具有增强的L-色氨酸生产力的大肠杆菌微生物以及使用其生产L-色氨酸的方法

摘要

本发明涉及具有增强的L-色氨酸生产力的大肠杆菌微生物以及使用其生产L-色氨酸的方法。更特别地，本发明涉及大肠杆菌突变株，其中色氨酸操纵子的阻遏和弱化子调控被解除并且邻氨基苯甲酸的积累被减少，从而增强了L-色氨酸生产力。本发明还涉及使用所述大肠杆菌突变株生产L-色氨酸的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及具有增强的L-色氨酸生产力的埃希氏菌属的微生物，以 及使用其生产L-色氨酸的方法。

背景技术

必需氨基酸L-色氨酸已被广泛用作饲料添加剂、用于医疗药品诸如 输注溶液的原料、以及用于健康食品的材料，并已经通过化学合成、酶促 反应、发酵等生产。

近来，主要通过微生物发酵进行L-色氨酸的生产。在工业化初始阶 段，已经主要使用的是经化学突变获得的类似物抗性菌株。然而，由于 20世纪90年代基因重组技术的快速发展并在分子水平理解了调控机制， 已经主要使用经基因工程技术获得的重组大肠杆菌(E.coli)和棒状杆菌 (Corynebacterium)菌株。

通过微生物生产色氨酸是从PEP(磷酸烯醇式丙酮酸 (PhospoEnolPyruvate))与E4P(赤藓糖-4-磷酸 (Erythrose-4-Phosphate))的聚合产生的DAHP(3-脱氧D-阿拉伯庚酮 糖酸-7-磷酸(3-DeoxyD-arabino-heptulosonate-7-phosphate))起始的， PEP是糖酵解(glycolysis)的中间产物，E4P是磷酸戊糖途径的中间产 物。然后，从分支酸(chorismate)经共同的芳香族生物合成途径来生物 合成色氨酸。具体地，色氨酸的合成通过trpE基因编码的邻氨基苯甲酸 合酶(anthranilate synthase，EC 4.1.3.27)，trpD基因编码的邻氨基苯甲 酸合酶(anthranilate synthase，EC 4.1.3.27)和邻氨基苯甲酸PRPP转移 酶(anthranilate PRPP transferase，EC 2.4.1.28)，trpC基因编码的吲哚 -3-甘油磷酸合酶(indole-3-glycerol phosphate synthase，EC 4.1.1.48)和 磷酸核糖基邻氨基苯甲酸异构酶(phosphoribosylanthranilate isomerase， EC 5.3.1.24)，以及trpB基因和trpA基因编码的色氨酸合酶(tryptophan  synthase，EC 4.2.1.20)。介导上述反应的基因簇trpEDCBA位于染色体 中并具有含单一调控区的操纵子结构。

色氨酸操纵子主动转录以产生细胞所需的足够量的色氨酸。然而，如 果细胞中的色氨酸水平高了，则阻遏物(repressor)就结合到色氨酸上， 然后通过阻遏物结合到操纵子调控区而使色氨酸操纵子失活，从而抑制转 录。

此外，用于生物合成氨基酸(诸如苏氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、色氨 酸和组氨酸)的操纵子有另一种调控机制，被称为弱化(attenuation)(J  Bacteriol.(1991)173，2328-2340)。如本领域关于弱化所已知的，在氨基酸 不足的情况下，mRNA中与染色体上操纵子中启动子与第一基因之间的 特定序列区相对应的结构变成有利于翻译过程的结构以促进生物合成基 因的表达，但是在氨基酸丰富的情况下，短的转录mRNA形成称为“发 夹结构(hairpin structure)”的三维结构以抑制翻译过程(J Biol Chem.， (1988)263：609-612)。

在L-色氨酸生产菌株的初始开发阶段，主要目的是通过增强酶活性 来提高效率，或者通过解除由终产物色氨酸引起的对色氨酸生物合成途径 酶的反馈抑制，或者通过增加染色体上或者载体形式的色氨酸操纵子基因 的拷贝数以增强色氨酸生物合成酶的表达(Appl.Environ.Microbiol.， (1982)43：289-297；Appl.Microbiol.Biotechnol.，(1993)40：301-305； Trends Biotechnol.，(1996)14：250-256)。

赋予微生物L-色氨酸生产能力的方法包括经化学突变赋予对色氨酸 类似物或作为中间产物的邻氨基苯甲酸抗性的方法，或者经基因工程修饰 微生物的方法。化学突变方法的实例包括韩国专利注册号1987-0001813、 韩国专利注册号0949312等中描述的那些方法，基于基因工程的修饰方法 的实例包括使用以下菌株的各种方法，通过增强芳香族氨基酸生物合成途 径中编码转酮醇酶(transketolase)的tktA基因或编码半乳糖透性酶 (galactose permease)的galP基因以增加E4P(赤藓糖-4-磷酸 (Erythrose4-phosphate)或PEP(磷酸烯醇式丙酮酸 (phosphoenolpyruvate))的供应以及通过减少DAHP(3-脱氧-D-阿拉伯 庚酮糖酸-7-磷酸(3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate))的反 馈抑制以增强芳香族生物合成途径而获得的菌株(Trends Biotechnol.， (1996)14：250-256，Microbial Cell Factories(2009)8：19)，或者通过另外引 入色氨酸操纵子基因到载体或染色体中而获得的菌株(Appl.Environ. Microbiol.，(1982)43：289-297，Appl.Microbiol.Biotechnol.， (1993)40：301-305)。

然而，虽然引入色氨酸操纵子并解除生物合成酶的反馈抑制，但由于 调控机制(例如转录水平的操纵子基因的抑制或弱化的缘故)，这些方法 未能实现色氨酸产量的增加。

发明内容

技术问题

本发明人已开发了使L-色氨酸生产菌株在转录水平解除色氨酸操纵 子基因的抑制或弱化的方法，以及能够使用其增强色氨酸生物合成酶的方 法。此外，为解决当增强色氨酸操纵子时由于邻氨基苯甲酸积累而导致色 氨酸生产菌株产量不增加的问题，本发明人已通过表达色氨酸操纵子基因 中除编码邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase，TrpE)的基因以外 的基因簇，以对调控机制(诸如反馈抑制或抑制机制)脱敏的形式构建了 具有增加的产量和低水平的邻氨基苯甲酸积累的色氨酸生产菌株。

本发明的一个目的是提供具有增强的L-色氨酸生产力的埃希氏菌 (Escherichia)属微生物，其通过修饰而对色氨酸操纵子的抑制或弱化脱 敏并减少邻氨基苯甲酸的积累。

本发明的另一目的是提供使用所述埃希氏菌属微生物生产L-色氨酸 的方法。

技术方案

为实现以上目的，本发明的一个实施方案提供了具有增强的L-色氨 酸生产力的埃希氏菌属重组微生物，其已被修饰为缺失内源色氨酸操纵子 的表达调控区中前导肽(leader peptide)的部分或全部，所述表达调控区 具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列，所述前导肽具有SEQ ID NO：2所 示核苷酸序列。

本发明的另一实施方案还提供了生产L-色氨酸的方法，其包括培养 上述埃希氏菌属的重组微生物。

有益效果

根据本发明产生的重组微生物消除了其中邻氨基苯甲酸的过度积累， 并且可有利地用于以高产率生产L-色氨酸。

附图说明

图1示出了表示大肠杆菌染色体中的色氨酸操纵子基因、所述基因的 调控区以及本发明所述的基因缺失形式的示意图。

A)大肠杆菌染色体中的色氨酸操纵子基因及其调控区(Ptrp)；

B)Ptrp形式；

C)缺失了编码前导肽的trpL基因的形式(DtrpL)；以及

D)缺失了编码前导肽和弱化子的trpL基因的形式(Dtrp_att)。

图2示出了用于测量色氨酸操纵子表达调控区强度的pCL-GFP载 体。

图3示出了用于将色氨酸生物合成基因trpDCBA引入到染色体中以 增加基因拷贝数的载体pINT17E-Patt-trpDCBA。

发明方式

以下将详细描述本发明。

本发明的一个实施方案提供了具有增强的L-色氨酸生产力的埃希氏 菌属重组微生物，其已被修饰为缺失了内源色氨酸操纵子的表达调控区中 前导肽的部分或全部，所述表达调控区具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序 列，所述前导肽具有SEQ ID NO：2所示核苷酸序列。

本文使用的术语“色氨酸操纵子(tryptophan operon)”或“Trp操 纵子(Trp operon)”意指包括所有trpEDCBA基因的整个操纵子。所述 色氨酸操纵子具有SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列。

本发明中可使用的L-色氨酸生产微生物可以是任何原核或真核微生 物，只要它们具有L-色氨酸生产力。该微生物的实例可包括属于埃希氏 菌(Escherichia)属、欧文氏菌(Erwinia)属、沙雷菌(Serratia)属、 普罗威登斯菌(Providencia)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属以及 短杆菌(Brevibacterium)属的微生物。特别地，所述微生物是属于埃希 氏菌属的微生物，更特别地是大肠杆菌。最特别地，本发明的大肠杆菌菌 株可以是通过以下方式获得的菌株：增强色氨酸生物合成酶(诸如邻氨基 苯甲酸合酶(TrpE)、邻氨基苯甲酸PRPP转移酶(TrpD)、磷酸核糖邻 氨基苯甲酸异构酶(TrpC)或色氨酸合酶(TrpA，TrpB))的活性同时维 持解除了反馈抑制的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶(aroG)，增 强芳香族生物合成途径酶(诸如3-脱氢奎尼酸合酶(aroB)、莽草酸脱氢 酶(aroE)、莽草酸激酶(aroL)、5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(aroA) 或分支酸合酶(aroC))的活性，增强磷酸甘油酸脱氢酶(serA)或转酮 醇酶(tktA)的活性以增强色氨酸生物合成途径中间产物丝氨酸和PRPP 的供应。此外，本发明的大肠杆菌菌株可以是通过失活芳香族生物合成途 径的预苯酸脱水酶和分支酸变位酶(pheA)的活性或者失活预苯酸脱氢 酶、分支酸变位酶(tyrA)，色氨酸酶(tnaA)和色氨酸转运蛋白(tnaB， mtr)的活性而获得的菌株。

更特别地，本发明的重组微生物是重组大肠杆菌菌株CA04-2004(登 记号KCCM11246P)。

本文使用的术语内源色氨酸操纵子的“表达调控区(expression  regulatory region)”意指包括启动子(promoter)、前导肽(leader peptide) 和内源弱化子(attenuator)的区域。特别地，所述表达调控区具有SEQ  ID NO：1所示的核苷酸序列。

本文使用的术语“前导肽(leader peptide)”意指由基因起始密码子 上游前导序列所编码的低分子量肽。特别地，所述前导肽具有SEQ ID  NO：2所示的核苷酸序列，由前导肽表达的多肽可以是SEQ ID NO：4 所示的氨基酸序列。该前导肽的功能是在色氨酸浓度高时形成发夹结构从 而促进内源弱化子的结构形成以终止色氨酸生物合成基因的转录。

本文使用的术语“缺失(delete)”意指从染色体上去除从靶基因起始 密码子到终止密码子的核苷酸序列、或者其调控区的核苷酸序列的部分或 全部。

本发明的一个方面也提供了埃希氏菌属的重组微生物，其已被进一步 修饰为缺失了内源弱化子的(attenuator)部分或全部以增强其L-色氨酸 生产能力，所述内源弱化子具有SEQ ID NO：3所示核苷酸序列。

本文使用的术语“内源弱化子(endogenous attenuator)”意指导致 弱化机制的具有SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的区域，其不包括表达调 控区的启动子和前导肽。

本发明的一个方面也提供了埃希氏菌属的微生物，其已被进一步修饰 为增强由色氨酸操纵子编码的蛋白质的活性。

本发明的一个方面也提供了埃希氏菌属的微生物，其已被进一步修饰 为增强由排除了编码邻氨基苯甲酸合酶的trpE基因的色氨酸生物合成基 因簇trpDCBA所编码的蛋白质的活性。

本文使用的术语“色氨酸生物合成基因簇(tryptophan biosynthetic  gene cluster)”意指由色氨酸操纵子基因trpE、trpD、trpC、trpB和trpA 的两种或更多种的组合所组成的基因簇。特别地，色氨酸生物合成基因簇 可以是具有SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的trpDCBA基因簇。其中， trpD基因编码具有SEQ ID NO：37所示氨基酸序列的蛋白质；trpC基 因编码具有SEQ ID NO：38所示氨基酸序列的蛋白质；trpB基因编码具 有SEQ ID NO：39所示氨基酸序列的蛋白质；而trpA基因编码具有SEQ  ID NO：40所示氨基酸序列的蛋白质。

对除了色氨酸操纵子中由trpE基因编码的邻氨基苯甲酸合酶以外的 色氨酸生物合成基因簇的活性进行增强来解决当增强色氨酸操纵子时由 于邻氨基苯甲酸的积累导致色氨酸产量不增加的问题。

增强所述基因之表达的方法包括：1)增加所述基因的染色体或细胞 内拷贝数的方法；或2)用强的外源启动子替换所述基因的染色体启动子 或者修饰染色体启动子为强启动子的方法。

增加拷贝数的方法的实例包括将基因引入载体以增强基因表达的方 法。本发明中可以使用的载体的实例包括质粒载体，例如pBR、pUC、 pBluescriptII、pGEM、pTZ、pCL和pET型质粒。本发明可使用的载体 不特别限定，可以使用任何已知的表达载体。特别地，可以使用 pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118 或pCC1BAC载体。最特别地，可以使用pACYC177、pCL和pCC1BAC 载体。

同时，本发明可使用的外源启动子的实例包括但不限于已知启动子， 诸如trc、lac和tac启动子。此外，如上所述，可以通过缺失前导肽的部 分或全部和/或进一步缺失内源弱化子的部分或全部来修饰染色体启动子 为强启动子，但并不限于此。

在本发明的一个特定实施方案中，埃希氏菌属重组L-色氨酸生产微 生物是通过缺失内源色氨酸操纵子上具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列 的表达调控区中具有SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的前导肽的部分或全 部，并且缺失具有SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的内源弱化子的部分或 全部以提高生产L-色氨酸的能力而产生。此外，通过进一步增强具有SEQ  ID NO：37、38、39和40所示氨基酸序列的蛋白质的活性产生重组L- 色氨酸生产微生物，其由排除了编码邻氨基苯甲酸合酶的trpE基因的色 氨酸生物合成基因簇trpDCBA所编码。将所产生的重组微生物保藏为登 记号KCCM11246P。

本发明的另一实施方案还提供了生产L-色氨酸的方法，其包括培养 具有增强的L-色氨酸生产力的埃希氏菌属重组L-色氨酸生产微生物。

在一个特定方面，本发明提供了一种方法，其包括培养具有增强的 L-色氨酸生产力的埃希氏菌属重组L-色氨酸生产微生物，其已被修饰为 缺失了内源色氨酸操纵子上具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的表达调 控区中具有SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的前导肽的部分或全部，并缺 失了具有SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的内源弱化子的部分或全部以增 强L-色氨酸生产能力，并且通过增强已排除编码邻氨基苯甲酸合酶的 trpE基因的色氨酸生物合成基因簇trpDCBA的表达来进一步增强色氨酸 操纵子所编码的蛋白质的活性。

本发明微生物培养中使用的培养基和培养条件可以是用于属于埃希 氏菌属微生物培养的培养基和培养条件中任意那些，但是这些培养基和培 养条件合适地满足本发明微生物的需求。特别地，可以在含有合适的碳源、 氮源、氨基酸、维生素等的常规培养基中于好氧条件下同时调节温度、pH 等培养本发明的微生物。

可用于本发明的碳源包括碳水化合物，诸如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦 芽糖、甘露糖醇、山梨糖醇；醇类，诸如糖醇、甘油、丙酮酸、乳酸和柠 檬酸；以及氨基酸，诸如有机酸、谷氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸。此外，可 以使用天然有机营养源，诸如淀粉水解物、糖蜜、赤糖糊、米糠、木薯、 甘蔗渣和玉米浆。特别地，可以使用碳水化合物，诸如葡萄糖和灭菌预处 理的糖蜜(即转化为还原糖的糖蜜)。此外，可以不受限制地使用合适量 的其它碳源。

可用于本发明的氮源包括无机氮源，诸如氨、硫酸铵、氯化铵、乙酸 铵、碳酸铵和硝酸铵；氨基酸，诸如谷氨酸、甲硫氨酸和谷氨酰胺；以及 有机氮源，诸如蛋白胨、NZ胺、肉提取物、酵母提取物、麦芽提取物、 玉米浆、酪蛋白水解物、鱼粉或其消化产物、脱脂大豆饼或其消化产物等。 可以单独或组合使用这些氮源。

培养基可含有磷酸二氢钾、磷酸氢二钾以及相应的含钠盐作为磷源。 可用于本发明的无机化合物包括氯化钠、氯化钙、氯化铁、硫酸镁、硫酸 铁、硫酸锰和碳酸钙。此外，培养基可含有氨基酸、维生素和合适的前体。 这些来源或前体可以以分批或连续方式添加到培养基中。

诸如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸和硫酸的化合物可以在培养期间 以合适方式添加至培养基以调节培养基的pH。此外，在培养期间，可以 使用消泡剂(诸如脂肪酸聚乙二醇酯)来抑制气泡的形成。进一步地，为 保持培养基的好氧状态，可将氧气或含氧气体注入培养基中。此外，为保 持培养基的厌氧或无氧状态，不注入气体，或者可以将氮气、氢气或二氧 化碳气体注入培养基中。

通常将培养基保持在27℃至37℃，特别是30℃至35℃的温度范 围。微生物的培养可持续直至获得期望水平的有用物质。特别地，培养周 期可以是10至100小时。

本发明的方法可进一步包括纯化或回收培养步骤中产生的L-氨基 酸。纯化或回收过程可以通过使用合适的方法(例如分批、连续或分批补 料的培养方法)从培养基中纯化或回收所述期望的L-氨基酸来进行。

在下文中，将参照实施例进一步详细描述本发明。然而能够理解的是， 这些实施例是用于说明目的，而非旨在限制本发明的范围。

实施例

实施例1：包含GFP和去除前导肽的表达调控区的融合载体的构建以解除色氨酸生物合成的表达调控

如图1所示，在由启动子(P)、前导肽(L)和弱化子(A)构成的 色氨酸操纵子的表达调控区中，为扩增包含编码前导肽(L)之trpL基 因的缺失的表达调控区(该表达调控区在下文中称为“DtrpL”，对应于 图1C)，使用大肠杆菌W3110菌株(购自美国典型微生物菌种保藏中心 (American Type Culture Collection)：ATCC)；GenBank登记号 AC000091)的染色体DNA作为模板进行聚合酶链式反应(polymerase  chain reaction)(在下文中称为“PCR”)。

具体地，使用引物1和2用Pfu聚合酶在以下条件下通过PCR扩增 5’区具有KpnI限制性内切酶位点的155bp片段：30个循环，每个循环 由94℃变性1分钟、58℃退火30秒以及72℃延伸30秒组成。同时， 使用引物3和4在上述条件下通过PCR扩增3’区具有EcoRV限制性内 切酶位点的105bp片段。使用GeneAll^R Expin^TM GEL SV试剂盒(韩国 首尔)回收所获得的DNA片段，然后用作交叉PCR的模板。

为制备DtrpL，使用两个DNA片段作为模板以及引物1和4进行交 叉PCR。具体地，在上述条件下通过PCR扩增245bp片段(SEQ ID NO： 5)。用限制性内切酶KpnI和EcoRV处理扩增片段，然后与经同样限制 性内切酶处理的pCL1920GFP(SEQ ID NO：8)连接(ligation)，从而 构建pCL-DtrpL_GFP。

为扩增在色氨酸操纵子表达调控区中包含编码前导肽(L)和弱化子 (A)之基因的缺失的表达调控区(该表达调控区在下文中称为 “Dtrp_att”)，使用大肠杆菌W3110菌株的染色体DNA作为模板以及引 物1和5通过PCR扩增5’区具有KpnI限制性内切酶位点和3’区具有 EcoRV限制性内切酶位点的148bp片段(SEQ ID NO：6)。用限制性内 切酶KpnI和EcoRV处理扩增片段，然后与经同样限制性内切酶处理的 pCL1920GFP连接，从而构建pCL-Dtrp_att-GFP。

此外，为制备在后续实验中用作对照的具有野生型表达调控区的载 体，使用大肠杆菌W3110菌株的染色体DNA作为模板以及引物1和4通 过PCR扩增5’区具有KpnI限制性内切酶位点和3’区具有EcoRV限制性 内切酶位点的290bp片段。用限制性内切酶KpnI和EcoRV处理扩增片 段，然后与经同样限制性内切酶处理的pCL1920GFP连接，从而构建 pCL-Ptrp-GFP。

引物1

5′TTAGGTACCGGCGCACTCCCGTTCTGGATA 3′(SEQ ID NO 11)

引物2

5′ACTGCCCGTTGTCGATACCCTTTTTACGT 3′(SEQ ID NO 12)

引物3

5′TCGACAACGGGCAGTGTATTCACCATG 3′(SEQ ID NO 13)

引物4

5′AATGATATCTGTTATTCTCTAATTTTGTT 3′(SEQ ID NO 14)

引物5

5′AATGATATCACCCTTTTTACGTGAACTTG 3′(SEQ ID NO 15)

实施例2：GFP表达水平的测量

将实施例1中制备的pCL-DtrpL_GFP、pCL-Dtrp_att-GFP和 pCL-Ptrp_GFP的每一种转化到野生型大肠杆菌W3110和色氨酸生产菌 株大肠杆菌KCCM10812P中，然后测量菌株中GFP的强度。

本实施例中使用的亲本菌株大肠杆菌KCCM10812P(韩国专利注册 号10-0792095)是源自具有L-苯丙氨酸生产力的大肠杆菌变体(KFCC 10066，韩国专利公开号1985-0001232)。具体地，KCCM10812P是具有 L-色氨酸生产力的重组大肠杆菌菌株，其中所述菌株已被修饰为恢复色氨 酸营养缺陷，从而失活pheA、trpR、mtr和tnaAB基因并突变aroG和 trpE基因。

具体地，以1/100(v/v)体积比将每一株所述菌株接种到250ml烧瓶中 的25ml M9培养基(含有0.5％葡萄糖+2g/L酵母提取物，对于 KCCM10812还含有0.1g/L酪氨酸和0.1g/L苯丙氨酸)中，并在37℃ 下培养直至达到预定OD值。通过离心回收所培养的菌株，并用1×TE 洗涤一次，使用Synergy HT Multi-Mode Microplate Reader(Biotek，USA) 测量其中的GFP。

测量结果示于下表1中。表1中的OD1和OD3指示在将每种培养产 物稀释到合适浓度后使用UV mini-1240分光光度计(Shimadzu)在600 nm处测得的OD值。

如图1所示，在野生型W3110菌株中，如将Ptrp的相对强度定为1， 则Dtrp_att(包含前导肽和弱化子的缺失)的相对强度在OD值为1(OD1) 时是约7倍，在OD值为3(OD3)时是约10倍，而仅包含前导肽之缺 失的DtrpL的相对强度比野生型调控区(Ptrp)的相对强度高约1.5至2 倍。与此相比，在L-色氨酸生产菌株KCCM10812P中，如将Ptrp的相 对强度定为1，Dtrp_att(包含前导肽和弱化子的缺失)的相对强度在OD 值为1(OD1)时是约19倍，在OD值为3(OD3)时是约27倍，而仅 包含前导肽缺失的DtrpL的相对强度比野生型调控区(Ptrp)的相对强 度高约4倍。这样的结果表明，前导肽或弱化子的缺失导致了表达的增加， 尽管野生型菌株中的这种表达增加比L-色氨酸生产菌株中的表达增加要 弱。

[表1]

实施例3：具有其表达调控区已被替换之色氨酸操纵子(trpEDCBA)的载体的构建

基于实施例2的结果，为构建使用载体增强其色氨酸操纵子基因的大 肠杆菌菌株，使用亲本菌株大肠杆菌KCCM10812P的染色体DNA作为 模板以及引物6和7在上述PCR条件下扩增6564bp片段(SEQ ID NO： 9)。

使用GeneAll^R Expin^TM GEL SV试剂盒(韩国首尔)回收扩增的DNA 片段，然后用限制性内切酶EcoRV和HindIII处理。为使用所制备的DNA 片段进行克隆，用EcoRV和HindIII处理pCL-Dtrp_att-GFP、 pCL-DtrpL_GFP和pCL-Ptrp_GFP载体的每一个以去除GFP区域，从 而获得4291bp片段。用插入片段(insert)连接每种所制备载体，然后通 过转化将其引入到大肠杆菌DH5α中，从而构建 pCL-Dtrp_att-trpEDCBA、pCL-DtrpL_trpEDCBA和 pCL-Ptrp_trpEDCBA载体。

引物6

5′CCCGATATCATGCAAACACAAAAACCGAC 3′(SEQ ID NO 16)

引物7

5′GGGAAGCTTAAAGGATCCGTGGGATTAACTGCGCGTCGCCGCTTT 3′ (SEQ ID NO 17)

实施例4：其表达调控区被替换并且具有排除了trpE的色氨酸生物合成基因簇(trpDCBA)的载体的构建

为通过用trpDCBA替换实施例1中制备的pCL-Dtrp_att-GFP、 pCL-DtrpL-GFP和pCL-Ptrp_GFP载体的GFP区域构建载体，用EcoRV 和HindIII处理pCL Dtrp_att-GFP、pCL-DtrpL-GFP和pCL-Ptrp_GFP 载体的每一种以去除GFP区域，从而获得4291bp片段。

然后，为构建使用载体增强其色氨酸操纵子trpDCBA基因的大肠杆 菌菌株，使用亲本菌株大肠杆菌KCCM10812P的染色体DNA作为模板 以及引物7和8通过PCR扩增5002bp片段(SEQ ID NO：10)。

使用GeneAll^R Expin^TM GEL SV试剂盒(韩国首尔)回收扩增的DNA 片段，然后用限制性内切酶EcoRV和HindIII处理。将所制备的载体与 插入片段互相连接，然后通过转化将其引入到大肠杆菌DH5α中，从而构 建pCL-Dtrp_att-trpDCBA、pCL-DtrpL-trpDCBA和 pCL-Ptrp_trpDCBA载体。

引物8

5′AAAGATATCATGGCTGACATTCTGCTGCT 3′(SEQ ID NO18)

实施例5：具有低拷贝数的含多种表达调控区的色氨酸操纵子基因的载体的构建

在大肠杆菌中以低拷贝数表达的典型载体是pCC1BAC(Epicentre， USA)。为使用该载体以低拷贝数表达色氨酸操纵子基因，用限制性内切 酶HindIII消化实施例3和4中制备的pCL-Dtrp_att-trpEDCBA、 pCL-DtrpL-trpEDCBA、pCL-Ptrp_trpEDCBA、pCL-Dtrp_att-trpDCBA、 pCL-DtrpL-trpDCBA和pCL-Ptrp_trpDCBA。

将所得到的DNA片段在琼脂糖上电泳，然后根据它们的大小切下并 使用GeneAll^R Expin^TM GEL SV试剂盒(韩国首尔)回收。接下来，用 pCC1BAC载体(在HindIII位点消化)连接每种片段，然后经转化将其 引入到大肠杆菌DH5α中。

在LB Cm固体培养基(LB+氯霉素琼脂平板)上涂片每种经转化 菌株，选择具有Cm抗性的菌株，从而构建pBAC-Dtrp_att-trpEDCBA、 pBAC-DtrpL-trpEDCBA、pBAC-Ptrp_trpEDCBA、 pBAC-Dtrp_att-trpDCBA、pBAC-DtrpL-trpDCBA和 pBAC-Ptrp_trpDCBA载体。

实施例6：其中pheA基因被失活的大肠杆菌菌株的构建

为了从野生型大肠杆菌W3110菌株构建接近于色氨酸生产菌株的菌 株，通过经同源重组的缺失失活编码分支酸变位酶(chorismate mutase) /预苯酸脱水酶(prephenate dehydratase，CM-PDT)的pheA基因(NCBI 基因ID：12934467)。CM-PDT是从分支酸生产苯丙氨酸的第一步中的酶， 而pheA基因的缺失被用来抑制苯丙氨酸生物合成途径。对于该缺失，使 用一步失活方法(由Datsenko KA等开发)，其为使用λred重组酶(lambda  red recombinase)的诱变技术(One-step inactivation of chromosomal  genes in Escherichia coli K-12 using PCR products，Datsenko KA， Wanner BL.，Proc NatlAcad Sci U SA.2000年6月6日；97(12)：6640-5)。 使用pUCprmfmloxP的氯霉素抗性基因作为确认插入到基因中的标记(韩 国专利特许公开，公开号2009-0075549)。

使用载体pUCprmfmloxP作为模板以及引物9和10通过PCR扩增 约1200bp的基因片段，其具有pUCprmfmloxP载体的pheA基因的一部 分和氯霉素抗性基因核苷酸序列的一部分。

引物9

5′-GGCCTCCCAAATCGGGGGGCCTTTTTTATTGATAACAAAAAGGCAACA CTAGGTGACACTATAGAACGCG-3′(SEQ ID NO 19)

引物10

5′-AACAGCCCAATACCTTCATTGAACGGGTGATTTCCCCTAACTCTTTCAA TTAGTGGATCTGATGGGTACC-3′(SEQ ID NO 20)

将通过PCR扩增所获得的DNA片段在0.8％琼脂糖凝胶上电泳，然 后洗脱并用作二次PCR的模板。进行二次PCR以使得初次DNA片段的 5’和3’区具有20bp互补核苷酸碱基对。此外，使用洗脱的初次PCR产 物作为模板以及引物11和12通过PCR扩增约1300bp的基因片段，其包 含pheA基因的5’和3’区。将所得到的DNA片段在0.8％琼脂糖凝胶上电 泳，然后洗脱并用于重组。

引物11

5′-GAATGGGAGGCGTTTCGTCGTGTGAAACAGAATGCGAAGACGAACAAT AAGGCCTCCCAAATCGGGGGGC-3′(SEQ ID NO 21)

引物12

5-GGCACCTTTTCATCAGGTTGGATCAACAGGCACTACGTTCTCACTTGGG TAACAGCCCAATACCTTCATT-3′(SEQ ID NO 22)

根据Datsenko KA等开发的方法，将用pKD46载体转化的W3110 大肠杆菌菌株制备为感受态，然后用经PCR获得的1300bp基因片段转 化。在LB培养基上选择具有氯霉素抗性的菌株。使用引物13和14进行 PCR，PCR扩增产物具有约2500bp的大小，表明菌株中的pheA基因被 缺失了。

引物13

5′-TTGAGTGTATCGCCAACGCG-3′(SEQ ID NO 23)

引物14

5′-AAAGCCGCGTGTTATTGCGT-3′(SEQ ID NO 24)

从具有氯霉素抗性的初次重组菌株中去除pKD46载体，然后将 pJW168载体引入到菌株中，并从菌株中去除氯霉素标记基因(Gene， (2000)247，255-264)。所得菌株使用引物13和14经PCR获得约500bp 的扩增产物，表明实现了靶基因的缺失。将所构建的菌株命名为“大肠杆 菌W3110trpΔ1”。

实施例7：tnaAB基因从其被失活的大肠杆菌菌株的构建

经同源重组从实施例6所构建的大肠杆菌W3110trpΔ1菌株中缺失 tnaAB操纵子(NCBI基因ID：12933600，12933602)，该操纵子由编码 色氨酸酶的tnaA基因和编码色氨酸输入蛋白(importer)的tnaB基因构 成。由于该缺失，色氨酸产生后的降解途径可以被封闭，并且分泌到培养 基中的色氨酸向细胞的流入可以被避免，从而赋予了色氨酸生产菌株的特 性。对于该缺失，使用载体pUCprmfmloxP作为模板与引物15和16一 起以实施例6所述同样的方式通过PCR扩增约1200bp的基因片段，其 具有pUCprmfmloxP载体tnaAB基因的一部分以及氯霉素抗性基因核苷 酸序列的一部分。此外，将由PCR扩增获得的DNA片段使用引物17和 18以实施例6所述同样方式经PCR进一步扩增，从而获得1300bp的基 因片段。

引物15

5′-

TTAGCCAAATTTAGGTAACACGTTAAAGACGTTGCCGAACCAGCACAAAA AGGTGACACTATAGAACGCG-3′(SEQ ID NO 25)

引物16

5′-

ATGAAGGATTATGTAATGGAAAACTTTAAACATCTCCCTGAACCGTTCCGT AGTGGATCTGATGGGTACC-3′(SEQ ID NO 26)

引物17

5′-

TGATTTCCTGAGAGGCAAGAAGCCAGCGAATGGCTGGCTTCTTGAAGGATT TAGCCAAATTTAGGTAACA-3′(SEQ ID NO 27)

引物18

5′-

AATCGGTATAGCAGATGTAATATTCACAGGGATCACTGTAATTAAAATAAA TGAAGGATTATGTAATGGA-3′(SEQ ID NO 28)

为缺失tnaAB基因，以实施例6所述同样方式构建引入了载体pKD 46的大肠杆菌菌株W3110trpΔ1并使其成为感受态，然后将由PCR获得 的1300bp基因片段转化到大肠杆菌菌株中。在LB培养基上选择具有氯 霉素抗性的菌株。使用引物19和20进行PCR，PCR扩增产物具有约5400 bp的大小，表明菌株中的tnaAB基因已被缺失。

引物19

5′-CGGGATAAAGTAAAACCAGG-3′(SEQ ID NO 29)

引物20

5′-CGGCGAAGGTAAGTTGATGA-3′(SEQ ID NO 30)

以实施例6所述同样方式从具有氯霉素抗性的初次重组菌株中去除 pKD46载体，然后从菌株中去除氯霉素标记基因。所得菌株使用引物19 和20经PCR获得约550bp的扩增产物，表明实现了所期望基因的缺失。 所构建的菌株命名为“大肠杆菌W3110trpΔ2”。

实施例8：鉴定具有含多种表达模式的色氨酸操纵子的菌株的L-色氨酸生产力

用根据实施例3、4和5中所述方法制备的载体转化大肠杆菌菌株。 使用实施例6和7中制备的W3110trpΔ2作为亲本菌株评估大肠杆菌变 体的影响，其碳源是葡萄糖。

为评估效价，通过接种环接种每个菌株并在LB固体培养基上过夜培 养。然后，将一接种环的每个菌株接种到25mL含葡萄糖的培养基中， 所述培养基的组成示于下表2中。接种后，每个菌株在37℃和200rpm 孵育48小时。结果示于下表3中。所有结果是以三个烧瓶的结果的平均 值记录的。

[表2]

组成 浓度(每升) 葡萄糖 2g KH2PO₄1g (NH₄)₂SO₄12g NaCl 1g Na₂HPO₄·H₂O 5g MgSO₄·H₂O 1g MnSO₄·H₂O 15mg CuSO₄·H₂O 3mg ZnSO₄·H₂O 30mg 柠檬酸钠 1g 酵母提取物 1g 苯丙氨酸 0.15g pH 6.8

[表3]

从上表3的结果可见，在用多种载体的组合转化亲本菌株大肠杆菌 W3110trpΔ2的情况下，如果只有色氨酸操纵子持续地被增强，则不会在 邻氨基苯甲酸积累的同时出现对色氨酸产量的正面影响。相反，与仅增强 色氨酸操纵子的菌株相比，被修饰为增强了Trp操纵子和trpDCBA的菌 株显示了对色氨酸产量的正面影响以及邻氨基苯甲酸积累的减少。因此， 确认了生产色氨酸的菌株中邻氨基苯甲酸积累的减少是增加L-色氨酸产 量的有效方式。

实施例9：鉴定具有含多种表达模式的色氨酸操纵子的菌株的L-色氨酸生产力

根据下表5所示的组合，将根据实施例3、4和5中所述方法构建的 载体引入到生产L-色氨酸的的亲本菌株大肠杆菌KCCM10812P中。使用 葡萄糖作为碳源评估菌株的效价。结果，看起来不仅trpDCBA的增强是 重要的，而且色氨酸操纵子的增强也是重要的，与实施例8的结果类似。 由此评估了对色氨酸生产菌株的影响。

为评估效价，通过接种环接种每个菌株并在LB固体培养基上过夜培 养。然后，将一接种环的每个菌株接种到25mL含葡萄糖的培养基中， 所述培养基的组成示于下表4中。接种后，每个菌株在37℃和200rpm 孵育48小时。结果示于下表5中。所有结果是以三个烧瓶的结果的平均 值记录的。

[表4]

组成 浓度(每升) 葡萄糖 60g K₂HPO₄1g (NH₄)₂SO₄10g NaCl 1g MgSO₄·H₂O 1g 柠檬酸钠 5g 酵母提取物 2g 碳酸钙 40g 柠檬酸钠 5g 苯丙氨酸 0.15g 酪氨酸 0.1g pH 6.8

[表5]

＊在33小时测量

＊＊在48小时测量

从上表5的结果可见，在用多种载体的组合转化亲本菌株大肠杆菌 KCCM10812P的情况下，如果只有色氨酸操纵子持续地被增强，则不会 在邻氨基苯甲酸积累的同时出现对色氨酸产量的正面影响。相反，与仅增 强色氨酸操纵子的菌株相比，看起来通过使用pCL载体增强操纵子并且 使用pBAC载体增强trpDCBA来修饰菌株显示了对色氨酸产量的正面影 响以及邻氨基苯甲酸积累的减少。因此，确认了色氨酸产生菌株中邻氨基 苯甲酸积累的减少是增加L-色氨酸产量的有效方式。

实施例10：菌株的构建，其中染色体中色氨酸生物合成基因簇trpDCBA的拷贝数增加并且邻氨基苯甲酸的积累减少

基于实施例9的结果，构建载体以增加染色体中色氨酸生物合成基因 簇trpDCBA的拷贝数。

具体地，用限制性内切酶EcoRI和BamHI切割实施例5中所述的 pCL-Dtrp_att-trpDCBA以获得Dtrp_att-trpDCBA，然后与经同样限制 性内切酶处理的pINT17E连接，从而获得pINT17E-Patt-trpDCBA。为 将pINT17E-Patt-trpDCBA引入到生产色氨酸的亲本菌株大肠杆菌 KCCM10812P中以增加色氨酸生物合成基因簇trpDCBA的拷贝数，根 据实施例6在一步失活方法(由Datsenko KA等开发)中使用pKD46， 所述方法为使用λred重组酶的诱变技术。使用pUCprmfmloxP的氯霉素 抗性基因作为确认插入到基因中的标记。具体地，用 pINT17E-Patt-trpDCBA转化已引入pKD46的亲本菌株，然后在37℃培 养1至2天以获得菌落。为确认pINT17E-Patt-trpDCBA是否已正确地插 入到所获得菌落的染色体中，使用引物21和22通过PCR扩增约2000-bp 的片段。

引物21

5′TATTTGCTGTCACGAGCAGG 3′(SEQ ID NO 31)

引物22

5′AGTTCCGGCATACAACCGGCTT 3′(SEQ ID NO 32)

从具有氯霉素抗性的初次重组菌株中去除pKD46，然后将pJW168 质粒引入以从菌株中去除氯霉素标记基因(Gene，(2000)247，255-264)。 使用引物23和24经PCR获得约5000bp的扩增产物，并使用引物25和 26经PCR获得约6500bp的扩增产物，这证明trpDCBA是连续地位于 色氨酸操纵子之后，所述色氨酸操纵子内源位于染色体上。将该菌株命名 为“KCCM10812P/trpDCBA”。

引物23

5′TAATACGACTCACTATAGGG 3′(SEQ ID NO 33)

引物24

5′CTGTTGGGCGGAAAAATGAC 3′(SEQ ID NO 34)

引物25

5′TGATCGCCAGGGTGCCGACG 3′(SEQ ID NO 35)

引物26

5′CCCTATAGTGAGTCGTATTA 3′(SEQ ID NO 36)

为另外插入一个拷贝到以上制备的已增加trpDCBA拷贝数的菌株 中，将pKD46引入到以上制备的KCCM10812P/trpDCBA菌株中。然后 将pINT17E-Patt-trpDCBA载体引入到KCCM10812P/trpDCBA/pKD46 中，从而构建具有两个trpDCBA拷贝插入到染色体中的菌株。将该构建 的菌株命名为“KCCM10812P/2trpDCBA”。将该菌株于2011年12月29 日保藏在国际保藏单位韩国微生物培养中心(361-221，Hongje 1-dong， Seodaemun-gu，Seoul，Korea)，登记号为KCCM11246P。

实施例11：L-色氨酸生产菌株效果的检测，所述菌株具有增加的由色氨酸生物合成基因簇trpDCBA编码的蛋白质活性

根据实施例10中描述的方法，使用葡萄糖作为碳源评估 KCCM10812P/trpDCBA的效价。KCCM10812P/trpDCBA的获得是通过 进一步将trpDCBA引入到色氨酸生产菌株大肠杆菌KCCM10812P中以 增强色氨酸生物合成途径一些酶的活性。

为评估效价，通过接种环接种菌株并在LB固体培养基上过夜培养。 然后，将一接种环的菌株培养物接种到每烧瓶25mL的效价培养基中， 培养基的组成示于上表4中。接种后，将菌株在37℃和200rpm孵育48 小时。结果示于下表6中。所有结果是以三个烧瓶的结果的平均值记录的。

[表6]

＊在33小时测量

＊＊在48小时测量

如从上表6中可见的，当在染色体中插入一个拷贝的色氨酸生物合成 基因簇trpDCBA时，与亲本菌株相比，邻氨基苯甲酸的浓度降低了39％。 然而在染色体中插入两个拷贝，与亲本菌株相比，邻氨基苯甲酸的浓度降 低了69％。

此外，两种菌株中L-色氨酸浓度分别增加了10％和13％。如上表6 所示，当trpDCBA的拷贝数增加时，葡萄糖消耗速率在一些情况下轻微 降低，但是色氨酸生物合成基因簇的增强对L-色氨酸浓度的增加和邻氨 基苯甲酸浓度的降低具有正面影响。

尽管已经参照特定说明性实施方案描述了本发明，但是本发明所属领 域技术人员能够理解，本发明可以在不偏离本发明技术精神或实质特征的 情况下以其它特定方式实施。因此，上述实施方案在所有方面都被认为是 说明性的而非限制性的。此外，本发明的范围是由所附权利要求书而不是 具体说明书限定的，应当理解的是，源自本发明涵义和范围的所有改变或 变化及其等同形式都被包括在所附权利要求书的范围内。

登记号：

保藏单位：韩国微生物培养中心(国际)

登记号：KCCM11246P

保藏日期：2011年12月29日