微生物酶法生产L-半胱氨酸和L-色氨酸的研究

摘要

L-半胱氨酸与L-色氨酸在医药、食品和饲料等领域均具有非常广泛的用途。近年来,各行业对L-半胱氨酸与L-色氨酸的需求量日益增加,而现有产量远不能满足国内外市场的需求。因此,开发微生物酶法生产L-半胱氨酸与L-色氨酸的工艺路线具有广阔的应用前景。 本实验室从富含DL-ATC的环境中筛选获得一株恶臭假单胞菌TS1138菌株,前期研究表明,该菌株能以DL-ATC为底物经由S-代途径酶法合成L-半胱氨酸。 本研究首先克隆鉴定了TS1138菌株酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的代谢途径中的另一个重要基因L-半胱氨酸脱毓基酶,并将其在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了重组表达以及分离纯化,并对其酶学性质进行了考察,发现了羟胺可以作为其有效的抑制剂。 为了证明在TS1138菌株酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的过程中,L-半胱氨酸脱巯基酶对L-半胱氨酸的分解起关键作用,本研究建立了一种从蛋白水平分离L-半胱氨酸脱巯基酶的技术。以纯化的L-半胱氨酸脱巯基酶重组蛋白免疫小鼠,制备得到L-半胱氨酸脱巯基酶抗体。通过Protein A的生物桥联作用,将该抗体固定于纤维素磁性微球上,制备得到纤维素免疫磁性微球,该微球能够特异性分离TS1138菌体裂解液中的L-半胱氨酸脱巯基酶,并且具有良好的重复利用性能。利用经过该免疫磁性微球处理后的TS1138菌体裂解液转化DL-ATC合成L-半胱氨酸,转化率达到了96.4％,比原始水平提高了33.7％,并且保持稳定,从而证明了L-半胱氨酸脱巯基酶是导致L-半胱氨酸产率降低的关键因素。 为了研究该代谢途径,本研究还利用蛋白质组学实验分析了DL-ATC对TS1138菌体总蛋白表达的诱导作用,发现在不同诱导条件下,至少有十二种蛋白在表达量上出现了三倍以上的差异。而实时荧光定量PCR实验则表明了L-ATC水解酶、L-SCC酰胺水解酶和L-半胱氨酸脱巯基酶酶基因在DL-ATC诱导条件下的表达量分别为无诱导条件下的143、162和159倍。另外,本研究还利用人工Mu转座技术,构建了TS1138菌株的Mu转座随机突变文库,获得4,000余株突变子。以合成L-半胱氨酸能力为筛选指标,对1,000余株突变子进行了筛选,发现有二十余株突变子合成L-半胱氨酸的能力表现为缺失或大为降低。 为了提高L-半胱氨酸产率,必须消除或抑制L-半胱氨酸脱巯基酶的作用,然而L-半胱氨酸脱巯基酶为TS1138菌株的必需基因,无法从基因水平敲除。因此,本研究建立了以TS1138菌体全细胞为酶源,以羟胺为L-半胱氨酸脱巯基酶抑制剂,重复利用酶源细胞连续多次转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的生产工艺。首先对酶促反应条件进行了优化,在最适反应条件下,底物转化率可达到95.6％,在酶源细胞的6次重复利用过程中,底物的转化率均可保持在90％以上。随后建立了产物L-半胱氨酸的分离纯化工艺。先将酶促反应液中的L-半胱氨酸氧化成L-胱氨酸；之后经树脂吸附、等电点沉淀等方法纯化获得L-胱氨酸,纯度达到99.1％,收率为78.6％；最终再通过电解还原的方法将L-胱氨酸还原为L-半胱氨酸。 此外,在酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的生产工艺基础上,本研究还建立了利用色氨酸酶转化L-半胱氨酸和吲哚合成L-色氨酸的生产工艺。 克隆了大肠杆菌JM109菌株的色氨酸酶基因,并将其在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。通过对诱导表达条件的优化,重组表达的色氨酸酶活力达到宿主菌的约110倍。此外,还利用PCR介导定点突变技术对色氨酸酶氨基酸序列上的四个位点进行了突变(F231R,A232D,A265R与V274R),结果分别导致了色氨酸酶活力降低或完全失活,表明上述四个氨基酸位点均对维持色氨酸酶的活力具有重要作用。 最后利用高效表达色氨酸酶的大肠杆菌酶源细胞,以L-半胱氨酸和吲哚为底物,进行了酶促反应合成L-色氨酸的研究。对酶促反应条件进行了优化,在最适反应条件下,L-半胱氨酸的转化率约为81.5％,吲哚的转化率约为79.1％。此外,本研究还建立了L-色氨酸的分离纯化工艺,通过串联使用两种树脂排除反应液中其它物质的干扰,再经洗脱、减压浓缩干燥,获得L-色氨酸,纯度达到98.3％,收率为66.7％。 综上所述,本研究对TS1138菌株酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的代谢途径进行了拓展研究,并且建立了L-半胱氨酸和L-色氨酸的酶法生产工艺,为最终全面阐明L-半胱氨酸的代谢途径以及实现以DL-ATC为底物酶法合成L-半胱氨酸和L-色氨酸的生产应用奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

第一章引言

第一节L-半胱氨酸概述

1.1.1 L-半胱氨酸的理化性质

1.1.2 L-半胱氨酸的应用

1.1.3 L-半胱氨酸的测定方法

第二节L-半胱氨酸的生产方法

1.2.1毛发水解后还原法

1.2.2化学合成法

1.2.3发酵法

1.2.4酶法合成法

第三节酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的机制

1.3.1转化途径

1.3.2酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的酶系分析

1.3.3酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸相关基因的研究

第四节L-色氨酸概述

1.4.1 L-色氨酸的理化性质

1.4.2 L-色氨酸的应用

1.4.3 L-色氨酸的测定方法

第五节L-色氨酸的生产方法

1.5.1直接发酵法

1.5.2微生物转化法

1.5.3酶法合成法

第六节本论文的研究目的和意义

第二章L-半胱氨酸脱巯基酶基因的克隆、表达与鉴定

第一节材料与方法

2.1.1实验材料

2.1.2实验方法

第二节结果与分析

2.2.1 L-半胱氨酸脱巯基酶基因的克隆、鉴定和同源性分析

2.2.2 L-半胱氨酸脱巯基酶的表达、纯化与活性鉴定

2.2.3重组表达的L-半胱氨酸脱巯基酶的酶学性质

第三节讨论与小结

第三章免疫磁性分离L-半胱氨酸脱巯基酶提高L-半胱氨酸产率

第一节材料与方法

3.1.1实验材料

3.1.2实验方法

第二节结果与分析

3.2.1 L-半胱氨酸脱巯基酶多克隆抗体的制备

3.2.2纤维素免疫磁性微球(Cross-linked anti-CD IgG-ProA-MCMS)的制备

3.2.3纤维素免疫磁性微球的抗原结合能力

3.2.4 L-半胱氨酸脱巯基酶的免疫磁性分离

3.2.5免疫磁性分离后的TS1138菌体裂解液合成L-半胱氨酸的能力

3.2.6纤维素免疫磁性微球的重复利用性

第三节讨论与小结

第四章TS1138菌株酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸代谢途径的拓展研究

第一节材料与方法

4.1.1实验材料

4.1.2实验方法

第二节结果与分析

4.2.1 DL-ATC对TS1138菌株基因表达诱导作用的蛋白质组学实验分析

4.2.2 DL-ATC对相关基因表达诱导作用的实时荧光定量PCR分析

4.2.3 TS1138菌株Mu转座突变文库的构建与筛选

第三节讨论与小结

第五章L-半胱氨酸和L-胱氨酸的生产工艺研究

第一节材料与方法

5.1.1实验材料

5.1.2实验方法

第二节结果与分析

5.2.1酶促反应条件的优化

5.2.2酶源细胞的重复利用性

5.2.3 L-半胱氨酸氧化为L-胱氨酸

5.2.4 L-胱氨酸的分离纯化

5.2.5 L-胱氨酸电解还原为L-半胱氨酸

第三节讨论与小结

第六章大肠杆菌色氨酸酶基因的克隆、表达与定点突变

第一节材料与方法

6.1.1实验材料

6.1.2实验方法

第二节结果与分析

6.2.1色氨酸酶基因的克隆与鉴定

6.2.2色氨酸酶的诱导表达

6.2.3色氨酸酶基冈的定点突变

第三节讨论与小结

第七章L-色氨酸的生产工艺研究

第一节材料与方法

7.1.1实验材料

7.1.2实验方法

第二节结果与分析

7.2.1 L-色氨酸含量的测定

7.2.2酶促反应条件的优化

7.2.3 L-广色氨酸的分离纯化

第三节讨论与小结

总结与展望

创新点

参考文献

致谢

在学期间发表论文