疾病和间歇性跛行)。
另外，本发明也涉及使用条件性复制DNA分子产生重组蛋白质。可以使用细菌产生多种来源(真核或原核)的蛋白质。在细菌中，大肠杆菌由于其易于操作、可获得大量表达系统以及可获得大量蛋白质，选为表达异源基因的生物。应当理解，本发明的系统可以用于其他生物，如上文所指出，取向取决于复制起点的特征。对此用途，目的核酸序列包括在表达信号控制下的编码区，该表达信号适合于选用的宿主，特别是原核宿主。它们可以是诸如Plac、Ptrp、PT7、Ptrc、Ptac、PL、PBAD或PR启动子、Shine-Dalgarno序列等(该组构成了表达盒)。目的核酸序列可以是编码具有药剂、农业食品、化学或农业化学价值的蛋白质的任何序列。所述核酸序列可以是结构基因、互补DNA序列、合成或半合成序列等。
该表达盒可以引入作为本发明主题的条件性复制载体上，从而构建使目的蛋白质在大肠杆菌内表达的条件性复制载体。此载体具有几个优点：不使用抗生素在细菌中对其进行选择(降低的花费、不需要关于成品中存在抗生素或潜在毒性衍生产物的研究)、基本上没有质粒在自然界传播的可能性(条件性复制起点)、可以在完全确定成分培养基中发酵。给出的实施例显示这些条件性载体对于产生重组蛋白质的有利特性。
如上所述，根据本发明的DNA分子包括来源于R6K的复制起点ORIγ，其中pir基因被去除并且被引入特定宿主细胞基因组中，该特定宿主细胞用于大规模产生此DNA分子。临床试验和/或以DNA为基础的基因治疗总是需要产生增加数量的质粒。已经设计出携带pir基因的生产宿主细胞，其中pir基因含有至少一个突变，例如突变pir116和/或pir42。这类突变的宿主菌株的使用导致增加的质粒拷贝数，从而显著地增加了产物产量。这样产生的质粒的构型也非常令人满意。
根据特定的方面，提供以荧光为基础的全新的拷贝增加型突变体筛选方法。这种以荧光为基础的方法大大优于建立在细菌抗生素抗性水平上的经典方法，当质粒的基础拷贝数已经很高时，比如使用突变pir116获得的拷贝数(例如每个细胞约400拷贝)，则不能使用所述的经典方法。根据本发明的以荧光为基础的筛选方法优选使用cobA基因作为拷贝数增多的红色荧光报告基因。来自脱氮假单胞菌(Pseudomonasdenitrificans)的cobA基因(Crouzet等，J.Bacteriol.1999，172：5968-79)编码uroIII甲基转移酶，该酶是维生素B12途径的酶，向urogen III分子添加两个甲基。Wildt等(Nature Biotechnology，vol.17，1999，pp1175)说明了cobA作为大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞荧光转录报告基因的用途。例如，这类荧光报告基因用于选择含有重组质粒的大肠杆菌菌株，由于编码uroIII甲基转移酶的cobA基因的过表达，这样的菌株蓄积荧光porhyrinoid化合物。当以UV光照射时，细胞发亮红色荧光(Biotechniques，1995，vol 19，no.7，p.760)。
申请人令人惊讶地发现携带cobA基因的质粒拷贝数与从粉红到红色的荧光水平之间的密切相关性。因此，根据本发明的以荧光为基础的拷贝增加型突变体筛选方法，可用于筛选多种可以在生产宿主细胞(例如大肠杆菌)基因组中评价的突变体，或者任何插入到生产宿主细胞基因组中、或在质粒中携带的基因突变体，如在pir基因中。
除了与质粒拷贝数的相关性，因为只需要将转化的宿主细胞接种和培养过夜，并暴露于紫外光下显示产生的荧光强度，从而直接推导宿主细胞中质粒的拷贝数，因此本发明的以荧光为基础的筛选方法易于并且可快速操作。
因此，本发明提供用于检测质粒拷贝增加型突变的方法，包括：
(a)将至少一个突变引入靶序列中；
(b)将突变的靶序列转化入含有质粒的宿主细胞，该质粒包括编码uroIII甲基转移酶的核苷酸序列，质粒拷贝数受所述靶序列影响；
(c)在所述核酸序列被表达的条件下培养宿主细胞，以产生宿主细胞培养物；
(d)将宿主细胞培养物暴露于紫外光下；
(e)检测由宿主细胞培养物产生的荧光。
根据本发明，该方法进一步包括将(e)中检测到的荧光与包括非突变靶序列的宿主细胞培养物产生的荧光进行比较。
uroIII甲基转移酶基因优选由来自脱氮假单胞菌的cobA基因编码。
突变可以存在于含有异源pir基因的质粒中，所述pir基因包括至少一个突变。在pir其他区域中，例如在拷贝数控制区和/或DNA结合域、和/或亮氨酸拉链基序、和/或pir基因的其它区域中，该质粒可以包括至少一个突变。在异源pir基因拷贝数控制区和亮氨酸拉链基序中，该质粒也可以包括至少一个突变。该质粒可以进一步包括pir基因DNA结合区中的突变。另外，该质粒可以在pir基因中编码拷贝控制区和/或DNA结合区、和/或亮氨酸拉链样基序、或蛋白质П其他区域的相同或不同区域中包含一个或多个突变。
在限制范围内，根据本发明的原核重组宿主细胞包括pir116突变和DNA结合区中的第二个突变，例如pir292、pir130、或pir117(图26)。
使用通用质粒(例如微环)，可以方便地产生这类突变的生产宿主菌株。微环技术特别在申请人的美国专利6,143,530和6,492,164、或在PCT申请WO 96/26270中得到说明。
微环是不含任何复制起点的重组DNA分子，因此为任何微生物基因组的基因置换提供了优秀的自杀载体。目的基因特别以两个序列为侧翼，这两个序列允许位点特异性重组，同向定位于微环中。同向定位说明这两个序列在重组DNA微环中具有相同的5′-3′极性。微环遗传构建体通常为缺乏复制起点的环形双链DNA分子，但是也可以为线性形式，并且含有一个或多个目的基因，目的基因以同向定位、允许位点特异性重组的两个序列为侧翼。根据本发明这个特定的实施方案，为了微生物基因组中基因置换的目的，微环可以用于转化任何感受态微生物(图31)。
用于基因置换的微环由母本质粒产生，母本质粒至少包括：
a)复制起点和选择标志基因，
b)同向定位、允许位点特异性重组的两个序列，
c)置于b)中所述序列之间的一个或多个目的基因。
存在于遗传构建体中的特定重组系统可以为不同来源。特别地，使用的特定序列和重组酶可以属于不同结构类型，特别是属于λ噬菌体整合酶家族或属于转座子Tn3解离酶家族。在属于λ噬菌体整合酶家族中，特别可以提及噬菌体λ(Landy等，Science 197：1147，1977)、P22和Φ80(Leong等，J.Biol.Chem.260：4468，1985)的整合酶、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)的HP1(Hauser等，J.Biol.Chem.267 6859，1992)、噬菌体P1的Cre整合酶、质粒pSAM2的整合酶(EP 350,341)或2μ质粒的FLP重组酶。
使用λ噬菌体整合酶家族的位点特异性系统，通过重组制备微环，根据本发明的DNA分子通常另外包括由于在相应噬菌体或质粒的两个att附着序列之间重组而产生的序列。
在属于转座子Tn3家族的重组酶中，特别可以提及转座子Tn3、或转座子Tn21和Tn522的解离酶(Stark等，Trends Genet，8，432-439，1992)；噬菌体mu的Gin转化酶，或质粒解离酶，例如RP4的par片段的解离酶(Albert等，Mol.Microbiol.12：131，1994)。当使用转座子Tn3家族的位点特异性系统通过重组制备微环时，除了计划插入到微生物基因组中的目的基因之外，微环通常还包括由于在所述转座子解离酶的两个识别序列之间重组而产生的序列。允许位点特异性重组的序列也可以从噬菌体P1的loxP区域衍生，该区域基本由两个重复序列组成，这两个重复序列能够在称为Cre的蛋白质的存在下彼此特异性重组(Sternberg等，J.Mol.Biol.150：467，1971)。用来产生微环的质粒因此包括(a)细菌复制起点和选择标志基因；(b)噬菌体P1的重复序列(loxP区域)；以及(c)置于(b)中所述序列之间的希望插入到微生物基因组中的一个或多个目的基因。
可能包括允许位点特异性重组的序列的微环来源于噬菌体，例如噬菌体的附着序列(attachment sequences)(attP和attB序列)，或来源于这些附着序列的序列。存在被称为整合酶的重组酶(具有或不具有切除酶)时，这些序列可以彼此特异性重组。术语“来源于这些附着序列的序列”包括通过对噬菌体附着序列进行修饰得到的序列，并且这些序列保留了在合适的重组酶存在下特异性重组的能力。因此，这类序列可以是这些序列缩短的片段，或者通过增加其他序列(限制位点等)而延长的片段。它们也可以是通过突变，特别是点突变获得的变体。根据本发明，术语噬菌体或质粒attP和attB序列表示对所述噬菌体或质粒特异的重组系统的序列，即存在于所述噬菌体或质粒的attP序列以及相应的染色体attB序列。附着序列系本领域所熟知，其中包括噬菌体λ、P22、Φ80、P1的附着序列，以及流感嗜血杆菌的HP1，或者质粒pSAM2或2μ质粒的附着序列。
微环易于从上述母本质粒中产生。产生微环的方法在于：将以母本质粒转化的细胞培养物与带有或不带有切除酶的整合酶接触，以诱导位点特异性重组。通过使用含有所述整合酶基因以及可行时切除酶基因的质粒或噬菌体进行转染或感染，将培养物与带有或不带有切除酶的整合酶接触。作为选择，例如，诱导存在于宿主细胞中、编码所述整合酶以及可行时切除酶的基因的表达。如下面所谈到的，这些基因可以以整合形式存在于宿主细胞基因组中，存在于复制质粒上、或在本发明质粒的非治疗部分。
为了通过体内位点特异性重组产生根据本发明的微环，在特定情况下将所用带有/不带有切除酶的整合酶引入细胞或培养基，或者在细胞或培养基中诱导。为此目的可以使用不同方法。根据第一个方法，使用含有例如重组酶基因(即，带有或不带有切除酶基因的整合酶基因)的宿主细胞，其中的重组酶基因是允许其受调节表达的形式。可以在例如启动子、或可诱导启动子系统、或温度敏感系统的控制之下引入带有或不带有切除酶基因的整合酶基因。
整合酶基因特别可以存在于温度敏感噬菌体中，在生长期间潜伏，在适宜温度被诱导(例如溶原性噬菌体λXis-cI857)。
作为选择，该基因可以处于受调节启动子的控制之下，例如placUV5启动子，该宿主细胞称为大肠杆菌G6191。
带有或不带有切除酶基因的整合酶可优选处于受调节启动子的控制之下，例如araBAD(阿拉伯糖)操纵子的PBAD启动子，该启动子受阿拉伯糖的调节(Guzman等，J.Bacteriol，1995，4121-4130；US5,028,530)。在阿拉伯糖作为诱导试剂存在下，使用PBAD启动子使切除酶和整合酶充分表达，从而允许以高拷贝数存在于细菌中的质粒90％以上的重组，而缺少阿拉伯糖时，该启动子被严格抑制。带有/不带有切除酶的整合酶的表达盒可以由质粒、噬菌体或甚至本发明质粒的非治疗区携带。该表达盒可以整合到宿主细胞基因组中或保持于复制形式。这类宿主细胞特别为大肠杆菌G6264和大肠杆菌G6289。根据另一个方法，基因表达盒由质粒或噬菌体携带，这些质粒和噬菌体用于在生长期后转染或感染细胞培养物。在此情况下，基因没有必要以使其受调节表达的形式存在。特别地，可以使用任何组成性启动子。在质粒制备中，通过直接与蛋白质孵育，DNA也可以在体外与整合酶以及可行时与切除酶接触。
这样产生的微环因此包括含有一个或多个将插入到靶微生物中的目的基因的表达盒，缺少复制起点，但包含由attB和attP序列之间位点特异性重组产生的序列attR，或由attB和attP序列之间位点特异性重组产生的序列attL。微环因此可以用作在任何微生物中基因置换的通用自杀载体。使用图31中描述的同源重组，携带以同源序列为侧翼的用于置换的基因以及抗生素抗性基因的微环，将轻松有效地整合到任何微生物基因组的靶位点中。由第二选择压力触发的第二个切除事件然后可以有效地选择仅携带新插入到其基因组内的基因的微生物。
本发明因此也涉及微生物基因工程方法。这种新方法可以用于设计任何微生物，不管其起源如何。微环不含任何复制起点，因此可以有效地通用于任何类型微生物的基因置换。通过在微生物中的双同源重组，该方法为使用噬菌体M13用于基因置换提出了有利的替换方案。
根据本发明的特定实施方案，微环包括允许选择第一重组事件的第一选择性标志，例如抗生素抗性基因。优选的第二选择性标志是基因III或功能性缺失的基因III′。如Boecke等说明，基因III或其功能性变体能够提供对脱氧胆酸的敏感性(Mol.Gen.Genet.，186，185-92，1982)，从而允许反选择第二重组事件(图31)。该方法因此在于：使用任何本领域熟知的转化方法(优选使用电穿孔)将微环引入微生物内，在添加抗生素的培养基中或在另一个选择压力下选择微环整合事件，以及通过使用脱氧胆酸处理或另一个适宜的选择压力选择第二切除事件。
本发明将借助随后的实施例得到更充分的说明，这些实施例应理解为非限制性说明。
附图简述：
图1：参与复制的R6K区域的功能组织。
图2：质粒R6K П蛋白质的功能域的组织。
图3：将pir基因引入大肠杆菌XAC1基因组的程序图。
图4：载体pXL2666、2730和2754构建方案。
图5：pXL2774的构建。
图6：2L发酵罐中的生长和生产动力学。
图7：800L发酵罐中的生长和生产动力学。
图8：pXL3056的构建。
图9：大肠杆菌XAC-1pir116(pXL3056+PT7pol23)经诱导后产生的aFGF蛋白质显像。变性的全细胞提取物置于12.5％-SDS聚丙烯酰胺凝胶上。M：分子量标志(Biorad，低分子量)。使用箭头和以道尔顿表示其分子量的数字鉴别各个条带。1：未诱导的XAC-1pir116(pXL3056+pUC4K)；2：于42℃诱导的XAC-1pir116(pXL3056+pUC4K)；3：未诱导的XAC-1pir116(pXL3056+PT7pol23)克隆1；4：于42℃诱导的XAC-1pir116(pXL3056+PT7pol23)克隆1；5：未诱导的XAC-1pir116(pXL3056+PT7pol23)克隆2；6：于42℃诱导的XAC-1pir116(pXL3056+PT7pol23)克隆2；t1：1μg纯化的aFGF；t4：4μg纯化的aFGF。
图10：载体pXL3029、pXL3030和pXL3179或NV1FGF图示。
图11：R6Kπ起始蛋白质功能域图示。
图12：包括pir116和pir116pir42突变的pir基因的核苷酸和氨基酸序列。
图13：用于同源重组的pir116pir42自杀载体构建体。
图14：扩增uidA∷pir116+/-pir42区域时获得的PCR产物图示。
图15：琼脂糖凝胶电泳，显示在TEX1或TEX1pir42中产生的pCOR质粒pXL3179的拓扑学。
图16：携带pir116cop21基因的pXL3749自杀质粒图示。
图17：琼脂糖凝胶电泳，显示大肠杆菌宿主细胞TEX1cop21(1-4道)、大肠杆菌宿主细胞XAC1pir(5-8道)、大肠杆菌TEX1(9-12道)中产生的pXL2979质粒拷贝数。
图18：recA-自杀载体构建体的克隆程序说明。
图19：扩增大肠杆菌TEX2菌株区域得到的PCR产物图示。
图20：琼脂糖凝胶电泳，显示在大肠杆菌TEX2pir42(B道)、大肠杆菌TEX1pir42(C道)、大肠杆菌TEX1(D道)中产生的pCOR pXL3179的拓扑学。
图21：在大肠杆菌TEX2pir42中发酵产生的质粒pXL3179的分析。
图22：以荧光为基础的检测，显示荧光随质粒拷贝数增加。
图23：在以荧光为基础的检测中筛选的质粒图示。
图24：质粒pXL3830图示。
图25：示范以荧光为基础筛选随机诱变产生的拷贝增加型突变体的琼脂板。
图26：使用以荧光为基础的筛选方法鉴定的拷贝增加型突变体的评价。
图27：插入细菌基因组中的pir116突变体的评价策略图示。
图28：不同pir116*突变体大肠杆菌菌株中pXL3179拷贝数的评价。
图29：用于产生在大肠杆菌内同源重组的微环载体的质粒构建体。
图30：用于产生pir116*突变体大肠杆菌菌株的微环载体的构建。
图31：使用微环载体通过同源重组进行基因置换。
图32：培养于含脱氧胆酸钠培养基的双重组克隆
图33A和B：双重组子对照PCR的结果。
I-材料与方法
A)材料
1)培养基
使用LB、2XTY和SOC完全培养基，以及M9基本培养基(Maniatis等，1989)。添加15克Difco琼脂获得琼脂培养基。另外，如果有必要，这些培养基可以分别以100mg/l和50mg/l的浓度添加抗生素(青霉素或卡那霉素)。以40mg/l浓度使用生色底物X-Gal和X-Gluc。
2)大肠杆菌菌株、质粒和噬菌体
分别在下面的实施例中对使用的大肠杆菌菌株、质粒和噬菌体进行鉴定。
B)方法
1)DNA操作
根据制造商对酶的使用的推荐，或者依照《Molecular Cloning：aLaboratory Manual》(Maniatis等，1989)中说明的程序，执行细菌DNA(质粒和基因组DNA)和噬菌体DNA(M13的复制型)的分离、限制性内切酶消化、DNA片段连接、琼脂糖凝胶电泳(在TBE缓冲液中)和其他标准技术。
电泳中使用的DNA长度标志如下：对于线性片段为1kb序列梯度(BRL)，以及对于未消化质粒为超螺旋DNA标志(Stratagene)。
根据适于自动化方法的Sanger技术(Sanger等，1977)，使用荧光双脱氧核苷酸和Taq DNA聚合酶(PRISM Ready ReactionDyeDideoxy Terminator Cycle Sequencing Kit，Applied Biosystems)进行测序。
通过氨基磷酸酯法，使用α-氰乙基保护基团(Sinha等，1984)，在“Applied Biosystems 394 DNA/RNA Synthesizer”上合成所用的寡脱氧核苷酸(以“seq+no”表示，见下)。合成后，以氨水处理以去除保护基团。以丁醇沉淀两次以对寡核苷酸纯化和浓缩(Sawadogo等，1991)。
用于PCR扩增的寡核苷酸：
SEQ ID No.3 5′-GACCAGTATTATTATCTTAATGAG-3′
SEQ ID No.4 5′-GTATTTAATGAAACCGTACCTCCC-3′
SEQ ID No.5 5′-CTCTTTTAATTGTCGATAAGCAAG-3′
SEQ ID No.6 5′-GCGACGTCACCGAGGCTGTAGCCG-3′
在下列条件下，以总体积100μl执行PCR反应(Saiki等，1985)。反应混合物包括150ng来自待研究菌株的基因组DNA、两种寡核苷酸引物(24聚体)各1μg、10×PCR缓冲液10μl(其组成如下：“500mMKCl，0.1％明胶，20mM MgCl2，100mM Tris-HCl pH7.5”)、以及2.5单位Taq DNA聚合酶(Amplitaq Perkin-Elmer)。Perkin-Elmer CetusDNA Thermal Cycler仪器的PCR条件如下：91℃2分钟，连续30个变性(91℃，1分钟)、杂交(42℃，2分钟)和延伸(72℃，3分钟)循环，最后于72℃5分钟。使用琼脂糖凝胶电泳分析由此获得的、使用或未使用限制酶消化的产物。
根据如下程序使用DNA拓扑异构酶执行多种质粒种类的分析：于37℃将实验室内纯化的酶孵育1小时。反应混合物(总体积：40μl)组成如下：150ng质粒，300ng DNA拓扑异构酶I或150ng大肠杆菌旋转酶，或160ng金黄色葡萄球菌(S.aureus)DNA拓扑异构酶IV和20μl每种酶特异的缓冲液。这些缓冲液的成分说明如下：
对于DNA拓扑异构酶I：
50mM Tris-HCl pH 7.7，40mM KCl，1mM DTT，100μg/ml BSA，3mM MgCl2，1mM EDTA；
对于DNA拓扑异构酶IV：
60mM Tris-HCl pH 7.7，6mM MgCl2，10mM DTT，100μg/ml BSA，1.5mM ATP，350mM谷氨酸钾；
对于DNA旋转酶：
50mM Tris-HCl pH 7.7，5mM MgCl2，1.5mM ATP，5mM DTT，100μg/ml BSA，20mM KCl.
2)大肠杆菌的转化
根据Chung和Miller(1988)说明的TSB(Transformation andStorage Buffer)方法按照常规执行大肠杆菌的转化。对于例如TG1(Gibson等人，1984)这样的菌株，获得的转化效率约为每μg pUC4K105-106个转化子(Vieira和Messing；1982)。需要更高的转化效率时，根据电穿孔仪制造商(Biorad)推荐的程序，使用电穿孔转化细菌。此方法可能达到每μg pUC4K形成108-1010个转化子。
3)由阳离子脂质转染剂(lipofectant)介导的细胞转染
使用的细胞为NIH 3T3小鼠成纤维细胞，前一天以每孔50,000个细胞的密度接种到24孔板内。使用的培养基为DMEM(Gibco)，含有葡萄糖4.5g/l、添加10％胎牛血清、1％的200mM谷氨酰胺溶液以及抗生素(5.103μ/ml链霉素，5.103μg/ml青霉素)(Gibco)。在体积对体积的基础上，将质粒DNA(1μg，于25μl 9‰NaCl中)与脂质转染剂混合。测试四种“脂质转染剂电荷/DNA电荷”比：0，3，6和9。鉴于1μg质粒DNA携带3.1nmol负电荷，脂质转染剂每分子含有3个正电荷，从而计算出这些比例。在允许形成DNA/脂质体复合物的10分钟接触时间之后，将50μl DNA-脂质体混合物引至无血清培养基(500μl)中的细胞上。使用相同的培养基将细胞预清洗两次，从而避免了血清对转染的抑制。孵育后(在CO2孵育器中，37℃，2小时)，向培养基添加10％胎牛血清。然后再将细胞孵育24小时。
4)真核细胞荧光素酶活性测量
转染24小时之后进行该测量。在ATP、Mg2+和O2存在下，荧光素酶催化荧光素氧化，伴随产生光子。使用光度计测量，发射光总量与样品的荧光素酶活性成正比。所用试剂由Promega提供(荧光素酶检测系统)，按照推荐程序使用。细胞裂解后，通过离心去除各提取物中的不溶级分。以5μl上清进行检测，这些上清可以或不可以用细胞裂解液稀释。
5)细胞提取物中蛋白质浓度的测量
根据BCA方法(Pierce)使用二辛可宁酸(bicinchoninic acid)(Wiechelman等人，1988)进行该测量。在裂解缓冲液(cf.III-B-4)中制备标准BSA范围。在体积对体积的基础上，使用0.1M碘乙酰胺/0.1M Tris缓冲液pH8.2，将待测样品和范围样品于37℃预处理1小时。该处理可以防止裂解液中存在的还原试剂(DTT)在检测中造成的干扰。于562nm读取检测结果。
实施例1：通过同源重组构建XAC-1 pir和pir116宿主菌株
所用菌株为大肠杆菌菌株XAC-1(Normanly等人，1980)。该菌株的argE基因有利的包括了谷胺酰胺-53(CAG)到琥珀密码子(TAG)的突变(Meinnel等人，1992)。argE基因属于argECBH分散操纵子(divergentoperon)，编码精氨酸生物合成酶N-乙酰鸟氨酸酶。因此XAC-1不能合成精氨酸，从而不能在基本培养基中生长。如果该菌株含有允许抑制型tRNA表达的质粒，这种营养缺陷型将被解除。因此可以通过在基本培养基中培养而选择携带这种质粒的细菌。为了允许从R6K得到的质粒的复制，需要通过同源重组将pir基因引入XAC-1基因组。通过野生型uidA基因与被pir(或pir116)基因中断的拷贝之间的交换，将pir基因(野生型或突变的)引入uidA基因座。uidA基因编码水解β-葡糖苷酸的β-葡糖醛酸酶。该基因毫无疑问可以被失活，因为在没有使用β-葡糖苷酸的标准合成培养基中，它并非生长所必需。另外，可以使用水解释放蓝色色素的生色底物X-Gluc监测β-葡糖醛酸酶活性。
1)构建携带“KmR-uidA∷pir(或pir116)盒的自杀载体
我们使用的策略涉及单细菌宿主以及对目的菌株基因组修饰的最小化。使用噬菌体M13mp10(Messing et Vieira；1982)作为自杀载体(Blum等，1989)。复制必需的基因II中的琥珀突变，将M13的宿主谱缩小为产生琥珀抑制型tRNA的菌株，例如TG1(supE)；因此，它不能在例如XAC-1的大肠杆菌sup+菌株中复制。
分别从M13wm34和33中纯化含有Tn5卡那霉素抗性基因和-uidA∷pir或pir116的3.8kb的BamHI盒(Metcalf等，1994)。将其克隆到以BamHI线性化的M13mp10中。将连接混合物电穿孔至TG1中之后，通过接种于添加卡那霉素的LB琼脂培养基上，筛选重组子克隆。通过限制图谱和对相应于pir116突变的区域的测序，说明所获克隆的一致性。
2)通过同源重组将pir或pir116基因引入大肠杆菌XAC-1基因组
采用的策略和涉及的多个事件展示于图3。
a)第一次重组事件
通过电穿孔使用每个RF(mp10-_uidA∷pir或pir116)各10,100或2000ng转化XAC-1菌株。将每个表达混合物的三分之一接种在含有卡那霉素的LB板上，于37℃孵育过夜。Mp10-_uidA∷pir或pir116噬菌体不能在菌株XAC-1(sup+)中复制。因此，只有通过与基因uidA野生型拷贝的同源重组整合到基因组中才能保持卡那霉素抗性(“KmR”)标志。XAC-1电穿孔结果展示于表1中。获得的转化效率为每μg pUC4K4.109个转化子。
表1
在测试条件下，整合子的数目随DNA量非线性增加。给定转化效率和RF大小(11.7kbp)，可能得到重组水平的近似估算。在100ng考虑时，获得的重组效率约为10-6。
b)第二次重组事件
使用菌株对脱氧胆酸的抗性(“DocR”)选择第二次重组事件。
为此目的，在添加0.2％脱氧胆酸钠的2XTY培养基中，每个构建体培养5个整合子。出现两个截然不同的群体。于37℃培养约8小时后，某些克隆出现相当明显的晕(cloudiness)(pir构建体的两个克隆，以及pir116构建体的三个克隆)。其他克隆于37℃仅一夜后即产生致密菌落。实际上它们都如预期的对卡那霉素敏感(“Kms”)。对于研究的每个电穿孔克隆，将50个Kms后代在添加X-Gluc的LB培养基上划线。于37℃48小时后，在此培养基上，UidA+克隆为浅蓝色，而经历等位基因置换(Case No.1，图3)的克隆保持白色(UidA-)。表2概括了获得的双重组子的表型分析。18％至30％的双重组子经历了等位基因置换。
表2
3)检验通过重组所获菌株的Pir+性质特征
为了确保通过双重组所获菌株的Pir+特性，我们使用pBW30(Metcalf等人，1994)转化每个构建体的3个克隆。所有测试菌株都获得转化子的事实，可能说明整合到XAC-1基因组中的pir和pir116基因的功能性。在相同条件下，使用母本菌株XAC-1没有获得转化子。我们继续研究了两个XAC-1pir克隆(B和C)以及两个XAC-1pir116克隆(E和D)。
4)使用PCR扩增，检验通过重组所获菌株
为了确认等位基因置换，我们使用PCR扩增检测uidA基因座两侧的基因组区。每对寡核苷酸由对应于pir内部区域的寡核苷酸和对应于接近染色体uidA的区域(但不在用于重组的片段之内)的第二个寡核苷酸组成。依靠Genbank的ECOUIDAA序列(目录号：M14641)确定后一寡核苷酸序列。我们因此可以核实pir基因在细菌基因组中的精确定位。通过MluI消化，确认其大小与预期相符的扩增片段的性质。
实施例2：构建来自R6X、携带选择标志sup Phe的质粒载体
构建含有来自R6K的oriγ和卡那霉素抗性基因的载体(pXL2666)。对菌株BW19610(pir116)5(Metcalf等人，1993)中pXL2666多聚体的观察，致使我们研究ColE1的cer片段对此现象的影响。我们于是将苯丙氨酸抑制型tRNA(sup Phe)表达盒引入载体oriγ-KmR-cer(pXL2730)中。该载体，即pXL2760，作为构建可用于基因治疗的载体的基础。
1)含有R6K oriγ和卡那霉素抗性基因的载体的构建和分析
a)构建体
构建的第一个质粒pXL2666中，卡那霉素抗性基因来自pUC4K(Vieira和Messing；1982)，417bp EcoRI-BamHI片段中含有的复制起点来自自杀载体pUT-T7pol(Herrero等，1990)(图4)。pXL2666向菌株BW19094和19610(Metcalf等人，1994)中的转移可能显示，当与pir菌株中的相同质粒比较时，在pir116菌株中的质粒数确实增加。然而，对未消化质粒的电泳分析显示，这种增加伴随着少数多聚体形式的出现。这种现象很有可能与质粒多个拷贝之间的分子间重组有关。因此，我们通过将天然大肠杆菌质粒ColE1中的cer片段克隆到pXL2666而构建pXL2730，其中所述cer片段显示使质粒双体顺式解离(Summers和Sherrat，1984)为pXL2666。所用片段对应于ColE1的382bpHpaII片段(Leung等，1985)。它含有特异性分子间重组位点；为了行使功能，它仅涉及包括重组酶XerC和XerD、以及辅助因子ArgR和PepA的宿主蛋白质(Stirling等人，1988，1989；Colloms等人，1990)。为了确保观察到的作用的确归因于cer片段，我们还构建了对照质粒pXL2754，其中cer片段具有165bp缺失。该缺失已被证实取消了cer对多聚体解离的作用(Leung等人，1985)。导致这些质粒构建的多个克隆步骤显示于图4。
b)质粒种类的定量和定性分析
(i)琼脂糖凝胶电泳
构建的不同质粒的电泳分析，允许证明根据所用菌株而可变的质粒种类。估计未消化质粒相对于超螺旋DNA标志的大小。在pir菌株(BW19094)中，质粒pXL2666、2754和2730几乎完全为单体形式。正如在DNA旋转酶对pXL2730作用之后所观察到的图谱所证实，每个主要条带上方的条带对应于多个较低超螺旋度的拓扑异构体。
在pir116菌株(BW19610)的情况下，图谱是不同的：使用质粒pXL2666和2754，观察到从单体到多聚体(2、3或4个单位)范围内变化的不同种类，主要形式是二聚体。使用EcoRI消化后，仅发现线性质粒DNA；这些质粒种类对应于质粒多聚体或多种拓扑异构体。然而，由于根据超螺旋DNA标志确定的形式的大小是单体质粒形式的所有产物，因此很有可能它们是多聚体。多聚体的形成最可能是pir116突变造成的，尽管两个菌株BW19094和BW19610并非是严格等基因的(BW19610为recA)。由pXL2730获得的图谱是不同的：尽管多聚体形式仍然可见，主要形式为单体形式。Cer片段因此可以不依赖于recA而帮助质粒多聚体的解离，该质粒是我们在BW19610中构建的。
(ii)DNA拓扑异构酶处理后的分析
为了反驳在pir116等位基因携带菌株中观察到的形式是特定异构体的理论，使每个质粒制剂都经过DNA拓扑异构酶作用。多种酶在实验条件下的活性如下：大肠杆菌拓扑异构酶I松弛DNA、大肠杆菌DNA旋转酶负超螺旋化松弛的DNA、以及金黄色葡萄球菌DNA拓扑异构酶IV解开交结的DNA和松弛超螺旋DNA。DNA拓扑异构酶IV的作用可能说明高分子量质粒形式并非由于几个质粒分子交结导致；在此情况下，它们将被转化为单体种类。当然，该酶的功能已在动基体DNA制剂(由交结的DNA分子组成)上得到检查(未显示)。因为获得的种类比未处理的对照移动较少，因此也观察到了松弛活性。DNA旋转酶的作用可能将稍为松弛的拓扑异构体转化为从细菌中提取的更为超螺旋的种类(主要为单体和双体)。另外，也可能证实制备的DNA主要为超螺旋形式。这样处理的样品使上面关于各种构建体的主要种类的结果得到确认。DNA拓扑异构酶I确实松弛DNA，但是仅仅是部分地松弛。这一点可以归结于所研究的质粒仅含有少量单链区域，这些区域是该酶优先结合之处(Roca，1995)。
2)选择标志sup Phe引入pXL2730
我们使用合成的抑制型tRNA基因(Phe)表达盒(Kleina等人，1990)。响应于TAG密码子，这将苯丙氨酸引入到增长的多肽链中。另外，这使ArgE蛋白质在XAC-1中生产，ArgE蛋白质足够活跃以允许在精氨酸缺陷培养基中的良好生长。sup Phe在质粒pCT-2-F上于合成启动子控制下组成性表达(Normanly等人，1986)，该合成启动子来自大肠杆菌lpp基因的Plpp启动子序列。该基因下游，转录被合成的大肠杆菌操纵子rrnC的终止子TrrnC终止(Normanly等人，1986)。在图5中说明了多个克隆步骤。
在XAC-1中进行了多个亚克隆。通过该菌株的α-半乳糖苷酶活性检查抑制型tRNA表达盒的功能，该酶活性仅在基因lacZu118am琥珀密码子抑制时存在。最后步骤由将sup Phe表达盒引入pXL2730中组成。使用cer片段(B-1-b)获得的结果导致我们选择该质粒而不是pXL2666。我们保留了卡那霉素抗性以便于亚克隆，尤其是为了在最后克隆期间拥有可利用的额外的筛选(KmR损失)。
实施例3：通过转染鼠成纤维细胞确认质粒可应用于基因治疗
1)报告载体pXL2774的构建
为了检验该系统为基因治疗产生质粒DNA的有效性，我们将可以用于真核细胞的报告基因引入pXL2760中。我们使用编码Photinuspyralis荧光素酶的基因luc，因为生物发光测量实验非常敏感，在大范围内为线性，而且，因真核细胞的内源性活性造成的背景噪声非常低。使用允许高水平表达的人类巨细胞病毒早期基因(CMV启动子)的启动子-增强子序列控制Luc基因。在luc 3′末端有一个来源于病毒SV40的非翻译区，含有聚腺苷酸化信号(poly(A)+)。进行增加可利用的限制位点数目的中间克隆(intermediate cloning)之后，将“CMV启动子-luc-poly(A)+”盒引入到最小载体(minimal vector)oriγ-cer-sup Phe(pXL2760)中，取代KmR标志。产生的质粒被命名为pXL2774。图6显示了多个克隆步骤。使用电穿孔将连接混合物转化到XAC-1pir116中。在丰富培养基(SOC培养基)中孵育使细菌表达选择标志；因此有必要在接种之前以M9培养基将细胞清洗两次。这可以去除将会在基本培养基上导致培养高背景噪音的残留培养基。
被选择接种电穿孔细胞的培养基是M9基本培养基，该培养基可以选择表达抑制型tRNA的细菌，从而选择我们质粒的出现。添加X-Gal使得可以通过蓝色染色显示抑制型tRNA的表达。于37℃约20小时之后分析培养皿。在无DNA的对照上不出现菌落，确保我们的选择是正确的，即使是以高密度接种。使用限制(8)检查的所有克隆确实携带质粒，与预期的图谱吻合。使用涉及离子交换步骤(Promega试剂盒，MegaPreps)的技术，从一升液体M9培养基中培养(于37℃约18小时)的克隆制备如此构建的质粒，即pXL2774。收集的DNA量约为2mg。
2)报告载体pXL2774转染哺乳动物细胞的分析。
通过转染NIH 3T3小鼠成纤维细胞，评价pXL2774转染真核细胞并表达荧光素酶的能力。选作参照的载体为质粒pXL2622(以CMV启动子取代SV40启动子的来自Promega的质粒pGL2)，它携带与pXL2774相同的荧光素酶表达盒，但是位于不同的复制子上。它是携带氨苄青霉素抗性基因的6.2kb的ColE1衍生物。该质粒作为对照。荧光素酶活性(表示为RLU，或相对发光单位)显示于表3。
当“脂质转染剂电荷/DNA电荷”比为6时获得最好结果；在这些条件下，pXL2622和2774表现相当。
表3
实施例4：确认大肠杆菌中pCOR质粒的自杀载体性质
使用质粒pUC4K(ori ColEI-KmR，(Vieira和Messing，1982))和pXL2730(来自R6K-KmR的oriγ，见实施例2)进行电穿孔实验，在JM109大肠杆菌(Yanisch-Perron等人，1985)中证实了得自R6K的pCOR型质粒的非复制性。使用的电穿孔仪为Biorad Gene Pulser，制备并且根据制造商的程序(Bacterial electro-transformation andpulse controller instruction manual.catalog number 165-2098)使用电感受态细胞。
将电转化的细胞接种于添加卡那霉素(50mg/l)的LB培养基上，于37℃孵育过夜。所获结果如下。
结果
这些结果显示，ColEI衍生物(pUC4K)和R6K衍生物(pXL2730)在不表达pir基因的菌株中转化效率之间具有最小为5logs的差异。在pir+菌株例如XAC-1pir116中，R6K来源的质粒的电转化效率保守地达到或超过108转化子/微克质粒。
实施例5：通过高密度培养大肠杆菌XAC-1pir116(pXL2774)生产质粒DNA：发酵方法
5.1.菌株：
最小质粒(minimal plasmid)pXL2774在XAC-1pir116大肠杆菌
(实施例1)中的生产；该质粒包括下列元件：oriR6K-cer-tRNAamsupPhe，以及在CMV启动子控制下的luc报告基因表达盒(实施例3)。发展了生产这种类型质粒的高生产力方法。
5.2.培养基及条件：
a)生长培养基：
用于接种体培养的确定成分培养基成分(g/l)：Na2HPO46，KH2PO43，NaCl 0.5，NH4Cl 1，NH4H2PO43，葡萄糖5，MgSO4·7H2O 0.24，CaCl2·2H2O0.015，盐酸硫胺0.010
用于补料分批培养的复合培养基成分(g/l)：KH2PO48，K2HPO46.3，Na2HPO41.7，(NH4)2SO4 0.74，NH4Cl 0.12，酵母提取物3，葡萄糖2，MgSO4·7H2O 2.4g/l，CaCl2·2H2O 0.015，硫胺0.010，盐溶液(Fe、Mn、Co、Zn、Mo、Cu、B、Al)。
用于补料分批培养的确定培养物的成分与复合培养基一致，但是以2.5g/l NH4Cl取代酵母提取物。
b)补料分批培养条件：
在含有1升培养基的2升发酵罐(Setric France)中进行研究以确定培养和产生质粒DNA的最佳条件。使用到达生长稳定期起始阶段的接种培养物80ml接种发酵罐。
发酵期间，使用10％(w/v)氨水将pH自动控制并调节在6.9至7.0之间；温度保持在37℃；通风设定为在0.2bar压力下75l/h(1.1vvm)，通过搅动速度上的反作用调节溶解氧为空气饱和度的40％，必要时可以使用纯氧气。
通过连接到Hewlett-Packard 9000的HP3852界面，依次收集并计算所有参数(pH、温度、搅动、OD、排出气中的O2和CO2)。
补加培养基的基本成分如下：50％碳源，0.7％硫酸镁，0.02％硫胺；对于复合培养基，添加酵母提取物，优选达到浓度为5％至10％之间。
为了使培养条件适合于800升发酵罐，在实验室规模执行由两个连续的接种体培养组成的生产顺序。：接种体I在摇动的锥形瓶中，接种体II在2升发酵罐中(分批培养)，随后在7升发酵罐中补料分批生产培养。
5.3.结果
在复合培养基、确定成分培养基中，以多种生长速率，对多种培养条件进行研究。在所有情况下，在细菌菌株初始批培养及碳源消耗之后，使用蠕动泵以预先设计的添加程序，将补充培养基添加到发酵罐中。所述添加程序是从以前的实验推导而来，在这些实验中，添加速度由溶解氧水平或恒定生长速率控制。
另外，为了没有困难地将2升发酵罐条件外推到800升发酵罐，而不伴有培养基的过度氧化，将培养末最大氧需求设定为2.5-3mM/min。为此，如果有必要，通过改变补充装料的补充速率来降低微生物的生长速率。
如表4所见，在实验室规模和800升发酵罐规模，在复合培养基和确定成分培养基中都得到良好结果；另外，质粒DNA生长和生产动力学完全可比(cf.图6及7)。
表4
X＝生物量(细胞干重)
全部结果显示：
-可以毫无困难地执行将发酵规模从2升改变为800升，
-消耗的氧气与产生的生物量强烈相关(1.08g O2/g产生的生物量)
-没有选择压力时质粒至少稳定50代，
-可以在复合培养基中获得高生物量，即每升多于40g干细胞
-质粒DNA产量达到每升培养基100mg超螺旋DNA，
-DNA产量和生物量之间具有良好的相关性：不考虑发酵持续时间，产量可以估计为1mg质粒DNA/OD单位，或者2.7mg质粒DNA/g生物量，
-确定成分培养基的使用也可能达到高生物量(每升30g干细胞)和高质粒DNA产量(100mg/l)，没有任何生产力损失。
实施例6：pXL2774至哺乳动物细胞的体外或体内转移
6.1.pXL2774至哺乳动物细胞的体外转移
在人类来源或鼠类来源的细胞上，体外测试最小质粒pXL2774转染多种细胞系的能力。使用pXL2784质粒作为对照。它含有与pXL2774相同的真核表达盒(CMV启动子-荧光素酶-polyA)，但是其为6.4kb的ColE1衍生物，包括在大肠杆菌中赋予卡那霉素抗性的基因。
测试的细胞如下：
转染条件如下：
D-1：以每2cm2孔(24孔板)100,000个细胞的密度接种于添加10％胎牛血清(FCS)的DMEM培养基(Dulbecco′s modified Eagle Medium)中。
D-3：在250μl添加或不添加10％FCS的培养基中，使用10μl转染溶液转染细胞，转染溶液含有：0.5μg DNA，150mM NaCl，5％葡萄糖和每μg DNA 3nmol RPR120 535脂质转染剂。孵育2小时后，使用500μl添加10％FCS的DMEM培养基取代该培养基。
D-4：更新培养基
D-5：以PBS清洗细胞，随后使用100μl Promega裂解缓冲液(Promega Cell Lysis Buffer E153 A)裂解。在Lumat LB 9501光度计(Berthold)中，以10秒的整合期，对10μl裂解液进行荧光素酶活性检测。使用的反应物来自Promega(Promega Luciferase AssaySubstrate)。在下表5-8中比较的结果，以10μl裂解液的RLU(RelativeLights Units，相对光照单位)表示(对4个孔测量的平均值)。并给出变异系数(CV)。
在无血清存在下的转染结果展示如下。
细胞型
在血清存在下(10％)的转染结果展示如下：
细胞类型
细胞类型
这些结果揭示了pXL2774体外有效转染鼠类和人类来源的多种细胞类型的能力。Luc报告基因的表达可以显示，其转染效率至少与来自ColE1、携带相同荧光素酶表达盒的“标准”质粒一样好。
6.2.pXL2774至动物(小鼠)的体内转移
a)模型1：小鼠前胫骨肌肉(cranial tibial muscle)中的裸DNA
将溶解于“5％葡萄糖、150mM NaCl”中的裸露质粒DNA注射到OF1小鼠前胫骨肌肉中。注射7天后去除该肌肉，切碎，在750μl裂解缓冲液(Promega Cell Lysis Buffer E153A)中匀浆，然后以20,000×g离心10分钟。
10μl上清在添加50μl试剂(Promega Luciferase AssaySubstrate)之后，进行荧光素酶活性检测。在Lumat LB9501光度计(Berthold)上，以10秒整合期进行读取。
结果展示于下表中。
这些结果显示，条件性复制质粒例如pXL2774确实能够在体内转染小鼠肌肉，并且能够以等同于或者甚至高出“标准”质粒的功效进行转染，所述“标准”质粒来自ColE1，携带相同的荧光素酶基因表达盒。
b)模型2：3T3 HER2肿瘤模型
该模型如下：
-成年雌性瑞士/裸鼠
-皮下注射107 3T3 HER2细胞至侧腹后诱导实验性肿瘤。
-注射细胞7天后注射转染混合物。
注射溶液：DNA首先溶解于缓冲液中。添加所有产物后，混合物含有DNA、NaCl(150mM)和5％右旋葡萄糖，溶于水或5mM HEPES缓冲液中。
-注射2天后，去除肿瘤组织，称重，然后切碎并在750μl裂解缓冲液(Promega Cell Lysis Buffer E153A)中匀浆。离心后(20,000×g，10分钟)，去除上清并评价荧光素酶活性。与50μl试剂(PromegaLuciferase Assay Substrate)混合后，在Lumat LB9501光度计(Berthold)上，以10秒整合期测量所获的全部发射光，来确定该活性。
产生的活性以在整个肿瘤裂解上清液中估计的RLU(相对光照单位)表示。
结果
这些结果显示，条件性复制质粒例如pXL2774，确实能够体内转染小鼠肿瘤细胞，并且能够以至少能与“标准”质粒相比的功效进行转染，所述“标准”质粒来自ColE1，携带相同的荧光素酶基因表达盒。
这些实验证明，条件性复制质粒，尤其是pXL2774，确实具有动物细胞转染特性，这是用于基因治疗所必需的。更精确地，显示了下列：
1)pXL2774体外有效转染人类或鼠类来源的多种细胞类型的能力；
2)pXL2774体内转染小鼠肌肉的能力；
3)pXL2774体内转染移植入小鼠的肿瘤细胞的能力。
电转化、发酵和转染实验因此可能证实条件性复制质粒可作为用于基因治疗的载体，通过显示下列：
i)它们在不表达pir基因(条件性复制起点)的大肠杆菌菌株中没有可检测的复制；
ii)能够在不含抗生素的确定成分培养基中，以与工业生产一致的规模产生该质粒；
iii)这些质粒可以在体外以及尤其是体内转染哺乳动物细胞。
实施例7：重组蛋白质的体外生产
7.1.表达载体的构建
为了显示这种方法的可行性，我们根据上述标准(实施例2和3)构建表达载体。该载体pXL3056含有：
1)包括条件性复制起点(oriγ)的细菌部分，ColE1 cer片段以及保证细菌内选择的基因(sup)
2)以Studier(Studier等，1990)描述之系统为基础的表达盒，包括噬菌体T7基因10的启动子、lac0操纵子、aFGF154编码基因(酸性成纤维细胞生长因子，含有154个氨基酸的形式)(Jaye等，1986)、以及噬菌体T7终止子。该表达盒与申请WO 96/08572中说明的存在于pXL2434质粒上的表达盒一致。
pXL3056构建体展示于图8中。将含有aFGF表达盒的pXL2434的EcoRI-BglII片段(1.1kb)在BglII和EcoRI位点克隆到pXL2979条件性复制载体中(1.1kb纯化片段)，产生pXL3056。pXL2979由3个片段的连接产生：i)pXL2730的AccI-XbaI片段(提供oriγ和cer的0.8kb片段)，ii)pXL2755的NarI-SaII片段(提供sup Phe基因的0.18kb片段)，iii)pXL2660的SalI-SpeI片段(提供卡那霉素抗性基因的1.5kb片段)。pXL2660由pUC4K的1.2kb PstI片段(Vieira和Messing，1982)克隆到pMTL22(Chambers等，1988)中产生，其中pMTL22以PstI线性化。
7.2.表达菌株的生产
通过转化将质粒pXL3056引入XAC-1pir116菌株。然后在30℃以质粒PT7pol23(Mertens等，1995)转化产生的菌株。为了在T7启动子的控制下表达目的基因，细菌必须在其基因组中、质粒或噬菌体上含有允许噬菌体T7 RNA聚合酶表达的盒。在实施例中，我们使用质粒pT7pol23，该质粒与R6K衍生物例如pXL3056兼容，并且允许噬菌体T7 RNA聚合酶的温度诱导型表达。然而，也可以设想λDE3将XAC-1pir116菌株溶原化(lysogenize)(Studier等，1990)来仅保存一种质粒，并使用IPTG而非温度诱导T7RAN聚合酶的产生。
7.3.aFGF的表达
在添加0.2％酪蛋白氨基酸(DIFCO)和卡那霉素(25μg/ml)的M9基本培养基中，于30℃培养XAC-1pir116菌株(pxL3056+PT7pol23)至600nm光密度为0.6-1.0。将培养物的一半置于42℃(诱导T7RNA聚合酶)，另一半保持于30℃(阴性对照)。使用XAC-1pir116(pXL3056+pUC4K)菌株进行相同实验，该菌株作为缺少T7RNA聚合酶时aFGF表达的对照。
得到的结果展示于图9中。这些结果显示，aFGF的生产相当于或优于使用BL21(DE3)(pXL2434)(WO 96/08572)所观察到的，清楚地说明条件性复制质粒用于体外、尤其是在大肠杆菌中表达重组蛋白质的潜力。
实施例8：构建表达野生型或杂合p53蛋白质或人类FGF1蛋白质的pCOR载体
本实施例描述了含有编码p53蛋白质的核酸的本发明的条件性复制载体的构建。该载体可以用于在缺陷(突变的、删除的)细胞中(例如，特别是肿瘤细胞)恢复p53型活性。
真核表达盒含有下列元件：
1)CMV“立即早期”启动子(-522至+72位)，随后为I型单纯疱疹病毒腺苷酸激酶基因的前导序列(基因的-60至+1位，参见论文McKnight，S.fL.(1980)Nucleic Acids Res.8：5949-5964中的序列)
2a)编码野生型p53蛋白质或p53变体的核酸，如申请PCT/FR96/01111中所述(V325K变体＝带有具有ATG的Kozak序列的V325)；
2b)编码人类FGFa或FGF-1的核酸，如Jaye M.Sciences 1986；233(4763)：451，US patent No：4,686,113以及European Patent No：259 475中所说明；
2c)编码人类成纤维细胞干扰素分泌信号(Taniguchi等)与人类FGF-1从氨基酸21至154位的天然截短形式之间的融合基因，如Jaye等和US 5,849,538所说明。
3)SV40的polyA聚腺苷酸化序列。
这些元件以片段AscI-XbaI的形式置于pCOR载体pXL2988上的BssHII和SpeI位点之间。除了存在能够形成DNA三螺旋的序列之外，pXL2988与pXL2979(实施例7.1.)一致，这个能形成DNA三螺旋的序列由17个拷贝的三核苷酸GAA组成，置于γ复制起点旁。
产生的质粒命名为pXL3029、pXL3030、pXL3179或NV1FGF(图10)。
通过测量p53或p53superWT的转录激活物活性，或通过使用本领域熟知的例如ELISA实验测量FGF1分泌，在培养物中的p53-SAOS2细胞上验证这些构建体的功能。
实施例9：TEX1(XAC1 pir116，endA-，traD-)的构建
大肠杆菌XAC-1pir116含有F′游离基因，F’游离基因是约100kb、携带proB+lacI373lacZu118am的环形DNA分子。许多雄性大肠杆菌实验室菌株在其游离基因上携带traD36突变，但是对于XAC-1尚未发现有影响F’转移能力的突变。基因traD在tra(转移)操纵子之一的5′末端，编码直接涉及DNA转移和DNA代谢的膜蛋白(Frost等，BBRC，1994，58：162-210)。通过在XAC-1pir116endA-内的同源重组，以来自pHP45Ω(Prentki和Krisch，1984，Gene，29：303-313)的2kbΩ元件(Genbank目录号M60473)置换来自TraD、包括该基因92％的2kb中央片段。Ω元件含有aadA抗生素抗性基因，以短的反向重复序列为侧翼。基因aadA编码氨基糖苷-3腺嘌呤转移酶，赋予链霉素和壮观霉素抗性(“SpR”)。使用Ω元件，因其过早终止了RNA和蛋白质的合成，导致整个traD操纵子失活。将所述新的pCOR菌株XAC-1pir116endA-traD∷SpR指定为TEX1。当供体为TEX1时，任何驻留质粒(residentplasmids)，无论pCOR或pUC，其转移都是不可检测的。
在发酵实验中评定新pCOR宿主菌株TEX1。使用含有酵母提取物的复合培养基用于XAC-1pir116的补料分批发酵。pCOR的稳定性(多于50代)造成可以使用非选择性培养基。在这些条件下，XAC-1pir116产生高于40g/l的细胞干重，并从2升发酵罐获得100mg/l pCOR pXL2774。pCOR拷贝数估计为每个细胞400-500拷贝，质粒DNA合成速率在发酵过程中恒定。将这些结果外推到适于制造行业的800升发酵罐。发酵也在缺乏酵母提取物或任何动物来源的原材料的情况下进行。在2升培养物中使用确定成分培养基，得到相似结果(30g/l细胞干重以及100mg/l质粒DNA)，同时没有生产力损失。
实施例10：通过同源重组构建XAC-1pir116pir42宿主菌株
1)构建携带“KmR-uidA：pir116：pir42”盒的自杀载体
通过使用PCR的定点诱变(QuickChange定点诱变试剂盒，Stratagene，La Jolla，CA)，修饰实施例1中所述来自M12wm33的KmR-uidA∷pir116盒，从而将pir42突变引入pir116基因。在图13中说明了不同的克隆/诱变步骤。
用于诱变的寡核苷酸含有pir42突变及产生ClaI位点的沉默突变，当需要时轻松地通过限制分析显示pir42的处理。
使用的有义和反义寡核苷酸如下：
有义寡核苷酸编号11076(SEQ ID NO：7)
5’-G TAT ATG GCG CTT GCT CTC ATC GAT AGC AAA GAA CC-3’
pir42 ClaI
反义寡核苷酸编号11077(SEQ ID NO：8)
5’-GG TTC TTT GCT ATC GAT GAG AGC AAG CGC CAT ATA C-3’
ClaI pir42
用于在大肠杆菌pCOR宿主TEX1基因组中以pir116pir42置换pir116的技术建立在Blum等人的技术之上(J.Bacteriol.1989，171，pp 538-46)。显示于图13中的重组噬菌体pXL3723因为在编码M13切口酶的基因II中具有防止病毒基因组复制的无义突变，所以在所有非抑制(non-suppressor)大肠杆菌菌株中，它是自杀载体。
如所述进行双重组以构建XAC-1pir116(实施例1，第二点)。通过PCR筛选经过双同源重组事件的克隆，以检测TEX1基因组中pir42突变的存在。使用从双重组候选克隆中分离的基因组DNA作为PCR模板。其次，对每个独特的扩增片段进行测序，所有这些片段具有预期大小。PCR片段显示于图14中。
PCR引物如下：
引物11088(SEQ ID NO：9)：5’-GAGATCGCTGATGGTATCGG-3’
引物11089(SEQ ID NO：10)：5’-TCTACACCACGCCGAACACC-3’
该分析显示，检测的六个双重组子中有一个经历了等位基因交换。与母本菌株TEX1相比，这个命名为TEX1pir42的新菌株复制pCOR质粒的能力得到进一步评价。
2)TEX1pir42的评价
将pCOR质粒平行转化至TEX1和TEX1pir42中，在2ml选择性M9培养基中生长过夜。然后，使用Wizard SV plus minipreps kit(Promega)提取质粒DNA，在两个菌株中评价pCOR质粒的相对质粒拷贝数和拓扑学。
在使用pCOR质粒pXL3516(2.56kb)转化的TEX1pir42中，可重复地得到拷贝数的2倍增加。为了进一步说明TEX1pir42的特征，在质粒DNA的小量纯化(4至6个克隆/菌株)之后，使用琼脂糖凝胶电泳评价例如pXL3179和pXL2774这类pCOR质粒的拷贝数和拓扑学。评价经EcoRI限制酶线性化的质粒的拷贝数。在缺少溴化乙锭的情况下对未消化质粒进行拓扑学检测。产生的琼脂糖凝胶显示于图15，清楚的说明质粒pXL3179在TEX1pir42中产生时，比在TEX1菌株中产生时获得更高的拷贝数。图15也显示质粒pXL3179的拓扑学，也显示质粒拷贝数的增加，其中质粒基本上为单体形式，少数质粒为多聚体形式。从这些pCOR质粒获得的结果也概括于表5中。计算与TEX1中相同质粒比较的相对拷贝数。观察到在TEX1pir42中产生的质粒pXL3179和2774质粒拷贝数增加2-3倍。
表5：TEX1pir42中产生的pCOR质粒的复制和拷贝数
*拷贝数与TEX1中的相同质粒进行比较。
实施例11：比较实验：TEX1cop21(XAC-1endA-traD-pir116cop21)的构建
1)TEX1cop21的构建
TEX1cop21菌株的构建与实施例10中对TEX1pir42的说明类似。
通过定向诱变、用于将cop21引入pir116基因的寡核苷酸如下：
有义寡核苷酸：11153(SEQ ID NO：11)
5‘-CG CAA TTG TTA ACG TCC AGC TTA CGC TTA AGT AGC C-3’
cop21
反义寡核苷酸：11154(SEQ ID NO：12)
5’-G GCT ACT TAA GCG TAA GCT GGA CGT TAA CAA TTG CG-3’
将cop21突变作为TCC丝氨酸密码子引入，取代TCA丝氨酸密码子，以消除接近突变的HindIII限制位点。
用于定向诱变的模板为pXL3395(见图13)。采用与图13显示的用于pir42相似的方法，使用产生的命名为pXL3432的质粒构建自杀M13载体。自杀载体pXL3749显示于图16中。
通过PCR、随后以HindIII限制酶切以及测序监测cop21和pir116突变，筛选与pXL3749同源重组后获得的大肠杆菌克隆。测试的六个双重组子中有一个经过了基因置换。产生的菌株命名为TEX1cop21
2)TEX1cop21的评价
使用包括2.5kb KmR pCOR载体pXL2979(见实施例7.1)的多种pCOR质粒转化TEX1cop21，并通过凝胶电泳检验增加的拷贝数。这种使用pXL2979的实验显示于图17中。使用Promega miniprep kit制备来自每个菌株的四个独立克隆的质粒DNA，以EcoRI将质粒DNA线性化，并在琼脂糖凝胶上电泳，然后使用溴化乙锭染色。每个样品代表相似量的细菌，由600nm光密度测量。对大肠杆菌TEX1cop21、XAC1pir和TEX1中产生的pCOR质粒pXL2979得到的琼脂糖凝胶电泳显示于图17中。与TEX1相比，当质粒在TEX1cop21中产生时，质粒拷贝数明确显示没有增加。
实施例12：TEX2pir42(XAC-1pir116 pir42 recA-)的构建
首先，构建TEX1的recA-衍生物。然后将pir42突变引入到得到的命名为TEX2的菌株中以产生TEX2pit42。
1)TEX1的recA-衍生物即大肠杆菌TEX2的构建
通过PCR获得缺失的、在其5’末端含有三个翻译终止密码子(每个读码框中一个)的recA基因。通过基因置换(Blum等人，J．Bacteriol.，1989，171，pp.538-46)将所述缺失的recA基因引入TEX1基因组中。用于同源重组的自杀载体的构建显示于图18中。用于扩增recA片段的PCR引物显示于表6：
表6
添加到recA序列的限制位点加以下划线。
为了保持发生同源重组所必需的RecA+表型，使用含有异源recA基因(例如放射土壤杆菌(Agrobacferium radiobacter)的recA基因)和抗生素抗性基因的质粒，为大肠杆菌TEX1提供recA功能，所述异源recA基因能够补足大肠杆菌recA突变体，抗生素抗性基因例如为氨苄青霉素抗性基因。基因置换后，通过在非选择性培养基(LB)中的培养稀释，从重组菌株中消除该质粒。以抗生素抗性的丢失筛选质粒的缺失。
产生的菌株命名为TEX2。在图19中通过PCR监测基因置换。在下面的表7中对PCR引物进行说明。
表7
第一个引物以recA基因序列为基础。第二个以接近但处于自杀载体pXL3457中的同源区之外(紧接recA的5’或3’)的序列为基础，以保证扩增仅仅发生在基因组片段上。根据大肠杆菌序列选择两个寡核苷酸的序列，该所述大肠杆菌序列包括recA基因座(GenbankECAE000354)。
从recA缺失菌株获得的PCR片段与从野生型菌株获得的相比更短，如下面表8中所示。
表8：用于recA扩增的PCR引物
获得的PCR图谱与预期相同，证实了TEX2基因组中存在截短的recA基因。核实recA-表型(对紫外线敏感)和TEX2的表型特征。如预期的，TEX2的表型特征与TEX1菌株相同，即，ara-、RifR、NalR、SpR、UidA-、Arg-、KmsAmps)。
B)大肠杆菌TEX2pir42的构建
根据实施例10中说明的策略，通过双同源重组构建TEX2pir42菌株，与实施例10不同的是：TEX2中的同源重组在携带异源recA基因的质粒存在下进行，所述异源recA基因能够补足大肠杆菌recA突变体，以保持同源重组所需的recA+表型。
通过Cla消化的PCR产物的限制分析监测基因置换(见图14)。四个研究的双重组子克隆中的两个发生了基因置换。
C)大肠杆菌TEX2pir42的评价
1)实验室规模质粒生产的评价：
使用pCOR质粒pXL3179(2.4kb)转化TEX2pir42。在实验室规模，在质粒拷贝数增加的重复性、培养条件和稳定性(代数)方面，对pXL3179在TEX2pir42中的生产集中研究。研究一致显示，与pXL3179在TEX1中的生产比较，在相同条件下质粒拷贝数增加2-5倍。进一步评定pXL3179在TEX2pir42中生产的质粒拷贝数，用TEX1pir42和TEX1生产质粒拷贝数作为比较实验。在该实验中，从以600nm OD值为基础的相同的细菌量中提取质粒，并使用琼脂糖凝胶电泳分析。电泳后使用溴化乙锭对凝胶进行染色。显示于图20中的琼脂糖凝胶电泳清楚显示，质粒在TEX2pir42中以高拷贝产生，并且有利的显示，在TEX2pir42中而非TEX1pir42中产生时，质粒多聚体减少。
2)发酵罐评价
在7升大规模发酵罐中证实了这些结果，说明如下。
a)发酵培养基成分
用于接种体培养物的培养基成分为：Na2HPO46g/l，KH2PO43g/l，NaCl 0.5g/l，NH4Cl 1g/l，NH4H2PO43g/l，葡萄糖5g/l，MgSO4·7H2O0.24g/l，CaCl2·2H2O 0.015g/l，盐酸硫胺0.010g/l。
用于补料分批培养的培养基成分如下：KH2PO48g/l，K2HPO46.3g/l，Na2HPO41.7g/l，NH4Cl 2.5g/l，葡萄糖10g/l，MgSO4·7H2O 2.6g/l，硫胺0.011 g/l，Biospumex36防泡剂0.1ml/l，盐混合物(见表9)2.5ml/l。
表9：盐混合组成
补加培养基成分如下：50％葡萄糖，0.7％镁，0.02％盐酸硫胺，1％Biospumex36防泡剂。
b)发酵参数
以1.2％接种培养物接种含有3升补料分批培养基的7升发酵罐。接种体制备如下：使用0.25ml大肠杆菌菌株TEX2pir42(pXL3179)的冰冻细胞悬液接种在两升瓶中的250ml接种体培养基中。
于37℃、以220rpm将瓶孵育24小时。24小时后，测量不同参数：残留葡萄糖：0g/l，OD600nm为2.7，pH 6.24。发酵过程中，使用NH3自动控制并调节pH在6.9至7之间。温度保持在37℃，通过反作用于搅动速率，调整溶解氧为45％pO2。
细菌菌株初始批培养约17小时及碳源(葡萄糖)消耗之后，添加补加培养基。保持葡萄糖和酸(例如乳酸和醋酸)浓度接近于0。
c)结果
与优化条件下使用大肠杆菌TEX1(pXL3179)在100升发酵罐中的生产相比，最终结果展示于表10。
就XAC-1pir116而言，就TEX1中产生的pXL3179质粒拷贝数而言，7升和800升发酵罐之间没有差别。
在优化条件下，将使用大肠杆菌TEX2pir42在7升发酵罐中产生的质粒pXL3179与使用大肠杆菌TEX1在100升发酵罐中的pXL3179生产进行比较。证实就XAC-1pir116(见实施例5.3)而言，在7升、100升或800升发酵罐中，在TEX1中具有稳定的质粒生产速率。
表10：含有pXL3179的TEX1及TEX2pir42菌株发酵特点
与TEX1相比，在TEX2pir42中，每个细菌中质粒pXL3179拷贝为3倍以上。
从以600nm OD为基础的相同细菌量中，提取对应于不同发酵时间点的质粒，并使用琼脂糖凝胶电泳分析。图21清楚显示了质粒拷贝数随发酵时间增加。图21也显示在Op1328S 5TEX2pir42 中产生的pXL3179的拓扑学，几乎全部为单体形式。
总之，根据本发明的大肠杆菌宿主菌株TEX2pir42提供了未曾预期的pCOR质粒拷贝数的增加，例如pXL3179，与TEX1相比，在实验室规模和发酵罐中，TEX2pir42中的增加为2至5倍。另外，不仅在实验室规模，也在可以与工业生产兼容的大规模(7升发酵罐)中，不但质粒拷贝数显著增加，而且这样产生的质粒表现为单体拓扑学。
实施例13：使用以荧光为基础的新筛选方法鉴定的新型pir116拷贝增加型突变体
为了在细菌宿主细胞中增加pCOR质粒拷贝数，我们诱变了编码pir基因的拷贝增加型突变版本的pir116基因。目前，所有增加R6K衍生质粒的拷贝数的突变，例如pCOR的实施方案，均在pir基因内发现。
使用PCR随机诱变后，将突变的pir116基因引入含有下面说明的cobA报告基因的pCOR质粒中。以荧光为基础的筛选之后，评价所选突变质粒的拷贝数和拓扑学。我们得到增加质粒拷贝数的三个不同的pir116基因突变体。这些新的突变体以前没有得到说明。
对拷贝增加型突变体的经典筛选方法建立在抗生素抗性的基础上。在此方法中，宿主细菌对抗生素的抗性水平是定位于细胞中质粒上的抗生素抗性基因的拷贝数的函数。随着该质粒拷贝数的增加以及由此而来的抗生素拷贝数的增加，抗生素抗性水平也增加。然而，该方法不能应用于含有pir116突变的宿主细胞中的R6K衍生质粒，因为这些细胞中质粒的基线拷贝数过高(约400拷贝/细胞)。因此，以荧光为基础、鉴定pir116拷贝增加型突变株的新的筛选方法得到发展。
对此新方法，将cobA基因引入pCOR载体中，为监测质粒拷贝数的增加提供简单方法。cobA基因得自脱氮假单胞菌(Crouxet等，J.Bacteriol，172：5968-79(1990))。它编码uroIII甲基转移酶，该酶在维生素B12途径中向urogen III分子添加两个甲基基团。在大肠杆菌中过表达时，cobA引起在近紫外光下发荧光的红色产物的蓄积。当暴露于紫外线时，过表达该基因的细菌菌落呈粉色至红色。我们测试该基因以确定其是否可以在pCOR系统中用作质粒拷贝数的报告基因。
为了评价质粒拷贝数与暴露在UV光下的转化细菌的荧光水平之间的关系，构建包括缺失自身启动子的cobA的对照质粒(pXL3767)(图22)。将该质粒转化到三个不同的宿主菌株中(XAC1pir、XAC1pir116和TEX1pir42)。在前面实验的基础上选择这些菌株，前面实验显示XAC1pir中pCOR质粒的平均拷贝数为1，在TEX1中高出约五至十倍，在TEX1pir42中约高出15至30倍。
如图22所示，将重组菌落在M9基本培养基上划线，并在透照仪(tranilluminator)上暴露于UV光下。我们观察到这些菌落的荧光强度与质粒拷贝数正相关，XAC1pir116展示比XACpir更强的荧光，TEX1pir42展示比XAC1pir116更强的荧光。
显示于图22中的这些结果证明这种以荧光为基础的检测方法轻松地区分测试质粒拷贝数，特别是菌株TEX1和TEX1pir42中的质粒拷贝数。更确切的说，观察到的红色荧光强度随质粒pCOR-cobA拷贝数增加。
证实了荧光和cobA拷贝数之间的正相关后，我们构建了引入pir116诱变基因的质粒用于筛选。构建并测试四种具有不同组成性模块组合的质粒(如图23所示)。当转化到pir116和pir116pir42等基因菌株中时，这些质粒之一显示出显著不同的荧光水平。该质粒即pXL3830，显示于图24中相关部分。
在筛选和评价实验中使用对照质粒。首先，使用含有“野生型”pir116的基线水平对照质粒pXL3830设定基线荧光水平。其次，使用含有pir116-pir42双突变的pXL3795作为阳性对照，与pXL3830相比，pXL3795将质粒拷贝数增加4至6倍。
使用Diversify PCR random mutagenesis kit(BD BiosciencesClontech，Palo Alto，CA，USA)在pir116基因上进行随机诱变。使用平均每1000碱基对引入2个突变的条件1。通过对12个突变体的测序，运行“条件1”的预实验显示，pir116基因中的突变率实际约为2个突变。使用寡核苷酸C8832(5-CTTAACGGCTGACATGGGAATTC-3′)(SEQ ID NO：23)和C8833(5′-CGATGGGCGAGCTCCACCG-3′)(SEQ ID NO：24)，将pir116基因作为EcoRI-SstI片段扩增。以EcoRI和SstI消化后，将含有pir116的诱变片段克隆到pXL3830中，取代“野生型”pir116基因。
将携带诱变pir116的质粒(“pir116*”)转化到pCOR宿主XAC1pir116的母本大肠杆菌菌株XAC-1中。在UV光下筛选荧光增加的转化子，并与XAC1(pXL3830)和XAC1(pXL3795)对照比较。副本盘(duplicate plate)不暴露于UV以最小化次级突变。UV光下的代表性筛选板显示于图25中。
下面的流程图概括了筛选实验的结果。
三个选择的突变体的评价概括于图26中。与pir116质粒相比，每个突变体显示拷贝数的增加。在突变体114C和100B的情况下，质粒基本为单体形式。与具有增加的拷贝数和多聚体高含量的pir116pir42质粒(例如突变体201C)相比，这可以是一个优点。
对每个突变体的pir116*基因进行测序。每个克隆在pir116ORF中含有单个非同类编码(non-isocodant)突变。全部三个突变影响参与DNA结合的pi蛋白质的C末端。这些突变以前无一得到描述。
一旦通过筛选在质粒系统中检测到，就在生产系统中评价这些突变，即，将pir116基因*引入大肠杆菌pCOR宿主菌株基因组中。用于此评价的策略概括于图27中。
对此评价，将质粒pXL3179转化到每个在图26中鉴定具有突变的三个大肠杆菌菌株中，并评定质粒拷贝数和拓扑学。这些实验的结果展示于图28中。仅对201C观察到质粒拷贝数相对于XAC1pir116显著增加。
实施例14：具有M13基因III的微环作为在大肠杆菌中通过同源重组整合的工具
1.自杀载体
大肠杆菌中双同源重组的基因置换需要自杀载体。在能够复制这些载体的宿主中构建并产生这些载体，随后使用它们重组到不能对其复制的宿主的染色体中。
噬菌体M13是非常有用的遗传工具，可以用于rep突变体中(Metcalf，W.，W.Jiang，等，Gene 138：1-7(1994))，或当使用M13mp8至11时用于大肠杆菌非抑制菌株中(Blum，P.等，J Bacteriol.，171：538-46(1989))。与构建有关的某些限制，如插入物大小和不稳定性，是经常遇到的。携带R6KγDNA复制起点的质粒是广为人知的自杀载体(Miller，V.和J.Mekalanos，J Bacteriol.，170：2575-83(1988))，但是它们不能用于修饰表达pi蛋白质的大肠杆菌菌株，pi蛋白质允许这类质粒复制。
使用新的反选择标志制造通用自杀载体，并用此通用自杀载体构建大肠杆菌菌株，其中，pir116基因突变体(pir116*)通过同源重组插入到细菌基因组中。此处展示的策略以突变体114C作示范，但是也用于产生具有其它pir116*突变体的菌株。
2.反选择标志(counter-selectable marker)
可以使用不同标志选择经历第二次重组事件的细菌。该事件导致所述标志的丢失，在某些情况下在染色体和自杀载体之间的重组之后导致基因置换。例如，当把表达来自芽孢杆菌(Bacillus)的SacB基因的细菌在含有蔗糖的培养基上涂板时，该基因是致死性的(Ried，J.L.和A.Collmer，Gene 57：239-46(1987))。作为另一个实例，四环素抗性基因赋予了萎蔫酸(fusaric acid)敏感性(Bochner，B.R.等，J Bacteriol.143(2)：926-3(1980))。噬菌体M13的感染赋予了去垢剂脱氧胆酸敏感性(Blum，P.，等，J Bacteriol.171：538-46(1989))。
由于在某些大肠杆菌菌株中缺乏效率，双重组子的阳性选择方法得到发展。对来自噬菌体M13的基因III作为反选择标志进行评价。该基因编码负责颗粒感染性的小病毒体成分。当从多拷贝质粒pBR322过表达时，由于基因III蛋白质插入细菌膜中，基因III赋予细胞脱氧胆酸敏感性(Boeke，J.D.等，Mol Gen Genet 186：185-92(1982))。当以单拷贝出现于大肠杆菌基因组中时，没有报告显示该基因是否可以用作有效的反选择标志。因此，我们使用微环自杀载体检测该假设。
3.使用PCR扩增来自M13的基因III的缺失版本
为了减少将构建的微环载体的大小，选择仍然能够赋予脱氧胆酸敏感性的基因III的缺失版本(Boeke，J.D.，P.Model等，Mol GenGenet 186：185-92(1982))。使用PCR从M13 mp18扩增该基因以及其自身启动子作为BglII-XhoI片段(Yanisch-Perron，C.，J.Vieira等，Gene 33：103-19(1985))(图29)。
所用寡核苷酸如下：
C19519：5’-GGCAGATCTTAAACCGATACAATTAAAGG-3’(SEQ ID NO：25)
BglII
C19520：5’-CCGCTCGAGTTACGATTGGCCTTGATATTCACAAAC-3(SEQ IDNO：26)
XhoI
使用T-A克隆将扩增片段克隆到pGEMT-easy(PromegaCorporation，Madison，WI，USA)中，产生pXL4230(图29)。插入物的核苷酸序列与GenBank目录号VB0018中的说明一致。转化入大肠杆菌菌株DH10B(Invitrogen)后，pXL4230赋予脱氧胆酸敏感性，显示其如预期行使功能。
4.以微环为基础的自杀载体
由于不含任何复制起点，因此微环质粒可以用作通用自杀载体。为此目的，必须添加选择标志例如卡那霉素抗性基因以筛选第一次同源重组事件。为了反选择没有经历第二次重组事件的细菌，向微环载体添加基因III’。用于为重组产生微环的质粒的构建显示于图29中。
引入噬菌体λ整合酶后，由例如pXL4235的质粒产生微环，噬菌体λ整合酶在质粒attP和attB之间重组(Darquet，A.M等，Gene Ther4(12)：1341-9(1997))。在大肠杆菌菌株G6264中，该重组酶在PBAD控制下以阿拉伯糖依赖方式表达，其描述于美国申请号09/981,803。产生的微环含有attL，用于纯化的TH(三螺旋)形成序列，选择标志Tn903卡那霉素抗性基因，反选标志基因III’，以及用于同源重组、克隆到pXL4235多克隆位点的目的片段(图29)。
作为举例，在图30中说明用于产生表达pir116拷贝增加型突变体的大肠杆菌菌株的构建体。这些菌株可以用于产生pCOR质粒(Soubrier，F.等，Gene Ther 6：1482-1488(1999))。由于pir和细菌基因组之间没有同源性，piri16*序列插入到编码β-D-葡糖醛酸酶的大肠杆菌染色体uidA基因中。该基因为同源重组发生提供与大肠杆菌基因组的足够序列相似性。
微环纯化和重组发生的方案如下。将质粒pXL4256(图30)转化到大肠杆菌菌株G6264中，产生G6656。使用G6656的过夜培养物0.5ml接种50ml添加氨苄青霉素(100mg/l)的LB培养基，并在37℃以200rpm振荡培养至600nm光密度达到0.7。向培养基添加250μl灭菌的10％阿拉伯糖溶液，诱导微环产生。在37℃、200rpm三十分钟后，使用Wizard Plus Midipreps DNA Purification system(PromegaCorporation，Madison WI，USA)提取总质粒DNA。
以6μg质粒DNA制剂上样至0.8％琼脂糖预制凝胶。使用超螺旋DNA梯度(Promega Corporation，Madison WI，USA)作为分子量标准。与50V电泳过夜后，使用SV凝胶纯化试剂盒(PromegaCorporation，Madison WI，USA)从凝胶中提取和纯化微环构建体(5.1kb)。
5.使用微环4256(uidA∷pir116*微环自杀载体)进行双同源重组
在图31中说明构建该菌株的重组步骤以及相应表型。
对于第一次重组事件(整合)，将0.2、1和5μl纯化的微环4256电穿孔至大肠杆菌菌株XAC1中(Normanly J等，Proc Natl Acad SciUSA 83：6548-52(1986))，该菌株是pCOR宿主的母本菌株。于37℃过夜培养后，在添加卡那霉素(50mg/l)的LB琼脂上获得卡那霉素抗性菌落。
为了评价可能含有非重组pXL4256污染物的菌落数目，在添加卡那霉素或氨苄青霉素的LB琼脂上，使用50个KmR菌落平行划线。50个菌落中，仅有4个抵抗卡那霉素和氨苄青霉素，并且经质粒限制分析显示含有非重组的pXL4256。这显示通过电穿孔获得的50个菌落中的46个实际上为微环4256整合子。
对于第二次重组事件(切除)，在含有1.5％脱氧胆酸钠(“Doc”；Sigma)的新鲜制备的LB琼脂板上分离全部46个KmR整合子，并于37℃孵育过夜。对每个整合子仅获得少数脱氧胆酸抗性(DocR)菌落(1至15个)，如图32所示。该结果与相对稀有事件的选择一致，例如第二次重组事件。将从15个整合子获得的100个DocR菌落平行复印(patch)到含有1.5％Doc的LB琼脂和添加卡那霉素的LB琼脂上，筛选DocR和Kms双重组子。筛选的克隆的86％为Kms，显示其丢失了自杀载体。
为了筛选等位基因置换，使用PCR扩增染色体uidA基因座。如果发生了等位基因置换，预期的PCR片段长度为1.3kb。与野生型uidA基因座对应的片段(即不含整合的pir116*突变)，其长度为0.85kb。显示于图33-A的结果说明，等位基因置换发生在30％的双重组子中。这一点通过表型分析得到确认，因为这些克隆也是UidA-(β葡糖醛酸酶-)、并且在添加Xgluc的LB琼脂上产生白色菌落。
使用PCR检查两个独立重组子中接近同源重组位点区域的细菌基因组的完整性。第一个引物(seq6113或seq6115)以pir基因为基础，第二个(seq6112或seq6116)具有的序列以接近但是位于同源区之外(紧接uidA-的3’或5’端)的序列为基础。使用XAC1 DNA作为阴性对照，而使用XAC1pir116或TEX1(Soubrier，F.等，Gene Ther 6：1482-1488(1999))作为阳性对照。
用作PCR引物的寡核苷酸如下：
Seq11088：5’-GAGATCGCTGATGGTATCGG-3’(SEQ ID NO：27)
Seq11089：5’-TCTACACCACGCCGAACACC-3’(SEQ ID NO：28)
Seq6112：5’-GACCAGTATTATTATCTTAATGAG-3’(SEQ ID NO：29)
Seq6113：5’-GTATTTAATGAAACCGTACCTCCC-3’(SEQ ID NO：30)
Seq6115：5’-CTCTTTTAATTGTCGATAAGCAAG-3’(SEQ ID NO：31)
Seq6116：5’-GCGACGTCACCGAGGCTGTAGCCG-3’(SEQ ID NO：32)
使用引物seq6112和seq6113的PCR产物的预期大小为0.83kb，使用引物seq6114和seq6115时为0.88kb。结果显示于图33-B。以微环自杀载体获得的两个双重组子显示预期的PCR图谱。这说明使用微环质粒作为自杀载体、M13基因III’作为反选择标志，可以在大肠杆菌中轻松地实现双同源重组。这种基因置换技术可以直接、普遍地在任何微生物遗传背景下执行。
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tcagtgcgtt acatccctgg cttgttgtcc acaaccgtta aaccttaaaa gctttaaaag 120
ccttatatat tctttttttt cttataaaac ttaaaacctt agaggctatt taagttgctg 180
atttatatta attttattgt tcaaacatga gagcttagta cgtgaaacat gagagcttag 240
tacgttagcc atgagagctt agtacgttag ccatgagggt ttagttcgtt aaacatgaga 300
gcttagtacg ttaaacatga gagcttagta cgtgaaacat gagagcttag tacgtactat 360
caacaggttg aactgctgat cttcagatc 389
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aagcgagtga tgtatatggc gcttgctccc attgatagca aagaacctct tgaacgaggg 180
cgagttttca aaattagggc tgaagacctt gcagcgctcg ccaaaatcac cccatcgctt 240
gcttatcgac aattaaaaga gggtggtaaa ttacttggtg ccagcaaaat ttcgctaaga 300
ggggatgata tcattgcttt agctaaagag cttaacctgc cctttactgc taaaaactcc 360
cctgaagagt tagatcttaa cattattgag tggatagctt attcaaatga tgaaggatac 420
ttgtctttaa aattcaccag aaccatagaa ccatatatct ctagccttat tgggaaaaaa 480
aataaattca caacgcaatt gttaacggca agcttacgct taagtagcca gtattcatct 540
tctctttatc aacttatcag gaagcattac tctaatttta agaagaaaaa ttattttatt 600
atttccgttg atgagttaaa ggaagagtta acagcttata cttttgataa agatggaaat 660
attgagtaca aataccctga ctttcctatt tttaaaaggg atgtgttaaa taaagccatt 720
gctgaaatta aaaagaaaac agaaatatcg tttgttggct tcactgttca tgaaaaagaa 780
ggaagaaaaa ttagtaagct gaagttcgaa tttgtcgttg atgaagatga attttctggc 840
gataaagatg atgaagcttt ttttatgaat ttatctgaag ctgatgcagc ttttctcaag 900
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Met Arg Leu Lys Val Met Met Asp Val Asn Lys Lys Thr Lys Ile Arg
1 5 10 15
His Arg Asn Glu Leu Asn His Thr Leu Ala Gln Leu Pro Leu Pro Ala
20 25 30
Lys Arg Val Met Tyr Met Ala Leu Ala Leu Ile Asp Ser Lys Glu Pro
35 40 45
Leu Glu Arg Gly Arg Val Phe Lys Ile Arg Ala Glu Asp Leu Ala Ala
50 55 60
Leu Ala Lys Ile Thr Pro Ser Leu Ala Tyr Arg Gln Leu Lys Glu Gly
65 70 75 80
Gly Lys Leu Leu Gly Ala Ser Lys Ile Ser Leu Arg Gly Asp Asp Ile
85 90 95
Ile Ala Leu Ala Lys Glu Leu Asn Leu Leu Phe Thr Ala Lys Asn Ser
100 105 110
Pro Glu Glu Leu Asp Leu Asn Ile Ile Glu Trp Ile Ala Tyr Ser Asn
115 120 125
Asp Glu Gly Tyr Leu Ser Leu Lys Phe Thr Arg Thr Ile Glu Pro Tyr
130 135 140
Ile Ser Ser Leu Ile Gly Lys Lys Asn Lys Phe Thr Thr Gln Leu Leu
145 150 155 160
Thr Ala Ser Leu Arg Leu Ser Ser Gln Tyr Ser Ser Ser Leu Tyr Gln
165 170 175
Leu Ile Arg Lys His Tyr Ser Asn Phe Lys Lys Lys Asn Tyr Phe Ile
180 185 190
Ile Ser Val Asp Glu Leu Lys Glu Glu Leu Ile Ala Tyr Thr Phe Asp
195 200 205
Lys Asp Gly Asn Ile Glu Tyr Lys Tyr Pro Asp Phe Pro Ile Phe Lys
210 215 220
Arg Asp Val Leu Asn Lys Ala Ile Ala Glu Ile Lys Lys Lys Thr Glu
225 230 235 240
Ile Ser Phe Val Gly Phe Thr Val His Glu Lys Glu Gly Arg Lys Ile
245 250 255
Ser Lys Leu Lys Phe Glu Phe Val Val Asp Glu Asp Glu Phe Ser Gly
260 265 270
Asp Lys Asp Asp Glu Ala Phe Phe Met Asn Leu Ser Glu Ala Asp Ala
275 280 285
Ala Phe Leu Lys Val Phe Asp Glu Thr Val Pro Pro Lys Lys Ala Lys
290 295 300
Gly
305
<210>23
<211>23
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<400>23
cttaacggct gacatgggaa ttc 23
<210>24
<211>19
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<400>24
cgatgggcga gctccaccg 19
<210>25
<211>29
<212>DNA
<213>噬菌体M13mp18
<400>25
ggcagatctt aaaccgatac aattaaagg 29
<210>26
<211>36
<212>DNA
<213>噬菌体M13mp18
<400>26
ccgctcgagt tacgattggc cttgatattc acaaac 36
<210>27
<211>20
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<400>27
gagatcgctg atggtatcgg 20
<210>28
<211>20
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<400>28
tctacaccac gccgaacacc 20
<210>29
<211>24
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<400>29
gaccagtatt attatcttaa tgag 24
<210>30
<211>24
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<400>30
gtatttaatg aaaccgtacc tccc 24
<210>31
<211>24
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<400>31
ctcttttaat tgtcgataag caag 24
<210>32
<211>24
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<400>32
gcgacgtcac cgaggctgta gccg 24
<210>33
<211>12
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<400>33
agaaaaaaag ga 12
<210>34
<211>12
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<400>34
tctttttttc ct 12
<210>35
<211>14
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<400>35
aagaaaaaaa agaa 14
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<211>14
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<400>36
ttcttttttt tctt 14
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<212>DNA
<213>大肠杆菌
<400>37
tctttttttc ct 12
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<212>DNA
<213>大肠杆菌
<400>38
ttcttttttt tctt 14
<210>39
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<212>DNA
<213>大肠杆菌
<400>39
aaaaaaggga ataaggg 17
机译： 具有条件复制起点的环状DNA分子，其制备方法及其在基因治疗中的用途
机译： 具有条件复制起点的环状DNA分子，其制备方法及其在基因治疗中的用途
机译： 具有条件复制起点的环状DNA分子，其制备方法及其在基因治疗中的用途
