一种利用腺病毒载体表达狂犬病病毒双基因制备狂犬病活载体疫苗的方法

摘要

一种利用腺病毒载体表达狂犬病病毒双基因制备狂犬病活载体疫苗的方法，包括如下过程：一、制备目的基因：设计引物，扩增出狂犬病病毒(rabies virus，RV)抗原蛋白G基因与N基因；二、构建腺病毒穿梭载体：将抗原蛋白G基因与N基因插入到复制缺陷型腺病毒穿梭载体特异性启动子和终止子之间，构建成含有融合基因(G+N)的腺病毒穿梭载体(pAdTrack－CMV/G+N)；三、获得腺病毒质粒：将获得的重组复制缺陷型腺病毒穿梭载体(pAdTrack－CMV/G+N)与腺病毒骨架载体(pAdEasy－1)通过同源重组得到重组腺病毒质粒；四、用重组腺病毒质粒产生基因组结构均一的重组腺病毒，将重组腺病毒制成狂犬病活载体疫苗。本发明较之现有狂犬病疫苗更为安全和有效，制作周期较短。

说明书

技术领域：

本发明涉及利用病毒载体生产狂犬病活载体疫苗的方法，特别是一种利用腺病毒载体表达狂犬病病毒双基因制备狂犬病活载体疫苗的方法。

背景技术： 

狂犬病(rabies)是由狂犬病毒引起的人兽共患病传染病，一旦发病，则100％死亡。到目前为止无特效治疗药物，有效的办法只有注射疫苗进行预防，因此对狗、猫和野生动物的大面积的预防免疫是控制和消灭狂犬病的根本措施。目前我国兽用的狂犬病疫苗主要有灭活苗和弱毒苗。尽管传统疫苗在狂犬病预防控制中仍占主导地位，但由于生产成本昂贵，免疫期短，因灭活不彻底而造成散毒的潜在危险等因素的存在，研制安全、高效的新型狂犬病分子疫苗仍显得非常必要。狂犬病基因工程疫苗具有安全、高效、生产费用低廉等优点，但目前尚未有狂犬病基因工程疫苗上市。综合狂犬病分子疫苗的研究现状，我们认为以腺病毒为表达载体的基因工程重组狂犬病疫苗(或称活载体疫苗)具有良好的应用前景。

本发明的内容：

本发明的目的是提供一种利用腺病毒载体表达狂犬病病毒双基因制备狂犬病活载体疫苗的方法，从而获得安全、高效的狂犬病疫苗。

本发明的目的是按如下技术方案实现的。本发明为利用腺病毒载体表达狂犬病病毒双基因制备狂犬病活载体疫苗的方法，其特征是

1、它包括以下过程：

一、制备目的基因：设计引物，通过PCR的方法扩增出狂犬病病毒(rabies virus，RV)抗原蛋白G基因与N基因；

二、构建重组复制缺陷型腺病毒穿梭载体：

将所述的抗原蛋白G基因与N基因插入到复制缺陷型腺病毒穿梭载体特异性启动子和终止子之间，构建成含有融合基因G+N的重组复制缺陷型腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV/G+N；

三、获得复制缺陷型腺病毒质粒：

将获得的重组复制缺陷型腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV/G+N与腺病毒骨架载体pAdEasy-1通过在大肠杆菌中质粒间同源重组从而得到重组腺病毒质粒；

四、用重组腺病毒质粒产生基因组结构均一的重组腺病毒，包括以下操作：

1)酶切，用Pac I酶切腺病毒质粒，

2)转染，转染293细胞，

3)接种293细胞，

4)冻存，将基因组结构均一的重组腺病毒冻存；

将所述的重组腺病毒制成狂犬病活载体疫苗，直接注射动物进行免疫。

2、在所述的过程四之外，还有检测过程五：包括检测抗原蛋白(G+N)基因已经整合到腺病毒载体中，和检测抗原蛋白(G+N)融合基因获得表达。

3、在所述的过程一中：

所设计的抗原蛋白G基因与N基因的扩增引物为，

G1：5’Cg g gTA CC T CTA CCA Tgg TTC CTC Agg TT 3’

          Kpn I酶切位点

G2：5’AT g Cgg CCg C gC TCA Cag TCT gAT CTC 3’

           Not I酶切位点 

N1：5’AAC g Cgg CCg C AC CCC TAC CAT ggA TgC C 3’

           Not I酶切位点

N2：5’Cgg TCTA gA ATT gCA CTC ggA T TAA CAA Ag 3’

            Xba I酶切位点

其中，ATG为起始密码子；分别以狂犬病毒CVS毒株为模板进行扩增。

4、在所述的过程二中，

所述的腺病毒载体启动子为CMV；终止子为polyA；

所述的重组腺病毒穿梭载体的构建包括以下操作：

1)将回收得到的目的基因G经Kpn I、Not I双酶切，目的基因N经Not I、Xba I双酶切后，形成带有粘性末端的目的基因；

2)同时，将腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV经Kpn I、Xba I双酶切，得到线性化的载体；

3)使用T4 DNA连接酶对上述产物进行粘端连接；

4)按常规方法将连接产物转化大肠埃希氏菌(JM109)，在含卡那抗性的琼脂平板上筛选，挑选克隆后，提取质粒；

5)采用酶切、PCR扩增方法鉴定，得到阳性重组质粒

pAdTrack-CMV/G+N。

5、在所述的过程三中，所述的获得复制缺陷型腺病毒质粒的过程包括以下操作：

1)将重组穿梭载体分别用Pme I单酶切以线性化；

2)取pAdEasy-1与线性化重组穿梭载体混合，高压电转化大肠杆菌BJ5183；

3)电转后将细胞在培养液中复苏，取细胞涂入含卡那霉素的培养板中，培养；

4)挑选卡那霉素抗性克隆，小量提取质粒DNA，用0.8％琼脂糖凝胶进行电泳迁移率分析，并进行限制性内切酶图谱分析；

5)将所得的重组腺病毒质粒以上述同样条件电转化入宿主菌，在此宿主菌中可获得大量高质量的质粒，挑取目的克隆。

6、在所述的操作5)中，所述的宿主菌为DH10B(rec A，end A)。

7、在所述的过程四中，用重组腺病毒质粒产生基因组结构均一的重组腺病毒的各操作的具体做法为：

1)酶切，取从DH10B中提取的各重组腺病毒质粒，用Pac I酶切，完全消化以切去ori和kan抗性基因等质粒构件，并暴露其反转末端重复序列ITR；

2)转染，脂质体介导的转染，在组织培养皿中接种293细胞进行转染；

3)接种，取病毒上清接种293细胞，以含2％小牛血清的完全DMEM培养液于培养箱中培养，逐日观察细胞病变(CPE)，到293细胞完全病变；

4)冻存，收集病毒感染的病变细胞，连同上清冻存(于-20℃)。

8、在所述的操作2)转染中，所述的脂质体介导的转染包括以下分操作：

①稀释Pac I酶切线性化的重组腺病毒质粒至DMEM培养液中；

②然后将脂质体(lipofectAMINE2000)悬液加至DMEM培养液中，充分将二者混匀，室温下温育；

③在此期间吸弃细胞原培养液，用DMEM培养液洗细胞一次；

④往每平皿加DNA/脂质体复合物，在5％CO₂培养箱中温育后吸弃含DNA/脂质体复合物的培养液，

⑤补加含10％小牛血清的DMEM完全培养液，继续培养，脂质体转染后，收集细胞，反复冻融。

9、在所述的过程五中，所述的检测基因已经整合到腺病毒载体中，其做法是采用PCR和限制性内切酶鉴定，进行琼脂糖凝胶电泳分析检测。

10、在所述的过程五中，所述的检测G+N融合基因获得表达，其做法是采用观测绿色荧光蛋白表达的办法：包括利用倒置显微镜观测细胞病变和荧光显微镜观测报告基因绿色荧光蛋白的表达。

活载体疫苗是近年来研究热点之一，被认为是一种很有开发前景的疫苗。制苗时往活载体中插入外源保护性目的基因，由于外源基因已经成为作为载体的病毒或细菌的自身结构的一部分，故所产生的免疫应答水平通常不低于完整病毒或细菌相应成分所引起的免疫强度。重组痘病毒载体和重组腺病毒载体具有宿主范围广，对外界有一定的抵抗力，被认为是基因工程疫苗的优良载体。虽然对重组痘病毒载体的研究起步最早，但由于痘苗病毒能在哺乳动物体内复制，人们对它的生物安全性存在某种疑问，担心与天花病毒类似的痘苗病毒在动物上应用会进化出对人类有致病性的新病毒。而复制缺陷型腺病毒常缺失对于病毒复制所必需的病毒早期基因E1区，使其在动物体内不能复制，因此研制重组复制缺陷型腺病毒狂犬病疫苗更为安全和有效。

狂犬病毒有5种结构蛋白，其中糖蛋白G与病毒的感染和免疫有密切关系。研究表明G是唯一诱导中和抗体的蛋白，也能刺激细胞免疫应答，可抵抗狂犬病毒外周和脑内途径的攻击。近年来研制的狂犬病基因工程重组疫苗，大都以糖蛋白cDNA作为目的基因。这些重组疫苗虽然可以刺激特异性抗体的产生，并产生一定水平的保护力，但是，单一的糖蛋白G其总体诱导产生的抗体水平并不高，有待于提高其水平。

核蛋白N是另一种与免疫有关的蛋白，核蛋白N是除糖蛋白以外具有免疫原性的另一种重要结构蛋白，可促进B细胞产生中和抗体，并激发细胞免疫反应，抗核蛋白抗体还能抑制病毒在细胞间的传播和在细胞内的复制。核蛋白N虽不能诱生中和抗体，但具有保护机体免于狂犬病毒侵击的作用，也可刺激细胞免疫，并激活B细胞产生N抗体和促进G产生抗体，使总体诱导产生的抗体水平显著提高。因此，我们采用抗原蛋白G基因与N基因构建了狂犬病毒CVS毒株G+N双基因编码的腺病毒穿梭载体。以总体诱导产生提高的抗体水平，保证重组疫苗的有效性和安全性。建立同时以糖蛋白G和核蛋白N为基础的新型疫苗，在核蛋白N的参与下，不仅可以诱导体液免疫，而且还能诱导细胞免疫，从而可诱导机体产生更为全面的免疫应答，获得更好的免疫效果。

构建重组腺病毒工作中的限速步骤是将目的基因整合入腺病毒基因组，目前这一关键过程中大都是以哺乳动物细胞中同源重组方式实现的，有一定的难度。同时，因重组效率不高，所得的重组病毒常常需要空斑纯化，故实验周期较长，而且也不能保证重组腺病毒基因组结构的均一性。我们利用生长周期快，操作简便的大肠杆菌细菌实现质粒间同源，从而很快的获得均一的重组腺病毒载体。

综上所述，本发明重组复制缺陷型腺病毒狂犬病疫苗较之现有狂犬病疫苗更为安全和有效，制作周期较短。

附图说明

图1为重组穿梭载体pAdTrack-CMV/G+N酶切及PCR鉴定图，

图2为重组腺病毒质粒鉴定图，

图3为利用倒置显微镜观测细胞病变图，

图4为利用荧光显微镜观测绿色荧光蛋白的表达图，

图5为表达重组腺病毒穿梭载体的构建图。

实施例

用本方法制作可以直接接种动物的狂犬病复制缺陷型腺病毒活载体疫苗。

包括以下过程：参照图5，

一、制备目的基因：设计引物，通过PCR的方法扩增出狂犬病病毒(rabies virus，RV)抗原蛋白G基因与N基因；在本过程一中：

所设计的抗原蛋白基因G和抗原蛋白基因N的扩增引物为，

G1：5’Cg g gTA CC T CTA CCA Tgg TTC CTC Agg TT 3’

          Kpn I酶切位点

G2：5’AT g Cgg CCg C gC TCA Cag TCT gAT CTC 3’

           Not I酶切位点

N1：5’AAC g Cgg CCg C AC CCC TAC CAT ggA TgC C 3’

            Not I酶切位点

N2：5’Cgg TCTA gA ATT gCA CTC ggA T TAA CAA Ag 3’

            Xba I酶切位点

其中，ATG为起始密码子；分别以狂犬病毒CVS毒株为模板进行扩增。

G1位于狂犬病毒CVS株全序列3318处；

G2位于狂犬病毒CVS株全序列4893处；

N1位于狂犬病毒CVS株全序列62处；

N2位于狂犬病毒CVS株全序列1547处。

二、构建重组复制缺陷型腺病毒穿梭载体：

将所述的抗原蛋白抗原蛋白G基因与N基因插入到复制缺陷型腺病毒穿梭载体特异性启动子和终止子之间，构建成含有融合基因G+N的重组复制缺陷型腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV/G+N；

在本过程二中，

所述的腺病毒载体启动子为CMV；终止子为polyA；

所述的重组腺病毒穿梭载体的构建包括以下操作：

1)将回收得到的目的基因G经Kpn I、Not I双酶切，目的基因N经Not I、Xba I双酶切后，形成带有粘性末端的目的基因；

2)同时，将腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV经Kpn I、Xba I双酶切，得到线性化的载体；

3)使用T4 DNA连接酶对上述产物进行粘端连接；

4)按常规方法将连接产物转化大肠埃希氏菌JM109，在含卡那抗性的琼脂平板上筛选，挑选克隆后，提取质粒；

5)采用酶切、PCR扩增等方法鉴定，得到阳性重组质粒pAdTrack-CMV/G+N。

三、获得复制缺陷型腺病毒质粒：

将获得的重组复制缺陷型腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV/G+N与腺病毒骨架载体pAdEasy-1通过在大肠杆菌中质粒间同源重组从而得到重组腺病毒质粒；

在本过程三中，所述的获得复制缺陷型腺病毒质粒的过程包括以下操作：

1)将重组穿梭载体分别用Pme I单酶切以线性化；

2)取0.1mg pAdEasy-1与1.0mg线性化重组穿梭载体混合，高压电转化大肠杆菌BJ5183；

3)电转后将细胞在LB培养液中于37℃复苏30min，取细胞涂入含50mg/ml卡那霉素的培养板中，于37℃培养16~20h；

4)挑选卡那霉素抗性克隆，小量提取质粒DNA，用0.8％琼脂糖凝胶进行电泳迁移率分析，并进行限制性内切酶图谱分析；

5)将所得的重组腺病毒质粒以上述同样条件电转化入宿主菌DH10B(rec A，end A)，在此宿主菌中可获得大量高质量的质粒，挑取目的克隆。

四、用重组腺病毒质粒产生基因组结构均一的重组腺病毒，包括以下操作：

1)酶切，取从DH10B中提取的各重组腺病毒质粒4μg，用Pac I酶切，完全消化以切去ori和kan抗性基因等质粒构件，并暴露其反转末端重复序列ITR；

2)转染，脂质体介导的转染，在35mm组织培养皿中接种293细胞进行转染，

所述的脂质体介导的转染包括以下分操作：

①稀释Pac I酶切线性化的重组腺病毒质粒4μg至250ul DMEM培养液中；

②然后将脂质体lipofectAMINE2000悬液10μl加至250ul DMEM培养液中，充分将二者混匀，室温下温育20min；

③在此期间吸弃细胞原培养液，用DMEM培养液洗细胞一次；

④往每平皿加500ul DNA/脂质体复合物，在37℃，5％CO₂培养箱中温育3~5h后吸弃含DNA/脂质体复合物的培养液，

⑤补加3ml含10％小牛血清的DMEM完全培养液，继续培养7天，脂质体转染后，收集细胞，反复冻融3次。

3)接种，取病毒上清接种293细胞，以含2％小牛血清的完全DMEM培养液于37℃、5％CO₂培养箱中培养，逐日观察细胞病变CPE，至293细胞完全病变；

4)冻存，收集病毒感染的病变细胞，连同上清冻存于-20℃。

检测过程五：包括检测抗原蛋白G+N基因已经整合到腺病毒载体中，和检测抗原蛋白G+N融合基因获得表达。

所述的检测G+N基因已经整合到腺病毒载体中，采用PCR和限制性内切酶鉴定，进行琼脂糖凝胶电泳分析。将所获得的含有目的基因G+N的重组穿梭载体pAdTrack-CMV/G+N经Kpn I、Xba I双酶切鉴定可切出约3.0KB的目的片段(图1A)。同时PCR鉴定也可扩增出大小相符的G基因和N基因目的片段(图1B)，通过与标准分子量对比可判断。同源重组后检测目的基因已经整合入腺病毒载体，通过琼脂糖凝胶电泳分析可见重组质粒明显落后于骨架载体(图2A)，限制性内切酶酶切后可见约4.5KB和33KB的条带，其结果与预期相符(图2B)。

所述的检测G+N融合基因获得表达，采用观测绿色荧光蛋白表达的办法：包括利用倒置显微镜观测细胞病变，可见对照细胞正常生长(图3A)，而转染细胞出现明显的细胞病变(图3B)。利用荧光显微镜可直接观测到报告基因绿色荧光蛋白的表达。其结果图4所示。

将经检测合格的重组腺病毒制成狂犬病活载体疫苗，直接注射动物进行免疫。