一种治疗急性淋巴样白血病的干细胞制剂及其制备方法

摘要

本发明公开了一种治疗急性淋巴样白血病的干细胞制剂及其制备方法，具体地说所述的干细胞制剂是一种由胚胎干细胞在体外诱导生成的造血干细胞制备而成，所述的干细胞制剂中至少包括（1-5）×10

说明书

技术领域

本发明属于生物医疗技术领域，涉及一种治疗急性淋巴样白血病的干细胞制剂及其制备方法，具体地说所述的干细胞制剂是一种由胚胎干细胞在体外诱导生成的造血干细胞制备而成。

背景技术

白血病是发生在血液中的癌症，可侵及血液、骨髓以及淋巴系统。白血病可以分为急性白血病和慢性白血病，急性白血病可以进一步分为急性骨髓性白血病（AML）和急性淋巴样白血病（ALL）。慢性白血病包括慢性骨髓性白血病（CML）和慢性淋巴样白血病（CLL）。急性淋巴性白血病（ALL）是一类以淋巴母细胞（不成熟的淋巴细胞的前身）失调增生和分化异常或分化受阻，形成大量非成熟白细胞为特征的快速进展型白血病，约占我国儿童期白血病的80%和儿童期全部癌症的25%；在成人中，约占急性白血病的20%。

临床上急性白血病的治疗都需要足量的符合要求的造血细胞，为得到治疗所需要的细胞数量，许多科学家都试图通过体外培养来获得红细胞，主要是通过加入各种细胞因子等，但是目前所采用的方法扩增造血细胞的数量有限，而且得到的造血细胞纯度不高。

造血干细胞(hematopoietic stem cell，HSC)是一种能够分化产生各种血细胞和免疫细胞的细胞，它是当前应用于细胞疗法最多的一类细胞。应用于患有白血病、再生障碍性贫血、重症免疫缺陷征、地中海贫血、急性放射病、恶性实体瘤或者淋巴瘤等造血及免疫系统功能障碍性疾病的患者，它能够发挥功能，重建患者体内的造血功能和免疫系统，提高生存率，从而达到治疗的目的，这就是造血干细胞移植疗法，干细胞移植是当前治疗恶性血液疾病和免疫疾病的最佳手段。目前用于移植的造血干细胞主要有三种来源：骨髓、外周血和脐带血，由于这些组织中造血干细胞含量稀少以及移植排斥等问题的存在，导致90%以上的潜在患者缺乏合适配型的造血干细胞。另外体内来源的造血干细胞在体外培养一段时间后，其治疗功效也会大打折扣。而胚胎干细胞来源的造血干细胞，经体外实验和动物模型实验，已充分证明具有进一步分化为红系细胞、髓系细胞以及淋巴系细胞的潜能，是治疗造血及免疫系统功能障碍性疾病前景看好的细胞来源。研究胚胎干细胞分化为造血干细胞，不仅可作为研究动物的早期造血发生的模型，而且可以增加造血干细胞的来源，并且没有免疫排斥反应。不需要通过基因剔除、治疗性克隆等方法来解决移植排斥的问题，从而为造血干细胞移植的发展扫除了障碍，因此有着重要的研究价值和应用前景。本发明为一种最新型高效的胚胎干细胞分化为造血干细胞的方法，对急性淋巴样白血病的治疗有显著功效。

发明内容

本发明的目的是提供一种治疗急性淋巴样白血病的干细胞制剂，本发明还提供了一种治疗急性淋巴样白血病的干细胞制剂的制备方法。本发明利用人胚胎干细胞诱导生成的造血干细胞制剂通过静脉输注方式移植给急性淋巴样白血病病人，能明显改善急性淋巴样白血病病人的生存率，修复和替换受损细胞，增强代谢功能；具有修复造血微环境，促进白血病病理上恢复，为临床治疗白血病开辟细胞治疗的新途径。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：

一种治疗急性淋巴样白血病的干细胞制剂是由人胚胎干细胞来源的造血干细胞与以浓度比为1-5的血清白蛋白的生理盐水或者将造血干细胞附在与微载体的溶液，优选所述的载体为脂质载体、微胶囊、微球等载体配制而成的。

所述的干细胞制剂中人胚胎干细胞来源的造血干细胞按照（1-5）×10⁶个细胞，与1-5ml牛血清白蛋白BSA或人血清白蛋白HAS和95-99.5ml生理盐水配制而成。用于急性淋巴样白血病的病人进行外周静脉输注的有效剂量为（1-5）×10⁶/次。该有效剂量是通过大量动物模型试验取得治疗效果以及临床实验而确定的。

所述的造血干细胞由人胚胎干细胞经体外诱导分化培养而成。

所述的胚胎干细胞是早期胚胎（原肠胚期之前）或原始性腺种分离出来的一类细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。

所述的造血干细胞活力保持在90%以上。

一种治疗急性淋巴样白血病的干细胞制剂的制备方法，主要包括以下步骤：胚胎干细胞的传代培养，造血细胞拟胚体的形成，人胚胎干细胞向造血干细胞分化，造血干细胞的培养和传代及检测，干细胞制剂的制备；其中所述的胚胎干细胞的传代培养的步骤具体为：常规培养胚胎干细胞进行传代和扩增，此阶段培养基为：85%DMEM培养基为基础培养基，添加15%胎牛血清或血清替代品，1mmol/L必需氨基酸，50IU/mL青霉素，10μg/mL 链霉素和4ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子。

所述的造血细胞拟胚体的形成：在传代培养6~7天对胚胎干细胞进行诱导，用1mg/mL Ⅳ型胶原酶吹打成小细胞团，然后使用超低黏附6孔培养板悬浮7天，每2天换液一次，在拟胚体（EBs）形成阶段在拟胚体形成阶段80%DMEM培养基为基础培养基，添加20%胎牛血清或血清替代品，1mmol/L必需氨基酸，50IU/mL青霉素，10μg/mL 链霉素，并同时添加4种定量的制剂，在EB培养的第5~7 天分别加入0.1mM的丝裂霉素、1×10⁴mol/L的维生素C、2mM的L-谷氨酰胺和0.1mM的β-巯基乙醇（β-ME）。

所述的人胚胎干细胞向造血干细胞分化的步骤具体为：拟胚体培养7 天后，在显微镜下观察是否有红细胞出现，红细胞团用拉细的玻璃吸管机械切割并进行单细胞传代培养。

所述的造血干细胞的培养和传代及检测的步骤具体为：将上述成功诱导生成的造血干细胞消化、终止消化反应，进行传代培养并进行流式细胞仪检测阳性标记物CD34并达到99%以上，此阶段培养基为85%DMEM培养基为基础培养基，添加15%胎牛血清或血清替代品，1mmol/L必需氨基酸，50IU/mL青霉素，10μg/mL 链霉素。

所述的干细胞制剂的制备的步骤具体为：按照注射剂的制备方法将上述造血干细胞加牛血清白蛋白BSA或人血清白蛋白HAS和生理盐水或者将造血干细胞附在与微载体的溶液，按照一定比例定容配制而成制成细胞悬液注射剂即干细胞制剂。

本发明的优点在于：

（1）本发明中将胚胎干细胞形成拟胚体进而定向分化生成造血干细胞的方法进行了创新且具有较高的成功率，在本条件下的诱导成功率能够达到90%以上。

（2）本发明中用胚胎干细胞诱导拟胚体形成阶段，所使用的诱导因子以及剂量和诱导时间为首创。诱导因子为丝裂霉素、维生素C、L-谷氨酰胺和β-巯基乙醇(β-ME)，添加剂量分别是丝裂霉素0.1mM、维生素C1×104mol/L、L-谷氨酰胺2mM和β-ME0.1mM，添加时间为拟胚体培养的第5~7 天。

（3）本发明中所诱导生成的造血干细胞对淋巴样白血病细胞株Jurkat的生存具有显著的消亡作用。

（4）本发明选择胚胎干细胞，由于国家计划生育的国策，因此来源广泛；制备体系成熟易于控制，且诱导条件及诱导因子明确，具有较强的可复制率。

（5）本发明所形成的干细胞制剂为注射液，成分清晰，经严格标准化检测，可用于临床，安全可靠。

（6）本发明所生成的造血干细胞，在临床应用上具有很大的优势。它既具有高度自我更新能力，又具有进一步分化各系统祖细胞的能力。由于无免疫原性，无免疫排斥反应，不会发生移植物抗宿主病；能快速修复骨髓抑制现象，使血象恢复正常；抗放射反应能力强；提升免疫及造血功能；受体内植入率高，病灶处归巢迅速；静脉注射能很容易被患者接受。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施案例并配合附图详细说明如后。本发明的具体实施方式由以下实施例及其附图详细给出。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是一种治疗急性淋巴样白血病的干细胞制剂的制备流程图；

图2是hUC-HSCs和Jurkat白血病细胞的形态学特征在倒置显微镜(原始放大：×100)；其中图2A：hUC-HSCs生长初始阶段，图2B：hUC-HSCs的传代培养，图2C：Jurkat细胞与hUC-HSC细胞共生培养；

图3是影响hUC-HSCs细胞与 Jurkat白血病细胞的细胞周期分布图；其中图3A：有或没有hUC-HSCs 以及Jurkat细胞培养，分析了细胞周期进程，图3B：结果显示直方图代表3个独立的实验的循环图以及细胞在每一个生长阶段的百分比图示，3个细胞周期独立测量：细胞HSCs单独培养，细胞Jurkat 单独培养，细胞Jurkat 与细胞HSCs共生培养；

图4是添加不同剂量胚胎造血干细胞对大鼠血液指标的影响，其中：图中相同字母或者不标表示组间差异不显著，不同字母表示组间差异显著或者极显著；

图5是添加不同剂量胚胎造血干细胞对大鼠涂片指标的影响，其中：图中相同字母或者不标表示组间差异不显著，不同字母表示组间差异显著或者极显著。

具体实施方式

下面将参考附图并结合实施例，来详细说明本发明，但本发明不受限于下述实施案例。

具体实施例1：干细胞制剂的制备实验

一种治疗急性淋巴样白血病的干细胞制剂的制备方法，主要包括以下步骤：人胚胎干细胞的传代培养，造血干细胞拟胚体的形成，人胚胎干细胞向造血干细胞分化，造血干细胞的培养和传代及检测，干细胞制剂的制备，其流程图如图1所示。

（1）人胚胎干细胞的传代培养

常规培养胚胎干细胞进行传代和扩增，此阶段培养基为：85%DMEM培养基为基础培养基，添加15% Knockout Serum Replacement(SR，Gibco/BRL)，1mmol/L必需氨基酸(Gibco/BRL)，50IU/mL青霉素，10μg/mL 链霉素和4ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，Invitrogen 公司)。细胞培养在37℃，5%的二氧化碳条件下孵化，每周传代一次。

（2）造血干细胞拟胚体的形成

为了诱导人胚胎干细胞向造血细胞的分化，在培养6~7天对胚胎干细胞进行诱导。用1mg/mL Ⅳ型胶原酶(Gibco/BRL)在37℃下消化3~5min 吹打成小细胞团, 然后使用超低黏附6孔培养板(Corning Inc)悬浮7天，每2天换液一次。诱导培养液与培养干细胞的培养液为含培养基为80%DMEM，20%胎牛血清或血清替代品(serum replacement，SR)，1mmol/L必需氨基酸(Gibco/BRL)，50IU/mL青霉素，10μg/mL 链霉素，不加bFGF。4种制剂在拟胚体(embroidbody，EB)形成阶段添加于含胎牛血清培养基中，加入的浓度及时间见表1。

表1 拟胚体阶段所使用的诱导剂浓度以及添加时间

化学试剂浓度时间（EB培养时间）丝裂霉素0.1mM第5~7 天维生素C1×10⁴mol/L第5~7 天L-谷氨酰胺2mM第5~7 天β-ME0.1mM第5~7 天

 （3）人胚胎干细胞向造血干细胞分化

7天后，培养的EBs 移至0.1%明胶包被的96 孔组织培养板，每孔接种1~2 EBs。各种条件均为3次重复，即3板平行。培养液为含培养基为85%DMEM和15%胎牛血清或血清替代品培养液，其中添加50IU/mL青霉素，10μg/mL 链霉素，两天更换一次。贴壁培养后，每天在光学显微镜下观察培养皿中是否有红细胞出现，红细胞出现被认为是成功分化的造血细胞的功能标志，部分红细胞团用拉细的玻璃吸管机械切割并进行单细胞传代培养。

（4）造血干细胞的培养和传代及检测

将上述成功诱导生成的造血干细胞消化、终止消化反应，进行传代培养并进行流式细胞仪检测阳性标记物CD34并达到99%以上，此阶段培养基为85%DMEM培养基为基础培养基，添加15%胎牛血清或血清替代品，其中添加50IU/mL青霉素，10μg/mL 链霉素。取生长良好的第三代细胞进行检测：收集第三代细胞，1500rpm离心10min，弃上清，加PBS溶液重悬，吸取100μL细胞悬液（约3×10⁵个细胞）加入EP管内，按量分别加入检测抗体；避光孵育30min，每样品管加入2mlPBS洗一次，1500rpm离心5min；弃上清，每样品管加300μLPBS溶液重悬，进行流式检测。

结果表明，培养的细胞经流式细胞仪检测，阴性对照：0.07%；阳性表达：CD34为99.47%，CD90为96.32%；阴性表达：CD38为1.81%、CD44为0.01%，本发明中所述细胞群高表达是指阳性率≥98%，不表达或者低表达是指阳性率＜2% 。

（5）干细胞制剂的制备

分别取培养成功的造血细胞1×10⁶个细胞、3×10⁶个细胞、5×10⁶个细胞，与0.05ml牛血清白蛋白BSA或人血清白蛋白HAS和0.95ml生理盐水配制成胚胎造血干细胞制剂1ml。用于急性淋巴样白血病的病人进行外周静脉输注，体外移植后可迅速到达受损的血液组织，对此类白血病的治疗有显著功效。

具体实施例2：CEM细胞系（人淋巴细胞白血病细胞系）白血病大鼠造模实验

诱导模型：雄性SD大鼠CEM细胞系诱导模型

模型动物预处理：取周龄在5－6周左右的SD雄性大鼠在相对干净的层流架鼠筐内饲养。鼠舍空气要经过中效的过滤后给小鼠饲酸性水（Ph约为3－4）。给予复合性维生素B标准饲料，垫料等一切与老鼠接触物品都经过灭菌处理。

人白血病细胞系培养：取CEM细胞系（人淋巴细胞白血病细胞系）和J6-1细胞系加入RPMI1640培养基（含15％灭活的新生牛血清，青霉素100U，链霉素100ug/ml，谷氨酰胺30ug/ml）并放入5％二氧化碳温箱中培养。

动物模型的制备：SD大鼠经铯137照射，300CGy或不经任何处理，将移植CEM细胞，J6-1细胞系在其对数生长期内接种到腹腔。每只接种两百万个到一千五百万个。接种前后分别在第7、14、21和28天对小鼠外周血白细胞计数，计算白细胞≥ 3×109/L，中性粒细胞>1.5×109/L以上，说明雄性SD大鼠CEM细胞系诱导模型造模成功。

具体实施例3：人胚胎来源的造血干细胞静脉输注实验

剂量：细胞输入组分为3个剂量组，每组五只实验鼠，分别给予0.1×10⁶个细胞/ml/次（A组）、0.3×10⁶个细胞/ml/次（B组）、0.5×10⁶个细胞/ml/次（C组）的细胞剂量，均为1次输注。另外设一组造模成功的对照组，对照组同样也是五只实验鼠。

途径：尾静脉

治疗时机：为4周造模成功后停止引用造模用水1周开始使用本发明制剂。

效果评价：（1）精神状态、行为能力：模型组大鼠与不同剂量的细胞输注组。

         （2）血液指标：细胞移植后第28天移植组、模型对照组及细胞输注组大鼠全部处死，右心室采血5-10ml，用全自动生化分析仪检测血液指标。结果表明，胚胎造血干细胞移植在治疗4周后基本接近正常，其中C组剂量即0.5×10⁶个细胞/ml/次（C组）的细胞剂量效果最好，模型对照组血液指标均未能恢复。具体指标详见图4所示。

（3）形态学检查/细胞化学检查：骨髓涂片采用常规瑞氏染色，分析200个细胞，并做过氧化物酶、非特异性醋酶染色及氟化钠抑制试验和糖原染色等细胞化学检查。血涂片采用常规瑞氏染色，分析100个细胞。结果显示：胚胎造血干细胞移植在治疗4周后基本接近正常，其中C组剂量即0.5×10⁶个细胞/ml/次（C组）的细胞剂量效果最好，模型对照组血液指标均未能恢复，其中模型组淋巴系（%）仍在50%以上，原幼淋（%）大于3%，仍为淋巴细胞白血病状态。具体指标详见图5所示。

（4）统计学分析：所有剂量资料以均值±标准误（means±SEM）表示，进行ANOVE分析，计数型资料用Fishers精准概率检验分析。

上述利用本发明所述的人胚胎来源的胚胎干细胞制剂的尾静脉输注大鼠血液模型的实验证明，将人胚胎来源的造血干细胞移植到白血病模型的大鼠，能明显提高模型大鼠的生存能力，调理受损血液组织微环境、促进血液再生和功能的恢复。能够阻滞和逆转白血病的进程，改善全身状态和血液状态促进白血病的恢复。

具体实施例4：人胚胎来源的造血干细胞植入血液证据实验

人胚胎来源的造血干细胞植入血液证据：取12只大鼠，分为4组，每组3只，4组大鼠分别荧光示踪移植后2天、4天、7天和14天的细胞定位，用于示踪的细胞经携带红色荧光（RFP）的慢病毒感染后以0.3×10⁶/ml/次的剂量输注给白血病大鼠模型。在移植后的第2、4、7、14天，均在血液中看到特异的红色荧光信号标记，证明人胚胎来源的造血干细胞已经植入实验动物血液中。

具体实施例5：人胚胎来源的造血干细胞 与淋巴样白血病细胞株Jurkat体外增殖和存活能力的实验

由实施例1成功培养出的胚胎造血干细胞，将其作为基质细胞与淋巴样白血病细胞株Jurkat 细胞进行直接接触共培养。通过免疫磁珠法分离共培养体系中的Jurkat细胞，流式细胞术检测Jurkat细胞增殖能力、细胞周期和自发凋亡率的变化；Western blotting法检测共培养后Jurkat细胞内Notch信号通路的活化状况。结果共培养4 d后，Jurkat白血病细胞的增殖减缓、细胞周期被阻滞于G0/G1期，而其自发凋亡率则出现显著下降。结论胚胎造血干细胞构成的微环境对Jurkat白血病细胞有消亡作用。具体结果如图2和图3所示。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。