β－酮酰基－ACP合成酶Ⅱ及其编码基因

摘要

具有能够控制或调节植物细胞饱和和非饱和脂肪酸含量酶活性蛋白质的基因以及该基因表达产物的酶蛋白,更具体地:具有β－酮酰基－ACP合成酶Ⅱ(KASⅡ)活性的蛋白质,并且该蛋白质具有以来源于蓝绿藻(组囊藻,Anacystis nidulans)的KASⅡ氨基酸序列为典型代表的特定氨基酸序列或与其基本上等价的氨基酸序列;编码上述蛋白氨基酸序列的KASⅡ蛋白基因;含有该基因的重组载体以及转入了该基因的细胞。

说明书

                        技术领域

本发明涉及与植物中脂肪酸合成相关的合成酶的氨基酸序列和与此相关的DNA构造，即涉及具有特定氨基酸序列的脂肪酸合成酶蛋白质和编码该物质的基因。应用这样的基因和插入了适宜调节序列(调节基因)的嵌合基因转化细胞，可控制细胞中饱和和不饱和脂肪酸的含量。

                        背景技术

已知脂肪酸合成酶有2种类型，在动物和酵母中的酶是多种酶全体连结成具有一个功能的复合体-脂肪酸合成酶复合体(FAS)(I型)，与此相对，在高等植物细胞和原核生物中的酶是各种酶在生物体外独立、散在存在的(II型)。用II型酶合成脂肪酸的时候，可溶性蛋白质酰基载体蛋白(ACP)是必要的，合成的脂肪酸以酰基-ACP形式存在。所合成的最终产物为棕榈酰基-ACP。棕榈酰-ACP再通过延长链长转变为硬脂酰基-ACP后，经可溶性脂肪酸去饱和酶(硬脂酰基-ACP去饱和酶)的去饱和作用，转换成油酰基-ACP。棕榈酸和油酸合并极性脂质后，再将后者去饱和(J.Ohlrogge和J.Browse(1995)脂质的生物合成。植物细胞，7，p957-970)。

催化由棕榈酰基-ACP向硬脂酰基-ACP进行链延长的酶，能从棕榈酰基-ACP、丙二酰基-ACP和NADPH制备硬脂酰基-ACP(J.Ohlrogge和J.Browse(1995)Lipid Biosynthesis.The Plant Cell 7，p957-970)。这些反应说明了棕榈酰基-硫酯和C2单位的缩合物经还原、脱水、再还原生成硬脂酰基-硫酯的一系列酶反应的全部流程。

已对植物中脂质的生物合成进行了很好地研究(Browse等，Annu.Rev.Plant Physiol.Mol.Biol.(1991)42：467-506)。通过这些研究得知植物细胞中，从棕榈酸生成硬脂酸是由β-酮酰基-ACP合成酶II(KASII)进行催化的反应。但是在上述文献中对KASII酶及其基因均未进行分离，它们的序列也是未知的。

另外，已知KAS的同功酶在植物的叶绿体中有3种，除KASII以外的2种同功酶中，KASIII催化酰基链合成的启动，KASI催化酰基链到碳原子数为16的棕榈酰-ACP的延长反应。从拟南芥属中分离出多种与植物的脂质合成相关的酶的变异体，特别对进行去饱和作用的酶进行了详细分析。也有关于KASII的报道，将其变异体命名为fabl。该变异体中，KASII酶活性降低到65％，结果棕榈酸的含量在叶中增加7％、根中增加3％(Wu等，Plant Physiol.(1994)106：143-150)。关于KASII酶的完全纯化，从蓖麻(Ricinus communis；特表平6-500234号公报)和大豆(Glycine max；特表平7-501446号公报)克隆以该纯化酶限制性分解肽的氨基酸序列为基础的基因。上述公报中，对于用这些基因进行转化所致的脂肪酸变化是在大肠杆菌中表达蓖麻的基因时，碳原子数为16的脂肪酸含量约减少20％，总的脂肪酸含量增加30％，而将大豆的基因导入カノ一ラ(canola)的时候，其种子的棕榈酸减少0.8％，导入烟草的时候，其叶中棕榈酸约减少2％。而不可思议的是未见到蓖麻和大豆二者的基因间存在明确同源性的序列。

可是，已知构成生物膜的膜脂，相转移温度主要是根据与脂质结合的脂肪酸的不饱和程度有所变化，结果生物的耐低温性也有所变化。为了提高膜脂的不饱和程度，例如脂肪酸的转移酶(PCT/JP 92/00024(PCT/WO 92/13082))。脂肪酸的去饱和酶(PCT/JP 94/02288(PCT/WO 95/18222))等有效。

                        发明公开

基于上述情况，本发明的目的是提供蛋白质的基因及其表达产物酶蛋白质，该蛋白质具有这样的酶活性：它能调节或控制植物细胞或微生物细胞中饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的含量。

如果存在具有这样酶活性的蛋白质，即与脂肪酸合成相关的酶活性降低，细胞的脂质中棕榈酸含量增加，而酶活性增加时，碳原子数为18以上的脂肪酸的含量增加，也许脂质中不饱和脂肪酸的含量增加，例如作为由于酶活性的增加，碳原子数为18以上的脂肪酸含量增加的结果。

为了解决上述问题，本发明人进行了认真研究，结果从蓝绿藻(Anacystis nidulans)中成功分离了编码β-酮酰基-ACP合成酶II(KASII)的基因，并发现把该基因转入大肠杆菌可付与KASII的生产能力，由此链长延长的脂肪酸增加，基于以上发现，完成了本发明。

也就是说，本发明涉及一种蛋白质，它具有序列号2中所示的氨基酸序列，或所具有的氨基酸序列基本上与序列号2中的氨基酸序列是同一氨基酸序列，且具有KASII酶活性。

另外本发明还涉及编码蛋白质的KASII酶基因，所编码的蛋白质具有序列号2中所示的氨基酸序列，或具有基本上与序列号2中氨基酸序列相同的氨基酸序列，且具有KASII酶活性。

再者，本发明涉及含有上述基因的重组载体和转入了上述基因的细胞。

                        附图简述

图1表示由单字符表示的、与序列表2(3字符表示的氨基酸)相对应的氨基酸序列。

图2是大麦(SWISS-PROT数据库中登记号为P23902)KASI酶的氨基酸与由蓖麻子(GENBANK登记号L13241)KASII的DNA序列推测的氨基酸序列的比较图。

图3是本发明中来源于组囊藻(Anacystis nidulans)的KASII酶(图中以KASII表示)与集胞藻类PCC6803株(Synechocystis sp.strain PCC6803)的fabF或J(编号sll 1069)的氨基酸序列(记作Fab)的比较图。

                发明的最佳实施状态

以下对本发明进行详细说明。KASII酶活性蛋白质及其基因

如上所述，本发明具有KASII酶活性的蛋白质具有序列号2(与图1的氨基酸序列(单字符表示)相对应)所示的氨基酸序列，或者具有与序列号2所示的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列，另外，本发明的KASII酶活性蛋白质基因编码具有序列号2中所示氨基酸序列或具有基本上与序列号2中所示氨基酸序列相同的氨基酸序列的上述酶蛋白质。本发明中“具有KASII酶活性的蛋白质”或“KASII酶活性蛋白质”是指具有通过延长脂肪酸(特别是棕榈酸)链而生成高级脂肪酸(特别是硬脂酸)这样酶活性的蛋白质。

象这样的KASII酶活性蛋白质，除可应用自然界中存在的合适基因产物外，只要是保持上述KASII酶活性，这些蛋白质的氨基酸序列的一部分变化了的变异基因产物亦可用于本发明。作为KASII酶活性蛋白质基因产物的例子，来源于微生物蓝绿藻(序列号2)的KASII酶可为代表例。

本发明中的“基本上相同氨基酸序列”也包括上述变异体的序列，典型的是序列号2中所示的来源于蓝绿藻的酶蛋白质的氨基酸序列(序列号2，图1)，或者是该序列中1个或多个，优选1个或几个氨基酸发生取代、缺失、插入或添加。

因此，本发明中“编码基本上相同氨基酸序列的基因”中所讲的“基本上”一词表示，不仅包括编码自然界中存在的具有上面定义的KASII酶活性的蛋白质的DNA序列的基因，而且包括编码如上所述变异型KASII酶活性蛋白质的DNA序列的基因，典型的是编码序列号2中所示氨基酸序列或者该序列中1个或多个，优选1个或几个氨基酸发生取代、缺失、插入或附加了的氨基酸的DNA序列的基因。另外，通常情况下DNA链编码具有某种氨基酸序列的多肽的时候，与一个氨基酸对应的基因密码(密码子)有多个存在(简并的变异体)，不用说在编码本发明的KASII酶活性蛋白质的DNA链中亦可应用任意的基因密码。

本发明的基因编码的KASII酶活性蛋白质具有前面所述原本存在于植物和微生物中的脂肪酸合成的链延长酶的功能，更具体地讲，是具有延长脂肪酸(特别是棕榈酸)的链，生成更高级脂肪酸(特别是硬脂酸)的酶活性。本发明蛋白质的典型例是来源于蓝绿藻的蛋白质，但这种来源于蓝绿藻的KASII酶的化学结构与大肠杆菌和大麦的KASI基因编码的蛋白质局部相似，另外与前面所讲的KASII相关的申请公开中来源于蓖麻子的酶也局部相似。本发明的KASII酶活性蛋白质具有如前所述序列号2中所示的氨基酸序列，或者其序列基本上为同一氨基酸序列，并且具有延长脂肪酸(特别是棕榈酸)的链长，生成更高级脂肪酸(特别是硬脂酸)的显著地高酶活性。

获得编码本发明蛋白质的基因的一个手段是根据核酸合成的方法化学合成该链长的至少一部分，但若考虑到结合氨基酸数目的话，优选这样的方法，从天然物质，尤其是从细菌蓝绿藻分离mRNA，由它合成cDNA，从该基因的文库中，用基因工程学领域常用的方法来获得，而非化学合成法。

KASII酶基因可如下获得。

首先，应用众知的方法从高等植物或微生物，特别是从蓝绿藻纯化酶，用肽酶将之片段化，测定该片段的氨基酸序列。接着，合成与测定了氨基酸序列的多肽片段相对应的寡核苷酸。此外，从植物或微生物中提取总RNA，合成与该RNA互补的DNA(cDNA)。将该cDNA连接到象噬菌体λgtll这样的合适的载体中制作cDNA文库。这里用于该基因的筛选方法，可应用常用的众知的方法，例如应用抗体的噬斑杂交法、或集落杂交法等免疫学方法，或应用核苷酸探针进行杂交的方法等。

另外也可这样得到目的序列：在已知的KASII酶或者与之相关的其它同功酶的共同序列的基础上，设计与位于目的序列两端的短DNA序列相对应的引物，以测定全长序列时使用的材料而来的DNA作模板进行PCR。这种情况下为了区别KAS基因的同功酶，例如可通过在大肠杆菌中表达该基因来鉴定活性。

可用通常众知的方法测定和确认如此选拔的克隆中本发明基因的碱基序列。例如可用M13噬菌体通过双脱氧核苷酸链终止法(Sambrook等，分子克隆，第2版(1989))进行。

可用通常众知的手段，如用亚磷酸酯法，利用市售的DNA合成酶合成如上测定了碱基序列的本基因。

另外，为了表达DNA链或其片段，生产其编码的蛋白质或多肽，除与该氨基酸序列相对应的DNA序列(编码区域)外，表达调节序列也是必要的。因此，本发明的DNA链也包括含有这样表达调节序列的DNA序列。该表达调节区域中，尤其是为了在高等植物中表达，重要的是编码区域上游的启动子序列(例如来源于花椰菜花叶病毒的35S启动子)和下游polyA加尾信号(例如来源于胭脂碱合成酶的终止子)。如所得DNA为高等植物的基因组基因的时候，若DNA序列中含有表达调节区域则可直接应用。KASII酶活性蛋白质基因的用途

如前所述，本发明涉及含有上述DNA链或其片段的重组载体以及转入了该基因的细胞。

重组载体是将上述DNA链或其片段连结到载体而形成的，作为载体可应用质粒(例如pET17b)、噬菌体(例如λZAPII)等众知的载体。

通过将该重组载体-DNA转入到如上所述的适宜植物或微生物细胞中进行表达，可在宿主中生产KASII酶。

作为细胞，微生物细胞、植物细胞均可、不考虑生物的种类，但微生物细胞推荐大肠杆菌等，植物细胞为烟草等低温敏感性植物等。把基因转入植物的方法，可用通常的众知的方法，例如可用“PlantMolecular Biology Manual，第2版；S.G.Gelvin和R.A.Schilperoort编，Kluwer Academic Publishers，1995”记载的方法进行。其例子可举出应用病毒的方法，应用土壤杆菌属的方法等生物学方法，电穿孔法、聚乙二醇法、粒子枪法等物理化学方法。

另外，KASII酶是存在于植物叶绿体包膜的蛋白质，因此有必要将编码叶绿体转移肽的DNA链加到KASII酶的上游。其实例为豌豆的核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶的小亚单位基因用作编码转移肽的基因。

本发明的KASII酶活性蛋白质的基因，代表性的编码来源于蓝绿藻组囊藻的KASII酶活性蛋白质(序列号2)的基因(来源于蓝绿藻的基因的DNA序列为序列号1)，通过转化可用于改良植物、微生物的脂质组成，尤其是可用于控制碳原子数16和18的脂肪酸的含量比。

本发明的KASII酶蛋白质作为外来蛋白质在生物体内表达，可使脂肪酸的链长由16碳(棕榈酸)伸长到18碳(硬脂酸)，硬脂酸在生物体内去饱和，不饱和脂肪酸的含量增加。不饱和脂肪酸增加的植物其耐低温性增加(PCT/WO 92/13082，PCT/WO 95/18222)，另外期待不饱和脂肪酸增加的微生物(酵母、大肠杆菌等)对培养应急的耐性增加。

                        实施例

以下列举实施例更详尽地说明本发明，但本发明并不限于这些实施例。实施例1来源于组囊藻的DNA的制备以及DNA文库的制作

用依照Shaw的Plant Molecular Biology 279页(IRL出版，1988)一书中记载的方法配制的大约100ml的BG-11培养基培养组囊藻(分类号：IAM M-6，可从东京大学分子细胞学研究所购入)。25℃、1000lux的荧光灯下每分钟振荡120次，充分培养细菌。室温下500g离心10分钟回收菌体。

分了分离DNA，将沉淀的菌体悬浮到50ml的50mM Tris Cl(pH8.0)，1mM EDTA(A液)中，再次离心，洗净。接着，再悬浮到15ml的50mM Tris Cl(pH8.0)、20mM EDTA、50mMNaCl、0.25M蔗糖的溶液(B液)中，向B液中加入溶解的40mg溶菌酶(Sigma公司)，37℃缓慢振荡。1小时后加入15mg的蛋白酶K和终浓度为1％的SDS，37℃缓慢振荡1晚。次日加入NaClO₄，使浓度为1M，20ml的氯仿/异戊醇(24∶1)，缓慢振荡10分钟，离心，收集水层。用氯仿/异戊醇的提取再重复一次后，加入50ml的乙醇，通过缠绕玻璃棒回收DNA。将DNA溶到20ml A液中，NaCl达到0.1M，加入50mg/ml的RNase，37℃反应1小时。然后，用在A液中饱和了的等量酚提取2次。加入乙醇回收水层中的DNA，用70％的乙醇洗净后，溶到1ml A液中作为DNA溶液。

为了从所得的DNA制作基因组DNA文库，用Sau 3A I部分消化100μg DNA后，依照Sambrook等的方法，通过蔗糖密度梯度离心回收到大约9-23kb的DNA。用Bam HI和Hind III进行酶切，克隆到λDASH II(Stratagene公司的试剂盒)。实施例2  来自蓝绿藻组囊藻的KASII酶相似基因的克隆

将大麦的KASI酶与蓖麻子的KASII酶进行比较，观注二者间同源性高的区域，合成几个短的DNA链(图2)。观察在如下所示的组合反应中，其中与预测的大小相一致的明显的带。1.5′-CC(ACGT)CC(AG)AA(ACGT)CC(AG)AA(ACGT)GA(AG)TT-3′(序列号3)2.5′-GA(AG)GA(AG)GT(ACGT)AA(CT)TA(CT)AT(ACT)AA(CT)GC-3′(序列号4)

其中序列号4是与氨基酸序列EEVNYINA相对应的有义引物，序列号3是编码与氨基酸序列NSFGFGG相对应的反义链的引物。应用有义和反义引物进行PCR反应。反应条件是100μl反应液中加入各20mM的引物、来自组囊藻的DNA 1μg，应用Gene Amp TM反应试剂盒(宝酒造)进行。反应程序为95℃(1分)、50℃(1分)、72℃(2分)为1个循环，进行35个循环。但仅在第1个循环，95℃反应延长到3分，50℃的反应变为37℃。反应终了后，用100μl的氯仿提取，回收水层，然后用100μl的乙醚除去氯仿得到水层，取10μl用2％琼脂糖凝胶电泳进行分析。

结果检测出与预想的大小相同(约330bp)的DNA。将该DNA片段克隆列pCRII载体(Invitrogen公司)中。通过双脱氧法(AppliedBiosystem公司)应用荧光测序仪来检测DNA的碱基序列。用MultiprimeDNA labelling Kit(Amersham公司)将该DNA制作成32P-dCTP标记的探针，用于以下的杂交实验。

用DNA文库的噬菌体感染大肠杆菌P2392，在放入了NZYM培养基直径约15cm的平皿上形成大约1万个噬斑后，转移到尼龙膜上。依照Sambrook等书中的方法(Molecular Cloning：Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)进行杂交。其条件是在由5×SSC(1×SSC：0.15M NaCl，15mM柠檬酸钠)、10mMEDTA、10×Denhardt液(50×Denhardt液：Ficoll(400型，Pharmacia)、聚乙烯吡咯烷酮、牛血清的蛋白(fraction V，Sigma)各10g/L)和250μg/ml鲑鱼精子DNA构成的溶液中，60℃、15个小时。其后，在5×SSC、0.1％ SDS溶液中，45℃、15分钟将膜洗2次，进行放射自显影。将10个阳性克隆纯化后得到噬菌体DNA。用几个限制性酶进行酶切，用琼脂糖凝胶电泳后，按照常规方法进行Southern印迹。按与上述噬斑杂交相同的条件将膜进行杂交，比较杂交的强度和DNA片段的长度。结果，其中2个克隆(λB、F)无论从强度或片段长度哪一些点来考虑均很满意，因此再用几种限制性酶进行酶切，进行Southern杂交。结果，用Sal I进行酶切的时候，检测出约5kbp的杂交片段，因此把它亚克隆到pUC19(宝酒造)的Sal I位点(分别称作pB、pF)。当用限制性酶对各克隆进行更详细的酶谱分析时，发现pB和pF为同一DNA片段，因此按照常规方法用限制性酶对后者制作缺失质粒，对杂交的DNA片段周围边2kbp的DNA链的碱基序列用荧光测序仪进行检测(序列号1)。其中有1251bp组成的开放阅读框架(ORF)，推断是417个残基的氨基酸序列(序列号2)。将该氨基酸序列的同源性与数据库中记录的蛋白质进行比较，结果显示与脂肪酸合成酶有明显的同源性。尤其是与上总DNA研究所制备的集胞藻类PCC6803株的总基因组序列中fabF或J(数据库DDBJ登记号D90905、PID，g1652389)形成的蛋白质显示最大的74％的同源性(图3)。其它的蛋白质中，与来源于蓖麻籽的KASII基因、来源于大麦的KASI基因有43-46％的同源性，另外与来源于大肠杆菌的KASI有35％的同源性。但是由基因的同源性不能判别本ORF的功能对应KASI、II或III哪一个。实施例3  来源于组囊藻的KASII相似基因在大肠杆菌中的活性测定

为了特定上述基因的功能试着在大肠杆菌中表达。首先，为了去除ORF前后多余的DNA序列，制作这样的DNA，N端将Nde I位点转入由DNA合成(Applied Biosystem公司)的起始密码子(ATG)的5′端，而在ORF的在下方转入Hind III位点。1.5′-CGCACATATGACTGAAACCGGACGCC(序列号5)2.5′-CCGCAAGCTTGCAGCAGCGCGTACTGC(序列号6)

以两个合成的DNA作引物，以pF为模板DNA进行PCR反应。反应条件按照Perkin-Elmer公司的手册进行，以94℃(1分)、60℃(1分)、72℃(2分)为一个循环，反应进行30个循环。用NdeI和HindIII酶切反应产物后，将在相同限制性酶切位点预先酶切了的pET17b克隆到大肠杆菌DH5，然后将之克隆到BL21(DE3) plys S(Novagen)。

在加入了100μg/ml氨苄青霉素和30μg/ml氯霉素的75ml LB培养基中培养(32℃)后者的大肠杆菌的重组体，直到培养液的浓度在波长600nm处达到0.5OD。其后，加入终浓度达0.4mM的IPTG，再继续培养2小时。10000×g离心10分钟，从培养液中回收大肠杆菌，在50mMTris HCl(pH7.4)中洗涤细菌，-20℃冻结。在由20mM Tris HCl(ph8.0)、20mM二硫苏糖醇、10mM MgCl₂和1μg/ml DNaseI组成的溶液中，于冰上溶解菌体。其后，10000×g、4℃离心1小时，将上清中的蛋白溶液在聚丙烯酰胺构成10～20％浓度梯度的板电泳胶上进行SDS电泳，用考马斯亮兰染色。结果检测出来源于组囊藻的蛋白质为分子量约50kDa的蛋白质。

至于该大肠杆菌脂肪酸的组成，从上述培养的菌体中将脂肪酸作为甲基酯进行回收、分析。甲基化是将大约5mg的脂质与5％溶于无水乙醇的盐酸1ml一起在封闭的管中在沸水中加热4小时，冷却后，用己烷抽提脂肪酸甲基酯。用氢火焰离子检测器，在毛细柱(聚酯液相；10％ EGSS-X，175℃)上分析甲基化脂肪酸酯。通过与标准甲基化脂肪酸的相对保留时间来测定脂肪酸。结果如下表所示。

              大肠杆菌的脂肪酸组成样品    14∶0  16∶0  16∶1  18∶0  18∶1 16∶0+16∶1/18∶0+18∶1对照       2     37     21     1      38           1.49重组体1    0     24     13     6      57           0.59重组体2    0     21     11     7      62           0.46

结果表明，碳原子数16的脂肪酸(16∶0和16∶1)减少，相反碳原子数18的脂肪酸(18∶0和18∶1)的比例大幅度增加。

                产业上利用的可能性

本发明提供编码以来源于组囊藻的KASII酶所代表的具有β-酮酰基-ACP合成酶II活性的蛋白质的DNA链。如上所述，编码本发明酶蛋白质的基因是KASII酶的基因，它将脂肪酸(尤其是C16的棕榈酸)转变为更高级脂肪酸(尤其是C18硬脂酸)的活性明显的高，通过转化，它有益于植物脂质的改良、微生物脂质的改良、特别是碳原子数16和18的脂肪酸含量比例的调整或不饱和脂肪酸含量的增加。序列表申请人：麒麟麦酒株式会社发明名称：β-酮酰基-ACP合成酶II酶及编码该酶的基因档案号：113702-432申请日期：平成10年1月20日序列数：6序列号：1序列长度：1251序列类型：核酸(DNA)链数：双链拓朴学：直链序列种类：基因组DNA起源：生物名：组囊藻株名：IAM M-6序列ATGACTGAAA CCGGACGCCA GCGTGTTGTT ATTACTGGTT TGGGAGCCAT TACTCCCATC   60GGTAATGATC CAACGGAATA TTGGCAGGGA ATCCTTGCCG GTCGCAACGG CATCGATCTG  120ATTCGGGGCT TTGATGCGTC TCGTCACGCC TGCAAAATTG CCGGGGAGGT CAAGGACTTT  180GACCCCACCC AGTACATGGA CCGCAAGGAT GCTAAGCGGA TGGATCGGTT TGCACAACTG  240GCGGTTGCTG CCAGTCGCCA AGCAGTCGCC GATGCCAAGC TGGACATCAC TGAACTGAAT  300GCGGATGCGA TCGGGGTGCT GATCGGCTCA GGCATTGGTG GTTTGAGGGT GATGGAGGAC  360CAGCAGACGG TTTTGCTGGA AAAAGGCCCC GATCGCTGCA GCCCCTTCAT GGTGCCGATG  420ATGATCGCCA ACATGGCGGC AGGACTGACG GCCATCCAGT TGGGTGCCAA AGGCCCTTGC  480AATGTCACGG TGACTGCTTG CGCTGCGGGT TCTAATGCGG TGGGTGAAGC CTTCCGGCTG  540ATTCAGCACG GCTATGCCCA AGCCATGATC TGTGGCGGAA CTGAATCCTG TGTGACCCCA  600CTGGCTATGG CCGGTTTTGC GGCCTGTAAG GCACTGTCGC TGCGCAACGA TGACCCGGCC  660CATGCTTGCC GTCCCTTTGA CCAAGGCCGT GATGGTTTTG TGATGGGCGA AGGCGCAGGG  720ATTTTGGTCT TGGAATCCTT GGAGCATGCC CAAGCGAGGG GCGCTCACAT CTATGGCGAA  780ATCGTCGGCT ATGGCATGAC CTGTGATGCC TATCACATCA CCTCGCCGGT CCCAGGTGGT  840TTGGGTGCGG CCCGGGCGAT CGAGTTCGGG CTCCGCGATG CCAATCTGCA GCCCAGCCAA  900GTCAGCTACA TCAATGCTCA CGGCACCAGC ACACCGGCCA ACGACAGCAC CGAAACGGCA  960GCTATTAAGA AAGCCCTAGG TGAGCACGCC TACAAAACCG TGATCAGCTC GACTAAGTCG 1020ATGACCGGTC ACCTGTTAGG GGGCTCCGGC GGAATTGAGG CGGTAGCGGC AACCCTCGCG 1080ATCGCTGAGG ACATGGTGCC GCCGACGATT AACCTGGAAG ATCCCGATCC CGATTGCGAC 1140TTGGACTATG TCCCCAATCA GGCGCGATCG CTACCGGTGG AAGTGGCTTT GTCCAATTCC 1200TTCGGCTTTG GTGGGCACAA CGTCACGCTG GCCTTCCGGA AATTCCATCC C          1251序列号：2序列长度：417序列类型：蛋白质拓朴学：直链序列类型：肽起源：生物名：组囊藻株名：IAM M-6表示特征的记号：CDS确定特征的方法：P序列Met Thr Glu Thr Gly Arg Gln Arg Val Val Ile Thr Gly Leu Gly Ala1               5                  10                  15Ile Thr Pro Ile Gly Asn Asp Pro Thr Glu Tyr Trp Gln Gly Ile Leu

         20                  25                  30Ala Gly Arg Asn Gly Ile Asp Leu Ile Arg Gly Phe Asp Ala Ser Arg

     35                  40                  45His Ala Cys Lys Ile Ala Gly Glu Val Lys Asp Phe Asp Pro Thr Gln

 50                  55                  60Tyr Met Asp Arg Lys Asp Ala Lys Arg Met Asp Arg Phe Ala Gln Leu65                  70                  75                  80Ala Val Ala Ala Ser Arg Gln Ala Val Ala Asp Ala Lys Leu Asp Ile

             85                  90                  95Thr Glu Leu Asn Ala Asp Ala Ile Gly Val Leu Ile Gly Ser Gly Ile

        100                 105                 110Gly Gly Leu Arg Val Met Glu Asp Gln Gln Thr Val Leu Leu Glu Lys

    115                 120                 125Gly Pro Asp Arg Cys Ser Pro Phe Met Val Pro Met Met Ile Ala Asn

130                 135                 140Met Ala Ala Gly Leu Thr Ala Ile Gln Leu Gly Ala Lys Gly Pro Cys145                 150                 155                 160Asn Val Thr Val Thr Ala Cys Ala Ala Gly Ser Asn Ala Val Gly Glu

            165                 170                 175Ala Phe Arg Leu Ile Gln His Gly Tyr Ala Gln Ala Met Ile Cys Gly

        180                 185                 190Gly Thr Glu Ser Gys Val Thr Pro Leu Ala Met Ala Gly Phe Ala Ala

    195                 200                 205Cys Lys Ala Leu Ser Leu Arg Asn Asp Asp Pro Ala His Ala Cys Arg

210                 215                 220Pro Phe Asp Gln Gly Arg Asp Gly Phe Val Met Gly Glu Gly Ala Gly225                 230                 235                 240Ile Leu Val Leu Glu Ser Leu Glu His Ala Gln Ala Arg Gly Ala His

            245                 250                 255Ile Tyr Gly Glu Ile Val Gly Tyr Gly Met Thr Cys Asp Ala Ty His

        260                 265                 270Ile Thr Ser Pro Val Pro Gly Gly Leu Gly Ala Ala Arg Ala Ile Glu

    275                 280                 285Phe Gly Leu Arg Asp Ala Asn Leu Gln Pro Ser Gln Val Ser Tyr Ile

290                 295                 300Asn Ala His Gly Thr Ser Thr Pro Ala Asn Asp Ser Thr Glu Thr Ala305                 310                 315                 320Ala Ile Lys Lys Ala Leu Gly Glu His Ala Tyr Lys Thr Val Ile Ser

            325                 330                 335Ser Thr Lys Ser Met Thr Gly His Leu Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ile

        340                 345                 350Glu Ala Val Ala Ala Thr Leu Ala Ile Ala Glu Asp Met Val Pro Pro

    355                 360                 365Thr Ile Asn Leu Glu Asp Pro Asp Pro Asp Cys Asp Leu Asp Tyr Val

370                 375                 380Pro Asn Gln Ala Arg Ser Leu Pro Val Glu Val Ala Leu Ser Asn Ser385                 390                 395                 400Phe Gly Phe Gly Gly His Asn Val Thr Leu Ala Phe Arg Lys Phe His

            405                 410                 415Pro417序列号：3序列长度：20序列类型：核酸(DNA)链数：双链拓朴学：直链序列种类：其它的核酸(合成DNA)序列5-CC(ACGT)CC(AG)AA(ACGT)CC(AG)AA(ACGT)GA(AG)TT-3′                20序列号：4序列长度：23序列类型：核酸(DNA)拓朴学：直链序列种类：其它的核酸(合成DNA)序列5′-GA(AG)GA(AG)GT(ACGT)AA(CT)TA(CT)AT(ACT)AA(CT)GC-3′              23序列号：5序列长度：26序列类型：核酸(DNA)拓朴学：直链序列种类：其它的核酸(合成DNA)序列5′-CGCACATATGACTGAAACCGGACGCC-3′                                    26序列号：6序列长度：27序列类型：核酸(DNA)拓朴学：直链序列种类：其它的核酸(合成DNA)序列5′-CCGCAAGCTTGCAGCAGCGCGTACTGC-3′                                   27