表达狂犬病病毒糖蛋白的犬2型腺病毒活载体重组疫苗安全评价及免疫效力研究

摘要

本研究评价了本实验室已构建的狂犬病病毒糖蛋白-犬2型腺病毒重组疫苗(以下简称CAV2-E3△-CGS)在环境释放阶段的生物安全性，进行了生产性试验阶段3000条犬的免疫效力研究。 实验一狂犬病病毒糖蛋白-犬2型腺病毒重组疫苗环境释放阶段安全性评价： 根据《农业转基因生物安全管理条例》规定，经国家农业部批准，在吉林省长春市绿园区城西乡红民村和吉林省松源市宁江区良种场农大分场两地开展了CAV2-E3△-CGS环境释放阶段的生物安全评价。500条受试犬，分口服和注射2组免疫；免疫时每条犬注射重组疫苗病毒1ml(10<'7.75> TCID<,50>/ml)或口服3ml(10<'7.75>17CID<,50>/ml)，免疫一次，免疫前及免疫后每周或每隔周采血，分别测定如下指标：①重组疫苗在细胞中和犬体内的遗传稳定性，及其在犬体内其它寄生菌中的转移情况；②重组病毒在体内的分布、存留时间和免疫犬后的排泄规律：③高倍剂量接种重组疫苗后对受试犬的影响；④重组疫苗生产人员和试验人员体内犬腺病毒特异性抗体检测；⑤试验区周围动物体内犬腺病毒特异性抗体检测⑥试验期间和试验结束后6个月内，监测试验所在环境中(粪、尿、土、水等)外源基因的存留情况；⑦疫苗在靶动物体内诱导产生的抗体水平及消长规律。 结果显示，CAV2-E3△-CGS的基本生物学特性与受体微生物(CAV．2-YCA-18株)一致。遗传稳定性检测表明，本疫苗在体外传代79次和体内传代11次后，重组病毒的核酸序列和生物特性未发现改变。PCR方法检测从受试犬口腔、鼻腔、肺部和肠道中分离到的寄生菌，未发现重组病毒特异性基因组序列。经组织切片观察和免疫组化检测免疫犬的组织，未发现异常病理学变化，也未检测到重组腺病毒或目的抗原在犬体内的分布，但病毒分离和PCR检测结果显示，重组病毒在受试犬大肠和小肠中短暂存留，在犬粪便中短期内也能检测到重组病毒的存在。高倍剂量的CAV2-E3△-CGS对受试犬无急性、亚急性和慢性毒性作用，无致畸作用，子代犬发育正常。重组疫苗生产人员和试验人员体内未检测出犬腺病毒特异性抗体。试验区周围绝大多数动物体内未检测到犬腺病毒特异性抗体，个别犬由于自然感染犬腺病毒野毒株而带有低水平的犬腺病毒抗体(但无狂犬病抗体)。免疫犬后每周采集试验区域内有代表性地点的非受试动物粪便、水样及土壤样品，以PCR法检测重组腺病毒载体及外源基因的特异性核酸序列，对其中阳性样品进行病毒的分离鉴定。所有采集样品均未扩增获得重组腺病毒载体及外源基因的特异性核酸序列。CAV2-E3△-CGS诱导的抗体平均水平在国际最低保护水平(0.5IU/ml)以上，抗体持续时间至少为54周。 实验二狂犬病病毒糖蛋白-犬2型腺病毒重组疫苗生产性实验阶段免疫效力研究： 根据《农业转基因生物安全管理条例》有关规定，我们又在吉林省长春市绿园区城西乡红民村和吉林省松源市宁江区良种场农大分场两地开展了CAV2-E3△-CGS的免疫效果研究。试验中共免疫犬3000条，分2组即口服组和肌肉注射组；免疫时每条犬肌肉注射1ml(10<'7.75> TCID<,50>/ml)或口服3ml(10<'7.75>TCID<,50>/ml)，免疫一次，免疫前及免疫后每周或每隔周对2～5％的免疫犬进行了采血抽检。进行了如下试验：荧光抗体病毒中和试验测定抗体中和效价；HI检测腺病毒抗体血凝抑制效价；淋巴细胞增殖试验检测细胞免疫水平；Western-blot分析抗体组成。 结果显示，CAV2-E3△-CGS在犬体内诱导产生了较高的针对狂犬病病毒和腺病毒的两种特异性抗体，并能诱导机体产生细胞免疫反应。CAV2-E3△-CGS两种免疫途径的血凝效价消长规律基本一致，但诱导产生免疫反应的时间有所差别，口服免疫产生的抗体时间稍晚于注射免疫。犬一次免疫后产生的抗狂犬病病毒中和抗体效价为4.5±1.1IU，抗体阳转率为87.1％，中和抗体保护时间至少可持续54周。 上述安全性评价及免疫试验结果表明，CAV2-E3A-CGS以口服和注射两种途径免疫，均具有较高的安全性和较好的免疫效果。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写词表

声明

文献综述

1.前言

2.新型狂犬病疫苗的研究概况

3.动物腺病毒疫苗载体的研究概况

研究内容

实验一 狂犬病病毒糖蛋白-犬2型腺病毒重组疫苗的环境释放阶段安全评价

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

实验二 狂犬病病毒糖蛋白-犬2型腺病毒重组疫苗的生产性试验免疫研究

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

结论

参考文献

致谢