杨属派间不同种亲缘关系的鉴定方法及鉴定试剂盒

摘要

本发明公开了一种杨属派间不同种亲缘关系的鉴定方法及鉴定试剂盒。其中，该方法包括以下步骤：S1，采用多态性微卫星DNA引物对对杨树进行基因分型，构建种间个体的微卫星DNA指纹图谱；S2，采用多态性微卫星DNA引物对对待鉴定杨树进行基因型扩增，并根据微卫星DNA指纹图谱判断待鉴定杨树的亲缘关系；其中，多态性微卫星DNA引物对包括：引物对1、引物对2、引物对3、引物对4和引物对5。应用本发明的技术方案，利用5对多态性高且两两不发生相互作用的微卫星DNA引物组合构建微卫星DNA指纹图谱，然后通过微卫星DNA指纹图谱判断杨属派间不同种亲缘关系。本发明的方法快速、高效、稳定，适用于杨树不同生长时期。

说明书

技术领域

本发明涉及分子遗传学技术领域，具体而言，涉及一种杨属派间不同种亲缘关系的鉴定方法及鉴定试剂盒。 

背景技术

杨树（Populus）是北半球重要的森林树种，其种类丰富、分布广泛、速生高产，在工业生产及环境保护等方面具有举足轻重的地位。我国处于世界杨树中心分布区域，据徐纬英（1988）统计，我国独有的乡土杨树树种达53种之多，因此，丰富的遗传变异资源为杨树遗传改良及群体进化遗传学研究等奠定了基础，同样也为我们对其更好的保护和利用提出了挑战。然而，以无性繁殖为主要繁殖方式的杨树，目前同物异名、同名异物现象相当严重，迫切需要建立一套准确、高效、稳定的种间鉴定技术。 

DNA指纹图谱技术主要利用分子标记方法检测并比较种间个体基因组DNA水平的遗传变异；不受组织、发育时期、季节环境限制，且遗传信息含量丰富、多态性高，适合于分析杨树这样种类丰富、育种周期较长、应用价值高的植物群体。高质量的指纹图谱可为新品种登记、注册和产权保护提供技术保障，也为实施杂交育种改良提供重要的理论依据。与表型性状、染色体核型分析、同工酶分析等鉴定方法相比，借助于分子标记技术的DNA指纹图谱技术为品种和无性系的鉴定提供了新的手段。 

目前，国内虽然已构建了部分杨树品种的AFLP指纹图谱（宋红竹，杨属AFLP遗传多样性研究和杨树品种分子指纹图谱构建，2005），但其供试材料数目较少，且AFLP技术操作程序复杂，对DNA质量及其酶切条件要求较高，结果稳定性差。因此，限制了该技术构建的指纹图谱广泛应用于种质鉴定。因此，在当今分子标记辅助选择育种策略逐渐被应用于林木遗传改良的时代，建立一种高效、稳定、易操作的方法，显得十分迫切和必要。 

发明内容

本发明旨在提供一种杨属派间不同种亲缘关系的鉴定方法及鉴定试剂盒，以解决现有技术中杨树种间个体鉴定方法复杂及稳定性差的技术问题。 

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种杨属派间不同种亲缘关系的鉴定方法。该方法包括以下步骤：S1，采用多态性微卫星DNA引物对对杨树进行基因分型，构建种间个体的微卫星DNA指纹图谱；S2，采用多态性微卫星DNA引物对对待鉴定杨树进行基因型扩增，并根据微卫星DNA指纹图谱判断待鉴定杨树的亲缘关系；其中，多态性微卫星DNA引物对包括：引物对1、引物对2、引物对3、引物对4和引物对5，引物对1的碱基序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；引物对2的碱基序列为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4； 引物对3的碱基序列为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；引物对4的碱基序列为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8；引物对5的碱基序列为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10。 

进一步地，多态性微卫星DNA引物对中的正向引物的5’端采用荧光基团修饰，荧光基团选自FAM、HEX或ROX中的一种。 

进一步地，步骤S1包括：提取各待鉴定杨树DNA，采用多态性微卫星DNA引物对分别对各待鉴定杨树DNA进行PCR扩增，得PCR扩增产物；将PCR扩增产物进行毛细电泳检测，并将毛细电泳检测的结果进行聚类分析，构建微卫星DNA指纹图谱。 

进一步地，PCR扩增的条件是：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，然后72℃延伸10min。 

进一步地，PCR扩增的体系为：多态性微卫星DNA引物对的浓度均为0.3mol/μl，3.5μl2×PCR QIAGEN Multiplxe PCR Master Mix，2.0μl DNA模板，无菌水补至10μl。 

根据本发明的另一个方面，提供一种杨属派间不同种亲缘关系的鉴定试剂盒。该试剂盒包括多态性微卫星DNA引物对，多态性微卫星DNA引物对包括：引物对1、引物对2、引物对3、引物对4和引物对5，引物对1的碱基序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；引物对2的碱基序列为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；引物对3的碱基序列为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；引物对4的碱基序列为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8；引物对5的碱基序列为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10。 

进一步地，多态性微卫星DNA引物对中的正向引物的5’端采用荧光基团修饰，荧光基团选自FAM、HEX或ROX中的一种。 

进一步地，多态性微卫星DNA引物对进行PCR扩增的条件是：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，然后72℃延伸10min。 

进一步地，多态性微卫星DNA引物对进行PCR扩增的体系为：多态性微卫星DNA引物对的浓度均为0.3mol/μl，3.5μl2×PCR QIAGEN Multiplxe PCR Master Mix，2.0μl DNA模板，无菌水补至10μl。 

应用本发明的技术方案，利用5对多态性高且两两不发生相互作用的微卫星DNA引物组合构建微卫星DNA指纹图谱，然后通过微卫星DNA指纹图谱判断杨属派间不同种亲缘关系。本发明的方法快速、高效、稳定，适用于杨树不同生长时期，易于自动化，在杨树遗传学研究、种质鉴定及品种保护等方面都有着广泛的应用前景，且部分引物扩增位点具有杨树派的特异性（青杨派为218bp，黑杨派为179bp），为林木进化遗传学研究以及杨树种间鉴定提供了直接有力的技术支持。 

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中： 

图1示出了利用Multiplex Manager软件，根据片段长度设计出的引物组合；以及 

图2示出了扩增产物片段长度构建杨属派间不同种的微卫星DNA指纹图谱，引物组的5对引物扩增片段大小从低到高依次对应图1中的Populus SSR Primer01-Populus SSR Primer05。 

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。 

本发明针对应用传统类型的指纹图谱进行种质鉴定稳定性差、实验操作复杂的不足，提供了一种高效、便捷的对我国常见杨树种质进行亲缘关系鉴定的引物和方法，并构建了杨树不同种的微卫星DNA指纹图谱，为后续的杨树种质鉴定及分子标记辅助育种提供了重要的技术支持。 

微卫星DNA标记，又称简单序列重复（Simple Sequence Repeat，SSR）是近些年来发展良好，建立在聚合酶链式反应（PCR）扩增基础上的理想分子标记类型，其具有可靠性强、实验重复性高、多态性丰富、种间转移性高及共显性等优点。特别是近几年借助高通量测序技术，在植物中开发出多种不同类型的微卫星DNA标记，使利用微卫星DNA标记进行属内近缘种的遗传多样性分析、指纹图谱构建、及亲缘关系鉴定等方面具有重要的发展潜力。本发明的杨属派间不同种亲缘关系的鉴定方法和鉴定试剂盒正是基于此研发出来的。另外，本发明中引物的开发还参考了文献（Du等,DNA Research(2013)20,31-44）和公共数据库（http://www.ornl.gov/sci/ipgc/ssr_resource.htm）。 

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种杨属派间不同种亲缘关系的鉴定方法。该鉴定方法包括以下步骤：S1，采用多态性微卫星DNA引物对对杨树进行基因分型，构建种间个体的微卫星DNA指纹图谱；S2，采用所述态性微卫星DNA引物对待鉴定杨树进行基因扩增，并根据微卫星DNA指纹图谱判断杨属派间不同种亲缘关系；其中，多态性微卫星DNA引物对包括：引物对1、引物对2、引物对3、引物对4和引物对5，引物对1的碱基序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；引物对2的碱基序列为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；引物对3的碱基序列为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；引物对4的碱基序列为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8；引物对5的碱基序列为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10，具体序列及扩增片段大小如表1所示。 

应用本发明的技术方案，利用5对多态性高且两两不发生相互作用的微卫星DNA引物组合构建微卫星DNA指纹图谱，然后通过微卫星DNA指纹图谱判断杨属派间不同种亲缘关系。本发明的方法快速、高效、稳定，适用于杨树不同生长时期，易于自动化，在杨树遗传学研究、种质鉴定及品种保护等方面都有着广泛的应用前景。 

优选地，多态性微卫星DNA引物对中的正向引物的5’端采用荧光基团修饰，荧光基团为选自FAM、HEX或ROX中的一种，在氩激光照射下FAM、HEX或ROX分别会显示蓝色、绿色、和红色，用于区分不同的PCR产物，这样可以得到带有不同荧光标记的扩增结果，有 利于对电泳结果分析。在本发明的一种实施方式中，上述5对引物的修饰如表1中所示。 

表1 

优选地，步骤S1进一步包括：提取各待鉴定杨树DNA，采用多态性微卫星DNA引物对分别对各待鉴定杨树DNA进行PCR扩增，得PCR扩增产物；将PCR扩增产物进行毛细电泳检测，并将毛细电泳检测的结果进行聚类分析，构建微卫星DNA指纹图谱。在本发明的一实施方式中，毛细管电泳检测（ABI3730xl DNA Analyzer），以Liz Standard Size600（Applied Biosystems）为内标，利用软件GeneMapper读出片段长度，统计数据。 

本发明还对PCR最适条件进行摸索，尤其是对退火温度、循环数和延伸时间进行了优化。优选地，PCR扩增的条件是：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，然后72℃延伸10min。 

本发明在实验中对PCR反应体系中DNA模板、引物、扩增酶的浓度进行摸索，调整各引物组分之间的浓度，使各位点平衡而高效的扩增。优选地，PCR扩增的体系为：多态性微卫星DNA引物对的浓度均为0.3mol/μl，3.5μl2×PCR QIAGEN Multiplxe PCR Master Mix，2.0μlDNA模板，无菌水补至10μl。 

根据本发明的另一个方面，提供一种杨属派间不同种亲缘关系的鉴定试剂盒。该试剂盒包括多态性微卫星DNA引物对，多态性微卫星DNA引物对包括：引物对1、引物对2、引物对3、引物对4和引物对5，引物对1的碱基序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；引物对2的碱基序列为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；引物对3的碱基序列为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；引物对4的碱基序列为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8；引物对5的碱基序列为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10，具体序列如表1所示。 

应用本发明的技术方案，利用5对多态性高且两两不发生相互作用的微卫星DNA引物组合构建微卫星DNA指纹图谱，然后通过微卫星DNA指纹图谱判断杨属派间不同种亲缘关系。 本发明的方法快速、高效、稳定，适用于杨树不同生长时期，易于自动化，在杨树遗传学研究、种质鉴定及品种保护等方面都有着广泛的应用前景。 

优选地，多态性微卫星DNA引物对中的正向引物的5’端采用荧光基团修饰，荧光基团为选自FAM、HEX或ROX中的一种，这样可以得到带有不同荧光标记的扩增结果，有利于对电泳结果分析。在本发明的一种实施方式中，上述5对引物的修饰如表1中所示。 

本发明还对PCR最适条件进行摸索，尤其是对退火温度、循环数和延伸时间进行了优化。优选地，多态性微卫星DNA引物对进行PCR扩增的条件是：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，然后72℃延伸10min。 

本发明在实验中对PCR反应体系中DNA模板、引物、扩增酶的浓度进行摸索，调整各引物组分之间的浓度，使各位点平衡而高效的扩增。优选地，多态性微卫星DNA引物对进行PCR扩增的体系为：多态性微卫星DNA引物对的浓度均为0.3mol/μl，3.5μl2×PCR QIAGEN Multiplxe PCR Master Mix，2.0μl DNA模板，无菌水补至10μl。 

下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。 

在下列实施例中，进行PCR扩增的体系及扩增条件如上文所示。样本DNA的提取采用的是CTAB法（Doyle等，Phytochemistry Bulletin.(1987)9,1-15）或植物DNA快速提取试剂盒。 

实施例1 

S1，利用本发明的5对多态性微卫星DNA引物组合（如表1所示）对我国杨树五大派25个常见种的基因型个体毛白杨（取自全国毛白杨种质资源库）进行基因型分型，并构建种间个体的微卫星DNA指纹图谱，如图2所示。此指纹图谱制作完成后，可以为后续试验所用，不必每次都重新制作。 

其中，图1示出了利用Multiplex Manager软件，根据片段长度设计出的引物组合；图2示出了扩增产物片段长度构建杨属派间不同种的微卫星DNA指纹图谱，引物组的5对引物扩增片段大小从低到高依次对应图1中的Populus SSR Primer01-Populus SSR Primer05。 

S2，利用微卫星DNA指纹图谱技术对丢失标签信息的杨树DNA样品进行身份鉴定。 

样品对象为实验室冰箱内冻存的丢失标签信息的5个杨树DNA样品，可确定的信息为这些样品2009年采集于我国的山东、河南一带，属于青杨派或者黑杨派树种。 

利用本发明提供的5对引物对所有DNA样本进行扩增。 

对PCR产物进行毛细管电泳检测，并利用GeneMapper（Applied Biosystems）软件统计PCR产物的片段长度，并构建5个样品的指纹图谱，编号为01-05。 

通过与本发明构建的杨属派内不同种指纹图谱比较，根据杨派特异性位点信息，及其5个样品指纹图谱与本发明不同种指纹图谱位点重复程度，我们最终确定了五个试管内DNA样 品的名称，具体结果如表2所示： 

表2 

样品 杨派特异性 指纹图谱重复条带数目 鉴定结果 01 218bp（青杨派） 6 小叶杨 02 179bp（黑杨派） 7 美洲黑杨 03 218bp（青杨派） 8 小青杨 04 218bp（青杨派） 6 小叶杨 05 179bp（黑杨派） 7 107杨

实施例2 

利用微卫星DNA分子标记技术对银腺杨杂交子代进行父本鉴定。 

从杨树混交林中选择3株成年银腺杨雌株，采集蒴果，同时采集雌株附近的所有成年雄株个体10株。利用组织培养方式繁殖蒴果内的种子，3个月后将组培幼苗移栽到营养杯，在人工气候室中进行炼苗，随后转移到温室苗床进行统一养护。单株采集幼嫩叶片2-3片。 

CTAB法提取所有亲本的DNA，每个雌株选择20个子代提取DNA，共73株。将DNA稀释至10ng/μl，作为多重PCR的模板。 

利用前述的微卫星DNA标记引物组合对所有DNA样本进行扩增。 

对PCR产物进行毛细管电泳检测，并利用GeneMapper（Applied Biosystems）软件读出所有样品的电泳分离片段长度，统计数据。 

利用Cervus（Field Genetics）软件对亲子代群体进行分析，根据计算得出的LOD值推断可能的亲子代关系组合。结果显示88.3%以上的结果处于95%的置信区间内，可见利用微卫星DNA标记技术进行种质鉴定具有较高的准确率，对于林木育种等工作的应用有比较重要的参考作用。 

微卫星DNA标记具有稳定性强、实验重复性高、多态性丰富、种间转移性高及共显性等优点。大量的理论及应用研究已经表明，该标记技术在实验操作中对扩增模板DNA质量要求低，具有一定的退火温度缓冲范围，引物扩增错配率低，且扩增目的条带可稳定出现，便于自动化分析；特别是近几年借助高通量测序技术以及不同类型的微卫星DNA标记数据库的建立，使微卫星DNA标记成为进行属内近缘种的遗传多样性分析、指纹图谱构建、及亲缘关系鉴定等应用最理想的分子标记类型之一。因此，基于此标记技术，本发明开发了杨属派间不同种亲缘关系的鉴定方法和鉴定试剂盒。 

综上，应用本发明的技术方案具备以下有益效果： 

1.本发明的杨属派间不同种亲缘关系的鉴定方法与传统方法相比，高效稳定，一次反应即可完成5个位点的扩增，操作步骤减少，快捷方便，减少了操作失误发生的可能。同时，只需一次反应就可完成对杨树所有派的常见种的身份鉴定。 

2.本发明的微卫星DNA引物组包含5对高多态性引物，可产生大量的高多态性分子标记数据。其中，部分引物扩增位点具有杨树派的特异性（青杨派为218bp，黑杨派为179bp），为林木进化遗传学研究以及杨树种间鉴定提供了直接有力的技术支持。 

3.利用微卫星DNA分子标记构建的杨树种间指纹图谱所对应的材料数目多，涵盖了杨树的所有派，这在杨树系统进化研究中尚属首次。并且该技术对供试个体的年龄、完整性等没有具体要求，可用于单叶片或苗期鉴定。 

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 

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