检测小麦中是否含有高大山羊草染色体片段的方法及其专用引物

摘要

本发明公开了检测或辅助检测小麦中是否含有高大山羊草染色体片段的方法及其专用引物。该专用引物是由MAG2137、BF200742、Xgwm135、Xgwm140、BE500714、BE489692、BF604958、BE585781和BG262882这9种引物对组成的组合物。本发明的检测或辅助检测小麦中是否含有高大山羊草染色体片段的方法与基因组原位杂交实验检测待测小麦是否含有高大山羊草染色体片段的方法的一致性为100％。本发明可用于小麦杂交群体的筛选、鉴定与辅助选育具有高大山羊草优良性状(籽粒微量元素(Fe和Zn)含量高及高品质)的小麦新品系/品种。

说明书

技术领域

本发明涉及作物分子遗传育种领域中一种检测小麦中是否含有高大山羊草染色体片段的 方法及其专用引物。

背景技术

全球有超过30亿的人口处在体内缺Fe和Zn元素的“隐性饥饿”状态下，有超过2.5亿 儿童不同程度的缺乏Fe和Zn元素(Underwood等，1998)，有超过16亿儿童蛋白质摄取量 严重不足(Brinch-Pedersen等,2007)。矿质元素特别是微量元素缺乏和蛋白质摄入量不足 将增加社会医疗保健的开支，严重阻碍社会经济的发展(Graham等,2001)。我国小麦籽粒矿 质元素尤其是Fe和Zn元素含量还不能满足人们的基本需求(朱展才和吴兆苏，1991；张勇 等，2007)，因此，需要改良我国小麦矿质元素含量来改善人们的营养状况。通过往土壤里施 用含微量元素的肥料(杨莉琳等，2008)和选择矿质含量高的小麦基因型作为亲本进行育种 工作(张勇等，2007)都是可以提高小麦籽粒Fe和Zn元素含量的有效途径。但是，在土壤 偏碱性的情况下，施用微量元素肥料也于事无补(Lavado等，2001)，施用微量元素肥料将 增加投入成本并且施用过量还会对土壤造成污染。因此，选择矿质元素含量高的小麦亲本或 培育含有微量元素高效吸收基因的小麦品种是最为有效和经济的手段。

研究发现，二倍体、四倍体和六倍体小麦吸收和转运Zn的效率各不相同，而这种差异是 由不同倍性小麦的染色体数目不同引起的(Cakmak等，1999)。小麦的远缘物种能够高效吸 收矿质元素(Welch,1995)和转运矿质元素(Schlegel等，1998)，其主要原因是因为小麦 远缘物种部分染色体上携带有控制矿质元素吸收和转运的基因(Cakmak等，1997)。因此， 可以利用染色体工程的方法将小麦远缘物种中携带高效吸收和转运微量元素尤其是Fe和Zn 元素的染色体或染色体片段导入小麦，达到有效提高小麦籽粒Fe和Zn元素含量的目的。

高大山羊草(Aegilops longissima，2n＝14，染色体组为S^lS^l)，是小麦的远缘物种及 小麦育种的优异基因源。高大山羊草高抗小麦白粉病(Ceoloni等1992；Cenci等，1999)、 叶锈病和麦二叉蚜(Gill等，1985)、抗干旱胁迫(Rekika等，1998；Nevo和Chen，2010) 和盐胁迫(Nevo和Chen，2010)、对小麦加工品质有显著正效应(Garg等，2009)，能够显 著提高小麦籽粒Fe和Zn元素含量(Wang等，2011)。目前，对小麦加工品质有显著正效应 的基因(Garg等，2009)定位在1S^l染色体上；此外，高大山羊草1S^l染色体导入小麦能显著 提高小麦籽粒Fe和Zn元素含量，说明促进小麦高效吸收Fe和Zn元素的基因定位在1S^l染色 体上(Wang等，2011)。因此，高大山羊草1S^l染色体臂特异分子标记的建立将对相应杂交群 体的的筛选与鉴定，以至辅助选育籽粒Fe和Zn元素含量高及高品质小麦品系/品种具有重要 意义。

参考文献：

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2、Ceoloni C,Del Signore G,Ercoli L,Donini P.Locating the alien chromatin  segment in wheat-Aegilops longissima mildew resistant transfers.Hereditas,1992, 116:239-245.

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7、Wang SW,Yin LN,Tanaka H,Tanaka K,Tsujimoto H.Wheat-Aegilops chromosome  addition lines showing high iron and zinc contents in grains.Breeding Sci,2011, 61:189-195.

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何检测或辅助检测小麦中是否含有高大山羊草染色体片 段。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种检测或辅助检测小麦中是否含有高大山羊 草染色体片段的方法。

本发明所提供的检测或辅助检测小麦中是否含有高大山羊草染色体片段的方法,包括如 下步骤：

1)分别以待测小麦、参比小麦和高大山羊草的基因组DNA为模板，用9种引物对分别进 行PCR扩增，得到所述9种引物对的待测小麦PCR产物、所述9种引物对的参比小麦PCR产 物和所述9种引物对的高大山羊草PCR产物；所述参比小麦为不含高大山羊草染色体片段的 小麦，作为确定高大山羊草特异条带的参比；

2)将所述9种引物对的待测小麦PCR产物、所述9种引物对的参比小麦PCR产物和所述 9种引物对的高大山羊草PCR产物进行电泳，根据电泳结果确定所述9种引物对的待测小麦 PCR产物中是否含有高大山羊草相应引物对的特异条带，如果所述9种引物对的待测小麦PCR 产物中至少有一种引物对的待测小麦PCR产物中含有高大山羊草相应引物对的特异条带，所 述待测小麦含有高大山羊草染色体片段或候选含有高大山羊草染色体片段；如果所述9种引 物对的待测小麦PCR产物中均不含有高大山羊草相应引物对的特异条带，所述待测小麦不含 有高大山羊草的染色体片段或候选不含有高大山羊草的染色体片段；

所述高大山羊草相应引物对的特异条带为同一种引物对的高大山羊草PCR产物含有但所 述同一种引物对的所述参比小麦的PCR产物不含有的条带；

所述9种引物对的名称分别为MAG2137、BF200742、Xgwm135、Xgwm140、BE500714、BE489692、 BF604958、BE585781和BG262882；

所述MAG2137由序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成；所述 BF200742由序列表中SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的两条单链DNA组成；所述Xgwm135 由序列表中SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的两条单链DNA组成；所述Xgwm140由序列表 中SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的两条单链DNA组成；所述BE500714由序列表中SEQ ID  No.9和SEQ ID No.10所示的两条单链DNA组成；所述BE489692由序列表中SEQ ID No.11 和SEQ ID No.12所示的两条单链DNA组成；所述BF604958由序列表中SEQ ID No.13和SEQ  ID No.14所示的两条单链DNA组成；所述BE585781由序列表中SEQ ID No.15和SEQ ID No.16 所示的两条单链DNA组成；所述BG262882由序列表中SEQ ID No.17和SEQ ID No.18所示的 两条单链DNA组成。所述9种引物对或/和各引物对中的所述两条单链DNA均独立包装。

上述PCR扩增中，每15μL PCR扩增反应体系中含有25ng的模板DNA、0.75U Taq DNA聚 合酶、200μM的dNTPs、含Mg²⁺的1.5μL 10×PCR缓冲溶液、10μM正向引物、10μM反向 引物、其余为无菌双蒸馏水。

所述PCR扩增采用的引物退火条件可为52-57℃退火45s，其中，用所述MAG2137进行 PCR扩增的退火条件为52℃退火45s，用所述Xgwm135进行PCR扩增和用所述Xgwm140进行 PCR扩增的退火条件均为55℃退火45s，用所述BF200742进行PCR扩增、用所述BE500714 进行PCR扩增、用所述BE489692进行PCR扩增、用所述BF604958进行PCR扩增、用所述 BE585781进行PCR扩增和用所述BG262882进行PCR扩增的退火条件均为57℃退火45s。

所述PCR扩增中，用所述MAG2137进行PCR扩增采用的PCR反应温度程序如下：94℃预 变性3min，然后进行如下35个循环：94℃变性45s，52℃退火45s，72℃延伸2min；最后 72℃延伸10min，4℃保存；

所述PCR扩增中，用所述Xgwm135进行PCR扩增和用所述Xgwm140进行PCR扩增采用的 PCR反应温度程序如下：94℃预变性3min，然后进行如下35个循环：94℃变性45s，55℃退 火45s，72℃延伸2min；最后72℃延伸10min，4℃保存；

所述PCR扩增中，用所述BF200742进行PCR扩增、用所述BE500714进行PCR扩增、用 所述BE489692进行PCR扩增、用所述BF604958进行PCR扩增、用所述BE585781进行PCR扩 增和用所述BG262882进行PCR扩增采用的PCR反应温度程序如下：94℃预变性3min，然后 进行如下35个循环：94℃变性45s，57℃退火45s，72℃延伸2min；最后72℃延伸10min， 4℃保存。

所述电泳中，所述MAG2137、所述Xgwm135和所述Xgwm140引物对的待测小麦PCR产物、 参比小麦PCR产物和高大山羊草PCR产物均采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，所述非变性聚 丙烯酰胺凝胶电泳中，所述聚丙烯酰胺凝胶的浓度为8％(质量百分含量)，所述聚丙烯酰胺 凝胶的交联度为2.5％；所述电泳中，所述BF200742、所述BE500714、所述BE489692、所述 BF604958、所述BE585781和所述BG262882引物对的待测小麦PCR产物、参比小麦PCR产物 和高大山羊草PCR产物均采用琼脂糖凝胶电泳，所述琼脂糖凝胶的浓度为2％(质量百分含量)。

上述方法中，所述参比小麦可为下述五种小麦中的至少一种：中国春小麦、一粒小麦 (美国堪萨斯州立大学小麦遗传与基因组资源中心(http://www.k-state.edu/wgrc/)中编 号为TA136)、圆锥小麦(美国堪萨斯州立大学小麦遗传与基因组资源中心 (http://www.k-state.edu/wgrc/)中编号为TA10543)、绵阳11小麦和绵阳15小麦。

为解决上述技术问题，本发明还提供了检测或辅助检测小麦是否含有高大山羊草染色体 片段的下述产品：检测或辅助检测小麦是否含有高大山羊草染色体片段的组合物1、含有组 合物1的试剂或试剂盒、检测或辅助检测小麦是否含有高大山羊草染色体片段的组合物2， 含有组合物2的试剂或试剂盒、检测或辅助检测小麦是否含有高大山羊草染色体片段的引物 对和含有该引物对的试剂或试剂盒。

本发明所提供的检测或辅助检测小麦是否含有高大山羊草染色体片段的组合物1，由名 称分别为所述MAG2137、所述BF200742、所述Xgwm135、所述Xgwm140、所述BE500714、所 述BE489692、所述BF604958、所述BE585781和所述BG262882的这9种引物对组成的组合物。

上述组合物1中，所述9种引物对中的每种引物对均单独包装，所述9种引物对的摩尔 数均相同。

本发明所提供的检测或辅助检测小麦是否含有高大山羊草染色体片段的组合物2，由所 述BE489692与下述8种引物对中7种、6种、5种、4种、3种、2种或1种引物对进行组合 得到的组合物：所述MAG2137、所述BF200742、所述Xgwm135、所述Xgwm140、所述BE500714、 所述BF604958、所述BE585781和所述BG262882。

上述组合物2中，每种引物对均单独包装，各种引物对的摩尔数相同。

本发明所提供的检测或辅助检测小麦是否含有高大山羊草染色体片段的引物对，所述引 物对为BE489692。

上文中，各个引物对中的所述两条单链DNA均独立包装。

本发明所提供的检测或辅助检测小麦是否含有高大山羊草染色体片段的试剂或试剂盒， 为A或B或C：

A、检测或辅助检测小麦是否含有高大山羊草染色体片段的试剂或试剂盒，含有所述的检 测或辅助检测小麦是否含有高大山羊草染色体片段的引物对组合物1；

B、检测或辅助检测小麦是否含有高大山羊草染色体片段的试剂或试剂盒，含有所述的 检测或辅助检测小麦是否含有高大山羊草染色体片段的引物对组合物2；

C、检测或辅助检测小麦是否含有高大山羊草染色体片段的试剂或试剂盒，含有所述的 检测或辅助检测小麦是否含有高大山羊草染色体片段的引物对BE489692；

为解决上述技术问题，本发明还提供了检测或辅助检测小麦是否含有高大山羊草染色体 片段的引物对组合物或引物对或试剂或试剂盒的制备方法，包括将上述各引物对的所述两条 单链DNA分别单独包装的步骤。

为解决上述技术问题，本发明还提供了下述A或B的应用：

A、上述引物对组合物、上述引物对、上述试剂或试剂盒和上述方法在检测或辅助检测小 麦是否含有高大山羊草染色体片段中的应用；

B、上述引物对组合物、上述引物对、上述试剂或试剂盒和上述方法在小麦育种中的应用。

本发明所提供的小麦的育种方法也属于本发明保护的范围，所述小麦的育种方法包括将 上述检测或辅助检测小麦是否含有高大山羊草染色体片段的方法得到的含有高大山羊草染色 体片段或候选含有高大山羊草染色体片段的待测小麦作为亲本进行杂交育种的步骤。

上文中，所述待测小麦和所述小麦可为小麦、或小麦和含有高大山羊草染色体片段的植 物杂交得到的杂交小麦，所述待测小麦具体可为中国春1B缺体和中国春-高大山羊草1S^l附加 系进行杂交得到的F₂群体；如所述待测小麦为中国春1B缺体与美国堪萨斯州立大学小麦遗 传与基因组资源中心(http://www.k-state.edu/wgrc/)中编号为TA3573的中国春-高大山 羊草1S^l附加系进行杂交得到的F₂群体。所述中国春1B缺体是美国堪萨斯州立大学小麦遗 传与基因组资源中心(http://www.k-state.edu/wgrc/)中编号为TA6550中国春1B单体的 自交F₁后代中得到的染色体数目2n＝40的1B缺体植株。

上述文中，所述高大山羊草染色体片段可为高大山羊草1S^l染色体片段。

本发明获得了如9种高大山羊草1S^l染色体臂的新标记：MAG2137、BF200742、Xgwm135、 Xgwm140、BE500714、BE489692、BF604958、BE585781和BG262882。本发明采用上述9种 高大山羊草1S^l染色体新标记的检测或辅助检测待测小麦中是否含有高大山羊草染色体片 段的方法与基因组原位杂交实验检测待测小麦是否含有高大山羊草染色体片段的方法的一 致性为100％。本发明可用于小麦杂交群体的筛选、鉴定与辅助选育具有高大山羊草优良性状 (如籽粒微量元素(Fe和Zn)含量高及高品质)的小麦新品系/品种。

附图说明

图1为引物对MAG2137对供试材料扩增结果的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱：A为利 用高大山羊草、中国春-高大山羊草1S^l附加系和参比小麦筛选引物对MAG2137的图谱；B 为利用一套中国春-高大山羊草附加系(1S^l-7S^l附加系)对引物对MAG2137进行染色体定位 的图谱；C为利用中国春-高大山羊草1S^l#2L端体附加系和中国春-高大山羊草1S^l#2S端体 附加系对引物对MAG2137进行染色体臂定位的图谱；箭头所示为引物对MAG2137扩增出的 650bp高大山羊草特异DNA片段。

图2为引物对BF200742对供试材料扩增结果的琼脂糖凝胶电泳图谱：A为利用高大山羊 草、中国春-高大山羊草1S^l附加系和参比小麦筛选引物对BF200742的图谱；B为利用一套 中国春-高大山羊草附加系(1S^l-7S^l附加系)对引物对BF200742进行染色体定位的图谱；C 为利用中国春-高大山羊草1S^l#2L端体附加系和中国春-高大山羊草1S^l#2S端体附加系对 引物对BF200742进行染色体臂定位的图谱；箭头所示为引物对BF200742扩增出的1300bp 高大山羊草特异DNA片段。

图3为引物对Xgwm135对供试材料扩增结果的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱：A为利 用高大山羊草、中国春-高大山羊草1S^l附加系和参比小麦筛选引物对Xgwm135的图谱；B 为利用一套中国春-高大山羊草附加系(1S^l-7S^l附加系)对引物对Xgwm135进行染色体定位 的图谱；C为利用中国春-高大山羊草1S^l#2L端体附加系和中国春-高大山羊草1S^l#2S端体 附加系对引物对Xgwm135进行染色体臂定位的图谱；箭头所示为引物对Xgwm135扩增出的 220bp和275bp高大山羊草特异DNA片段。

图4为引物对Xgwm140对供试材料扩增结果的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱：A为利 用高大山羊草、中国春-高大山羊草1S^l附加系和参比小麦筛选引物对Xgwm140的图谱；B 为利用一套中国春-高大山羊草附加系(1S^l-7S^l附加系)对引物对Xgwm140进行染色体定位 的图谱；C为利用中国春-高大山羊草1S^l#2L端体附加系和中国春-高大山羊草1S^l#2S端体 附加系对引物对Xgwm140进行染色体臂定位的图谱；箭头所示为引物对Xgwm140扩增出的 200bp高大山羊草特异DNA片段。

图5为引物对BE500714对供试材料扩增结果的琼脂糖凝胶电泳图谱：A为利用高大山羊 草、中国春-高大山羊草1S^l附加系和参比小麦筛选引物对BE500714的图谱；B为利用一套 中国春-高大山羊草附加系(1S^l-7S^l附加系)对引物对BE500714进行染色体定位的图谱；C 为利用中国春-高大山羊草1S^l#2L端体附加系和中国春-高大山羊草1S^l#2S端体附加系对 引物对BE500714进行染色体臂定位的图谱；箭头所示为引物对BE500714扩增出的520bp高 大山羊草特异DNA片段。

图6为引物对BE489692对供试材料扩增结果的琼脂糖凝胶电泳图谱：A为利用高大山羊 草、中国春-高大山羊草1S^l附加系和参比小麦筛选引物对BE489692的图谱；B为利用一套 中国春-高大山羊草附加系(1S^l-7S^l附加系)对引物对BE489692进行染色体定位的图谱；C 为利用中国春-高大山羊草1S^l#2L端体附加系和中国春-高大山羊草1S^l#2S端体附加系对 引物对BE489692进行染色体臂定位的图谱；箭头所示为引物对BE489692扩增出的480bp高 大山羊草特异DNA片段。

图7为引物对BF604958对供试材料扩增结果的琼脂糖凝胶电泳图谱：A为利用高大山羊 草、中国春-高大山羊草1S^l附加系和参比小麦筛选引物对BF604958的图谱；B为利用一套 中国春-高大山羊草附加系(1S^l-7S^l附加系)对引物对BF604958进行染色体定位的图谱；C 为利用中国春-高大山羊草1S^l#2L端体附加系和中国春-高大山羊草1S^l#2S端体附加系对 引物对BF604958进行染色体臂定位的图谱；箭头所示为引物对BF604958扩增出的650bp高 大山羊草特异DNA片段。

图8为引物对BE585781对供试材料扩增结果的琼脂糖凝胶电泳图谱：A为利用高大山羊 草、中国春-高大山羊草1S^l附加系和参比小麦筛选引物对BE585781的图谱；B为利用一套 中国春-高大山羊草附加系(1S^l-7S^l附加系)对引物对BE585781进行染色体定位的图谱；C 为利用中国春-高大山羊草1S^l#2L端体附加系和中国春-高大山羊草1S^l#2S端体附加系对 引物对BE585781进行染色体臂定位的图谱；箭头所示为引物对BE585781扩增出的140bp高 大山羊草特异DNA片段。

图9为引物对BG262882对供试材料扩增结果的琼脂糖凝胶电泳图谱：A为利用高大山羊 草、中国春-高大山羊草1S^l附加系和参比小麦筛选引物对BG262882的图谱；B为利用一套 中国春-高大山羊草附加系(1S^l-7S^l附加系)对引物对BG262882进行染色体定位的图谱；C 为利用中国春-高大山羊草1S^l#2L端体附加系和中国春-高大山羊草1S^l#2S端体附加系对 引物对BG262882进行染色体臂定位的图谱；箭头所示为引物对BG262882扩增出的770bp高 大山羊草特异DNA片段。

图10为引物对MAG2137对中国春1B缺体和中国春-高大山羊草1S^l附加系的部分杂交 F₂分离群体的扩增结果的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱；箭头所示为引物对MAG2137扩增 出的650bp高大山羊草特异DNA片段。

图11为引物对BF200742对中国春1B缺体和中国春-高大山羊草1S^l附加系的部分杂交 F₂分离群体的扩增结果的琼脂糖凝胶电泳图谱；箭头所示为引物对BF200742扩增出的1300bp 高大山羊草特异DNA片段。

图12为引物对Xgwm135对中国春1B缺体和中国春-高大山羊草1S^l附加系的部分杂交 F₂分离群体的扩增结果的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱；箭头所示为引物对Xgwm135扩增 出的220bp和275bp高大山羊草特异DNA片段。

图13为引物对Xgwm140对中国春1B缺体和中国春-高大山羊草1S^l附加系的部分杂交 F₂分离群体的扩增结果的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱；箭头所示为引物对Xgwm140扩增 出的200bp高大山羊草特异DNA片段。

图14为引物对BE500714对中国春1B缺体和中国春-高大山羊草1S^l附加系的部分杂交 F₂分离群体的扩增结果的琼脂糖凝胶电泳图谱；箭头所示为引物对BE500714扩增出的520bp 高大山羊草特异DNA片段。

图15为引物对BE489692对中国春1B缺体和中国春-高大山羊草1S^l附加系的部分杂交 F₂分离群体的扩增结果的琼脂糖凝胶电泳图谱；箭头所示为引物对BE489692扩增出的480bp 高大山羊草特异DNA片段。

图16为引物对BF604958对中国春1B缺体和中国春-高大山羊草1S^l附加系的部分杂交 F₂分离群体的扩增结果的琼脂糖凝胶电泳图谱；箭头所示为引物对BF604958扩增出的650bp 高大山羊草特异DNA片段。

图17为引物对BE585781对中国春1B缺体和中国春-高大山羊草1S^l附加系的部分杂交 F₂分离群体的扩增结果的琼脂糖凝胶电泳图谱；箭头所示为引物对BE585781扩增出的140bp 高大山羊草特异DNA片段。

图18为引物对BG262882对中国春1B缺体和中国春-高大山羊草1S^l附加系的部分杂交 F₂分离群体的扩增结果的琼脂糖凝胶电泳图谱；箭头所示为引物对BG262882扩增出的770bp 高大山羊草特异DNA片段。

图19为基因组原位杂交鉴定分子标记鉴定出的部分中国春1B缺体和中国春-高大山羊 草1S^l附加系的部分杂交F₂分离群体的杂交图谱：A为Aelon-1单株的基因组原位杂交图谱； B为Aelon-5单株的基因组原位杂交图谱；C为Aelon-67单株的基因组原位杂交图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本 发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的一粒小麦(TA136)、圆锥小麦(TA10543)、高大山羊草(TA1910)、 中国春-高大山羊草1S^l#2附加系(TA3573)、中国春-高大山羊草2S^l#3附加系(TA7544)、 中国春-高大山羊草3S^l#3附加系(TA7545)、中国春-高大山羊草4S^l#3附加系(TA7546)、 中国春-高大山羊草5S^l#3附加系(TA7547)、中国春-高大山羊草6S^l#3附加系(TA7548)、 中国春-高大山羊草7S^l#3附加系(TA7549)、中国春-高大山羊草1S^l#2S端体附加系 (TA7515)、中国春-高大山羊草1S^l#2L端体附加系(TA7516)和中国春1B单体(TA6550) 由美国堪萨斯州立大学小麦遗传与基因组资源中心Gill BS教授提供，公众可从美国堪萨 斯州立大学小麦遗传与基因组资源中心(http://www.k-state.edu/wgrc/)有偿获得，该生 物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的绵阳11小麦(MY11)和中国春(CS)(Liu C,Yang ZJ,Li GR,Zeng  ZX,Zhang Y,Zhou JP,Liu ZH,Ren ZL.2008.Isolation of a new repetitive DNA  sequence from Secale africanum enables targeting of Secale chromatin in wheat  background.Euphytica,159(1-2):249-258.)；绵阳15(MY15)(Zhou JP,Zhang HY,Yang  ZJ,Li GR,Hu LJ,Lei MP,Liu C,Zhang Y,Zhang Y,Ren ZL.2012.Characterization  of a new T2DS.2DL-？R translocation triticale ZH-1 with multiple resistances to  diseases.Genet Resour Crop Evol,59(6):1161-1168.)由电子科技大学生命科学与技术 学院杨足君教授提供，公众可从山东省农业科学院作物所获得，该生物材料只为重复本发 明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、高大山羊草分子标记用于检测小麦是否含有高大山羊草染色体片段

一、制备检测或辅助检测小麦是否含有高大山羊草染色体片段的PCR引物对组合物

本步骤制备的检测或辅助检测小麦是否含有高大山羊草染色体片段的PCR引物对组合物， 由名称为MAG2137的检测或辅助检测小麦是否含有高大山羊草染色体片段的引物对、名称为 BF200742的检测或辅助检测小麦是否含有高大山羊草染色体片段的引物对、名称为Xgwm135 的检测或辅助检测小麦是否含有高大山羊草染色体片段的引物对、名称为Xgwm140的检测或 辅助检测小麦是否含有高大山羊草染色体片段的引物对、名称为BE500714的检测或辅助检测 小麦是否含有高大山羊草染色体片段的引物对、名称为BE489692的检测或辅助检测小麦是否 含有高大山羊草染色体片段的引物对、名称为BF604958的检测或辅助检测小麦是否含有高大 山羊草染色体片段的引物对、名称为BE585781的检测或辅助检测小麦是否含有高大山羊草染 色体片段的引物对、名称为BG262882的检测或辅助检测小麦是否含有高大山羊草染色体片段 的引物对。其中，MAG2137由序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组 成，BF200742由序列表中SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的两条单链DNA组成，Xgwm135 由序列表中SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的两条单链DNA组成，Xgwm140由序列表中SEQ  ID No.7和SEQ ID No.8所示的两条单链DNA组成，BE500714由序列表中SEQ ID No.9和SEQ  ID No.10所示的两条单链DNA组成，BE489692由序列表中SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所 示的两条单链DNA组成，BF604958由序列表中SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示的两条单 链DNA组成，BE585781由序列表中SEQ ID No.15和SEQ ID No.16所示的两条单链DNA组成， BG262882由序列表中SEQ ID No.17和SEQ ID No.18所示的两条单链DNA组成。上述检测或 辅助检测小麦是否含有高大山羊草染色体片段的PCR引物对组合物中，MAG2137、BF200742、 Xgwm135、Xgwm140、BE500714、BE489692、BF604958、BE585781和BG262882均独立包装， 每种引物对中的两条单链DNA的摩尔比均为1：1。

二、高大山羊草分子标记用于检测中国春1B缺体和中国春-高大山羊草1S^l附加系杂 交F₂群体中是否含有高大山羊草染色体片段

从中国春1B单体(2n＝41)自交F₁后代中筛选出染色体数目2n＝40的中国春1B缺体 植株。将中国春-高大山羊草1S^l附加系植株(TA3573)与中国春1B缺体植株进行杂交， 其杂交F₁代植株的基因组染色体中因为存在1B和1S^l双单体，不能正常配对，因此，1B 和1S^l染色体很容易在着丝粒处发生断裂并重接。利用获得的9对高大山羊草染色体标记 对中国春1B缺体和中国春-高大山羊草1S^l附加系杂交F₂群体进行筛选，随机选取杂交F₂群体中编号为Aelon-1至Aelon-101株的101个F₂植株(简称Aelon-1至Aelon-101)每 个单株均作为待测小麦，用本发明的方法检测待测小麦是否含有高大山羊草染色体特异 DNA片段。检测或辅助检测小麦是否含有高大山羊草染色体片段的方法,包括如下步骤：

1)分别以待测小麦(Aelon-1至Aelon-101中的任一个单株)、参比小麦(中国春小 麦)、中国春-高大山羊草1S^l#2附加系(TA3573)(简称小麦-高大山羊草附加系)和高大山 羊草的基因组DNA为模板，用9种引物对分别进行PCR扩增，得到9种引物对的待测小麦PCR 产物、9种引物对的参比小麦PCR产物、9种引物对的小麦-高大山羊草附加系PCR产物和9 种引物对的高大山羊草PCR产物；参比小麦不含高大山羊草染色体片段的小麦，作为确定高 大山羊草特异条带的参比；所述9种引物对为步骤一的MAG2137、BF200742、Xgwm135、Xgwm140、 BE500714、BE489692、BF604958、BE585781和BG262882；

2)将9种引物对的待测小麦PCR产物、9种引物对的参比小麦PCR产物、9种引物对的 小麦-高大山羊草附加系PCR产物和9种引物对的高大山羊草PCR产物进行电泳，根据电泳结 果确定9种引物对的待测小麦PCR产物中是否含有高大山羊草相应引物对的特异条带，如果 9种引物对的待测小麦PCR产物中至少有一种引物对的待测小麦PCR产物中含有高大山羊草 相应引物对的特异条带，则待测小麦含有高大山羊草染色体片段或候选含有高大山羊草染色 体片段；如果9种引物对的待测小麦PCR产物中均不含有高大山羊草相应引物对的特异条带， 则待测小麦不含有高大山羊草的染色体片段或候选不含有高大山羊草的染色体片段；高大山 羊草相应引物对的特异条带为同一种引物对的高大山羊草PCR产物含有但所述同一种引物对 的参比小麦的PCR产物不含有的条带。

具体方法如下：提取高大山羊草、中国春-高大山羊草1S^l植株附加系(TA3573)、 Aelon-1至Aelon-101植株和中国春小麦的各个单株的基因组DNA，用步骤一的MAG2137、 BF200742、Xgwm135、Xgwm140、BE500714、BE489692、BF604958、BE585781和BG262882这9 种引物对中任一引物对分别进行扩增，PCR反应体系如实施例2中表3所示。PCR反应在 BIO-RAD PCR扩增仪上进行，其中，MAG2137引物对的扩增程序为：94℃预变性3min，然 后进行如下35个循环：94℃变性45s，52℃退火45s，72℃延伸2min；最后72℃延伸10min， 4℃保存；Xgwm135和Xgwm140引物对扩增程序为：94℃预变性3min，然后进行如下35个 循环：94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸2min；最后72℃延伸10min，4℃保存；BF200742、 BE500714、BE489692、BF604958、BE585781和BG262882引物对的扩增程序为：94℃预变性 3min，然后进行如下35个循环：94℃变性45s，57℃退火45s，72℃延伸2min；最后72℃ 延伸10min，4℃保存，得到上述9种引物对中的每一种引物对的高大山羊草的PCR扩增产 物、中国春-高大山羊草1S^l附加系植株(TA3573)的PCR扩增产物、Aelon-1至Aelon-101 植株的PCR扩增产物和中国春小麦(参比小麦)的PCR扩增产物。

将上述9对引物对的每一种引物对的高大山羊草的PCR扩增产物、中国春-高大山羊 草1S^l附加系植株(TA3573)的PCR扩增产物、Aelon-1至Aelon-101植株(待测小麦) 的PCR扩增产物和中国春小麦(参比小麦)的PCR扩增产物进行电泳，其中，MAG2137、Xgwm135 和Xgwm140引物对的高大山羊草的PCR扩增产物、中国春-高大山羊草1S^l附加系植株 (TA3573)的PCR扩增产物、Aelon-1至Aelon-101植株(待测小麦)的PCR扩增产物和 中国春小麦(参比小麦)的PCR扩增产物均采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，非变性聚丙烯酰 胺凝胶电泳中，聚丙烯酰胺凝胶的浓度为8％(质量百分含量)，聚丙烯酰胺凝胶的交联度为 2.5％；电泳缓冲液为1×TBE，分别取15μL上述同一种引物对的扩增产物，加入3μL指示 剂(含0.1％溴酚蓝和0.1％二甲苯青)，混匀，上样量为3μL，采用180V恒定电压电泳 约55min，所用康为世纪公司生产的DM2000plus DNA Marker(8条分子量分别为：100bp， 250bp,500bp,750bp,1000bp,2000bp,3000bp和5000bp)，经硝酸银染色30min后观察照 相。BF200742、BE500714、BE489692、BF604958、BE585781和BG262882引物对的高大山羊 草的PCR扩增产物、中国春-高大山羊草1S^l附加系植株(TA3573)的PCR扩增产物、Aelon-1 至Aelon-101植株(待测小麦)的PCR扩增产物和中国春小麦(参比小麦)的PCR扩增产物 均采用琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶的浓度为2％(质量百分含量)，电泳缓冲液为1×TAE， 分别取上述同一种引物对的扩增产物10μL，在150V恒定电压下电泳约25min，所用康为 世纪公司生产的DM2000plus DNA Marker(8条分子量分别为：100bp，250bp,500bp,750bp, 1000bp,2000bp,3000bp和5000bp)，然后用1μg/mL的溴化乙锭溶液进行染色30min，最 后在GDS-Gel Dol 2000紫外凝胶成像系统下扫描照像。

根据电泳结果确定9种引物对的待测小麦PCR产物中是否含有高大山羊草相应引物对的 特异条带，如果9种引物对的待测小麦PCR产物中至少有一种引物对的待测小麦PCR产物中 含有高大山羊草相应引物对的特异条带，则待测小麦含有高大山羊草染色体片段或候选含有 高大山羊草染色体片段；如果9种引物对的待测小麦PCR产物中均不含有高大山羊草相应引 物对的特异条带，则待测小麦不含有高大山羊草的染色体片段或候选不含有高大山羊草的染 色体片段。

高大山羊草相应引物对的特异条带为同一种引物对的高大山羊草PCR产物含有但所述同 一种引物对的所述参比小麦的PCR产物不含有的条带。

结果表明Xgwm135的Aelon-1的PCR产物和表1的Xgwm135列为“+”的其它植株的 PCR产物和中国春-高大山羊草1S^l附加系植株(TA3573)的PCR产物均含有220bp和275bp 的高大山羊草特异条带(Xgwm135的高大山羊草的PCR产物中含有220bp和275bp条带而 Xgwm135的参比小麦中国春的PCR产物中不含有220bp和275bp条带)，说明Aelon-1和表 1的Xgwm135列为“+”的其它植株均含有高大山羊草染色体片段；Xgwm140的Aelon-1的 PCR产物和表1的Xgwm140列为“+”的其它植株的PCR产物和中国春-高大山羊草1S^l附 加系植株(TA3573)的PCR产物均含有200bp的高大山羊草特异条带(Xgwm140的高大山 羊草的PCR产物中含有该200bp条带而Xgwm140的参比小麦中国春的PCR产物中不含有该 200bp条带)，说明Aelon-1和表1的Xgwm140列为“+”的其它植株均含有高大山羊草染 色体片段；BE500714的Aelon-1的PCR产物和表1的BE500714列为“+”的其它植株的PCR 产物和中国春-高大山羊草1S^l附加系植株(TA3573)的PCR产物均含有520bp的高大山羊 草特异条带(BE500714的高大山羊草的PCR产物中含有该520bp条带而BE500714的参比小 麦中国春的PCR产物中不含有该520bp条带)，说明Aelon-1和表1的BE500714列为“+” 的其它植株均含有高大山羊草染色体片段；BF604958的Aelon-1的PCR产物和表1的 BF604958列为“+”的其它植株的PCR产物和中国春-高大山羊草1S^l附加系植株(TA3573) 的PCR产物均含有650bp的高大山羊草特异条带(BF604958的高大山羊草的PCR产物中含 有该650bp条带而BF604958的参比小麦中国春的PCR产物中不含有该650bp条带)，说明 Aelon-1和表1的BF604958列为“+”的其它植株均含有高大山羊草染色体片段；BE585781 的Aelon-1的PCR产物和表1的BE585781列为“+”的其它植株的PCR产物和中国春-高 大山羊草1S^l附加系植株(TA3573)的PCR产物均含有140bp的高大山羊草特异条带 (BE585781的高大山羊草的PCR产物中含有该140bp条带而BE585781的参比小麦中国春的 PCR产物中不含有该140bp条带)，说明Aelon-1和表1的BE585781列为“+”的其它植株 均含有高大山羊草染色体片段；BG262882的Aelon-1的PCR产物和表1的BG262882列为 “+”的其它植株的PCR产物和中国春-高大山羊草1S^l附加系植株(TA3573)的PCR产物 均含有770bp的高大山羊草特异条带(BG262882的高大山羊草的PCR产物中含有该770bp 条带而BG262882的参比小麦中国春的PCR产物中不含有该770bp条带)，说明Aelon-1和 表1的BG262882列为“+”的其它植株均含有高大山羊草染色体片段；BE489692的Aelon-1 的PCR产物和表1的BE489692列为“+”的其它植株的PCR产物和中国春-高大山羊草1S^l附加系植株(TA3573)的PCR产物均含有480bp的高大山羊草特异条带(BE489692的高大 山羊草的PCR产物中含有该480bp条带而BE489692的参比小麦中国春的PCR产物中不含有 该480bp条带)，说明Aelon-1和表1的BE489692列为“+”的其它植株均含有高大山羊草 染色体片段；MAG2137的Aelon-2的PCR产物和表1的MAG2137列为“+”的其它植株的PCR 产物和中国春-高大山羊草1S^l附加系植株(TA3573)PCR产物均含有650bp的高大山羊草 特异条带(MAG2137的高大山羊草的PCR产物中含有该650bp条带而MAG2137的参比小麦中 国春的PCR产物中不含有该650bp条带)，说明Aelon-2和表1的MAG2137列为“+”的其 它植株均含有高大山羊草染色体片段；BF200742的Aelon-2的PCR产物和表1的BF200742 列为“+”的其它植株的PCR产物和中国春-高大山羊草1S^l附加系植株(TA3573)PCR产物 均含有1300bp的高大山羊草特异条带(BF200742的高大山羊草的PCR产物中含有该1300bp 条带而BF200742的参比小麦中国春的PCR产物中不含有该1300bp条带)，说明Aelon-2 和表1的BF200742列为“+”的其它植株均含有高大山羊草染色体片段。该9种引物对中 任一引物对在Aelon-9、Aelon-12、Aelon-52、Aelon-53、Aelon-57、Aelon-60、Aelon-62、 Aelon-63、Aelon-67和Aelon-87这10株单株中均不能扩增出高大山羊草染色体特异DNA 片段，说明这10株单株中不含有高大山羊草染色体片段。上述检测结果表明Aelon-1至 Aelon-8这8株单株、Aelon-10、Aelon-11、Aelon-13至Aelon-51这39株单株、Aelon-54、 Aelon-55、Aelon-56、Aelon-58、Aelon-59、Aelon-61、Aelon-64、Aelon-65、Aelon-66、 Aelon-68至Aelon-86这19个单株、Aelon-88至Aelon-101这14个单株共91株单株含 有高大山羊草染色体片段，Aelon-9、Aelon-12、Aelon-52、Aelon-53、Aelon-57、Aelon-60、 Aelon-62、Aelon-63、Aelon-67和Aelon-87这10株单株不含有高大山羊草染色体片段。

图10至图18展示了9种引物对的中国春1B缺体和中国春-高大山羊草1S^l附加系杂 交F₂群体Aelon-1至Aelon-101中部分单株PCR扩增结果的电泳结果。

表1、高大山羊草1S^l染色体臂特异分子标记对杂交后代群体的分子检测情况

注：“+”表明在该植株中获得相应引物对的高大山羊草特异条带，而“-”表明该植株 中没有得到相应引物对的高大山羊草特异条带；每行的植株中，只要9个引物对列中有至少 一个“+”，该植株就含有高大山羊草染色体片段；每行的植株中，9个引物对列均为“-”， 该植株不含有高大山羊草染色体片段。

三、基因组原位杂交验证标记鉴定结果的准确性

依据分子标记扩增结果，使用基因组原位杂交技术对步骤二的中国春1B缺体和中国 春-高大山羊草1S^l附加系杂交F₂群体单株Aelon-1至Aelon-101(待测小麦)进行检测， 验证步骤二结果的准确性。基因组原位杂交共需经历如下5个步骤：供试材料根尖前处理、 染色体制片、基因组总DNA提取与处理(包括纯化与超声波打碎)、探针的标记和原位杂 交，具体参考文献(刘成.多年生簇毛麦基因组新重复序列的分离及其在小麦抗病新种质鉴定 中的应用[D].电子科技大学.2010.)，其中探针为用地高辛标记打碎的高大山羊草的基因组 DNA(长度约为400-900bp)，用打碎的中国春基因组DNA(长度约为200-500bp)做封阻，用 1g/mL的抗褪色剂碘化丙啶(Propidium iodide,简写为PI)进行滴片观察。PI可嵌入染 色体上的DNA双链，在荧光显微镜下观察，释放红色荧光；而地高辛标记的探针可与其互 补单链DNA结合，在荧光显微镜下观察，释放绿色荧光，杂交信号绿色与底色红色叠加后 则观察到黄色或黄绿色荧光。因为高大山羊草与小麦基因组亲缘关系很近，因此，在封阻 DNA加入量偏少或探针量偏多或杂交效果不理想的情况下，会有少量探针杂交到小麦染色 体上，致使小麦染色体呈现橙黄色。因此，待测小麦样品中红色或橙黄色染色体为小麦染 色体，有黄绿色荧光杂交信号的待测小麦含有高大山羊草染色体片段，而无黄绿色荧光杂 交信号的待测小麦则不含有高大山羊草染色体片段。

在对Aelon-1至Aelon-101这101株单株进行的基因组原位杂交结果表明Aelon-1至 Aelon-8这8株单株、Aelon-10、Aelon-11、Aelon-13至Aelon-51这39株单株、Aelon-54、 Aelon-55、Aelon-56、Aelon-58、Aelon-59、Aelon-61、Aelon-64、Aelon-65、Aelon-66、 Aelon-68至Aelon-86这19个单株、Aelon-88至Aelon-101这14个单株共91株单株含 有高大山羊草染色体片段，Aelon-9、Aelon-12、Aelon-52、Aelon-53、Aelon-57、Aelon-60、 Aelon-62、Aelon-63、Aelon-67和Aelon-87这10株单株不含有高大山羊草染色体片段。 该检测结果与步骤二的检测结果完全吻合。图19中显示了部分单株的基因组原位杂交结 果：Aelon-1单株(图19中A)和Aelon-5单株(图19中B)的根尖细胞中均含有1条发 黄绿色荧光的染色体或染色体片段，Aelon-67单株(图19中C)的根尖细胞中不含有发黄 绿色荧光的染色体。因此，本发明建立的高大山羊草分子标记可以广泛应用于涉及高大山 羊草染色体导入小麦的分子辅助育种工作中。

实施例2、高大山羊草特异引物对的发现

1、引物对的设计与合成

从国际小麦EST定位工程网(http://wheat.pw.usda.gov/NSF/data.html)选用219 个已经被定位在小麦染色体第一同源群的EST序列为基础来设计EST-STS引物对，共设计 第一同源群EST-STS引物对120对，并且合成了EST-SSR引物对22对，COS引物对30对， PLUG引物对42对，SSR引物对16对，共合成第一同源群引物对230对。

2、引物对的筛选与高大山羊草1S^l染色体特异DNA片段的获得

以表2中提供的高大山羊草、中国春-高大山羊草1S^l#2附加系、一粒小麦、圆锥小麦、 绵阳11小麦、绵阳15小麦和中国春小麦分别作为供试材料，提取上述供试材料的基因组 DNA，以其为模板，用合成的第一同源群引物对对上述7份供试材料的基因组DNA进行PCR 扩增，PCR反应体系如表3所示。PCR反应在BIO-RAD PCR扩增仪上进行，其中，EST-SSR 引物对的扩增程序为：94℃预变性3min，然后进行如下35个循环：94℃变性45s，52℃退 火45s，72℃延伸2min；最后72℃延伸10min，4℃保存；SSR引物对扩增程序为：94℃预变 性3min，然后进行如下35个循环：94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸2min；最后72℃ 延伸10min，4℃保存；EST-STS、COS和PLUG引物对的扩增程序为：94℃预变性3min，然 后进行如下35个循环：94℃变性45s，57℃退火45s，72℃延伸2min；最后72℃延伸10min， 4℃保存。得到上述230对引物对中的每一种引物对的高大山羊草的PCR扩增产物、中国春 -高大山羊草1S^l#2附加系的PCR扩增产物、一粒小麦的PCR扩增产物、圆锥小麦的PCR 扩增产物、绵阳11小麦的PCR扩增产物、绵阳15小麦的PCR扩增产物和中国春小麦的PCR 扩增产物。

表2、供试材料相关信息

注：不同居群下可能分布有同一物种，因此，不同研究者可能利用不同居群下的同一物 种与小麦进行杂交获得附加系，因此，表中#后面的数字表示物种来自不同居群，根据附加系 合成时间先后编号为#1，#2，#3等。S^l为高大山羊草的染色体符号。1S^l-7S^l为高大山羊草第 一到第七同源群染色体。#2和#3后面的S和L分别代表short arm(短臂，简写为S)和long  arm(长臂，简写为L)。

表3、PCR反应体系

各组分 体积(μL) ddH₂O 9.35 含Mg²⁺的10×缓冲溶液 1.5 正向引物(10μM) 1 反向引物(10μM) 1 dNTPs(200μM) 1 Taq DNA聚合酶(5U/μL) 0.15 模板DNA(25ng/μL) 1 总体积 15

将上述230对引物对的每一种引物对的高大山羊草的PCR扩增产物、中国春-高大山 羊草1S^l#2附加系的PCR扩增产物、一粒小麦的PCR扩增产物、圆锥小麦的PCR扩增产物、 绵阳11小麦的PCR扩增产物、绵阳15小麦的PCR扩增产物和中国春小麦的PCR扩增产物 的扩增产物进行电泳，根据电泳结果确定每一种引物对是否可以扩增出高大山羊草特异片 段，对同一种引物对的各个供试材料的PCR产物进行比较，如果一种引物对可以在高大山 羊草和中国春-高大山羊草1S^l#2附加系中扩增出该引物对特异DNA片段，而在参比小麦(一 粒小麦、圆锥小麦、绵阳11小麦、绵阳15小麦和中国春小麦)中则扩增不出该引物对特 异DNA片段，说明该特异DNA片段来自高大山羊草，该引物对能在高大山羊草和参比小麦 中扩增出多态性；如果一种引物对在高大山羊草、中国春-高大山羊草1S^l#2附加系和参比 小麦中扩增不出特异条带，说明该引物对不能在高大山羊草和参比小麦中扩增出多态性。 EST-SSR,SSR和COS引物对的扩增产物采用8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，电泳 缓冲液为1×TBE，分别取15μL上述同一种引物对的扩增产物，加入3μL指示剂(含0.1％ 溴酚蓝和0.1％二甲苯青)，混匀，上样量为3μL，采用180V恒定电压电泳约55min，所 用Marker为康为世纪公司生产的DM2000plus DNA Marker(8条分子量分别为：100bp， 250bp,500bp,750bp,1000bp,2000bp,3000bp和5000bp)，经硝酸银染色30min后观察照 相。PLUG和EST-STS引物对的扩增产物采用2％的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳缓冲液为1 ×TAE，分别取上述同一种引物对的扩增产物10μL，在150V恒定电压下电泳约25min， 所用康为世纪公司生产的DM2000plus DNA Marker(8条分子量分别为：100bp，250bp,500bp, 750bp,1000bp,2000bp,3000bp和5000bp)，然后用1μg/mL的溴化乙锭溶液进行染色 30min，最后在GDS-Gel Dol 2000紫外凝胶成像系统下扫描照像。

结果发现分别有6对EST-STS引物对(BF200742、BE500714、BE489692、BF604958、 BE585781和BG262882)(获得多态性的效率为5.0％)、1对EST-SSR引物对(MAG2137)(获得 多态性的效率为4.5％)和2对SSR引物对(Xgwm135和Xgwm140)(获得多态性的效率为12.5％) 可以在高大山羊草和中国春-高大山羊草1S^l#2附加系中扩增出高大山羊草相应引物对的特 异DNA片段，而在参比小麦(一粒小麦、圆锥小麦、绵阳11小麦、绵阳15小麦和中国春小 麦)中扩增不出高大山羊草相应引物对的特异DNA片段(统计结果见表4)，说明这些DNA片 段来自高大山羊草，第一同源群的PLUG引物对和COS引物对则没有在供试材料中扩增出多 态性。其中，MAG2137引物对能够在高大山羊草和中国春-高大山羊草1S^l#2附加系中扩增出 650bp的高大山羊草特异DNA片段，而在参比小麦中则扩增不出该DNA片段(图1中A)；

BF200742引物对能够在高大山羊草和中国春-高大山羊草1S^l#2附加系中扩增出1300bp的高 大山羊草特异DNA片段，而在参比小麦中则扩增不出该DNA片段(图2中A)；Xgwm135引物对 能够在高大山羊草和中国春-高大山羊草1S^l#2附加系中扩增出220bp和275bp的高大山羊草 特异DNA片段，而在参比小麦中则扩增不出这些DNA片段(图3中A)；Xgwm140引物对能够在 高大山羊草和中国春-高大山羊草1S^l#2附加系中扩增出200bp的高大山羊草特异DNA片段， 而在参比小麦中则扩增不出该DNA片段(图4中A)；BE500714引物对能够在高大山羊草和中 国春-高大山羊草1S^l#2附加系中扩增出520bp的高大山羊草特异DNA片段，而在参比小麦中 则扩增不出该DNA片段(图5中A)；BE489692引物对能够在高大山羊草和中国春-高大山羊草 1S^l#2附加系中扩增出480bp的高大山羊草特异DNA片段，而在参比小麦中则扩增不出该DNA 片段(图6中A)；BF604958引物对能够在高大山羊草和中国春-高大山羊草1S^l#2附加系中扩 增出650bp的高大山羊草特异DNA片段，而在参比小麦中则扩增不出该DNA片段(图7中A)；

BE585781引物对能够在高大山羊草和中国春-高大山羊草1S^l#2附加系中扩增出140bp的高 大山羊草特异DNA片段，而在比小麦中则扩增不出该DNA片段(图8中A)；BG262882引物对能 够在高大山羊草和中国春-高大山羊草1S^l#2附加系中扩增出770bp的高大山羊草特异DNA片 段，而在参比小麦中则扩增不出该DNA片段(图9中A)。因此，共有9对引物对(MAG2137、 BF200742、Xgwm135、Xgwm140、BE500714、BE489692、BF604958、BE585781和BG262882) 可以在高大山羊草和参比小麦中扩增出多态性。

表4、筛选第一同源群引物的统计结果

引物对 筛选第1同源群引物对数 获得多态性的引物对数 多态性比例 EST-STS 120 6 5.0％ EST-SSR 22 1 4.5％ COS 30 0 0 PLUG 42 0 0 SSR 16 2 12.5％

9种引物对的名称分别为MAG2137、BF200742、Xgwm135、Xgwm140、BE500714、BE489692、 BF604958、BE585781和BG262882，每种引物对均由正向引物和反向引物两条单链DNA组成。 其中，MAG2137引物对中正向引物是SEQ ID No.1所示的单链DNA，反向引物是SEQ ID No.2 所示的单链DNA；BF200742引物中正向引物是SEQ ID No.3所示的单链DNA，反向引物是SEQ  ID No.4所示的单链DNA；Xgwm135引物对中正向引物是SEQ ID No.5所示的单链DNA，反向 引物是SEQ ID No.6所示的单链DNA；Xgwm140引物对中正向引物是SEQ ID No.7所示的单链 DNA，反向引物是SEQ ID No.8所示的单链DNA；BE500714引物对中正向引物是SEQ ID No.9 所示的单链DNA，反向引物是SEQ ID No.10所示的单链DNA；BE489692引物对中正向引物是 SEQ ID No.11所示的单链DNA，反向引物是SEQ ID No.12所示的单链DNA；BF604958引物对 中正向引物是SEQ ID No.13所示的单链DNA，反向引物是SEQ ID No.14所示的单链DNA；

E585781引物对中正向引物是SEQ ID No.15所示的单链DNA，反向引物是SEQ ID No.16所示 的单链DNA；BG262882引物对中正向引物是SEQ ID No.17所示的单链DNA，反向引物是SEQ ID  No.18所示的单链DNA，结果如表5所示。

表5、高大山羊草1S^l染色体臂特异分子标记及其相关信息

注:“*”表示PCR产物需要用非变性聚丙烯酰胺胶(PAGE)进行分离和银染，未用* 标注的引物则用2％琼脂糖胶进行分离，用1μg/mL的EB(溴化乙锭)溶液进行染色。F表示 正向引物，R表示反向引物。

3、高大山羊草1S^l单染色体特异片段的验证

研究发现，同一DNA序列可能同时出现在同一物种不同同源群染色体上。为了验证上 述获得1S^l染色体特异片段仅分别分布在高大山羊草1S^l染色体片上，以高大山羊草、一套 中国春-高大山羊草附加系(1S^l-7S^l附加系分别为：中国春-高大山羊草1S^l#2附加系、中 国春-高大山羊草2S^l#3附加系、中国春-高大山羊草3S^l#3附加系、中国春-高大山羊草 4S^l#3附加系、中国春-高大山羊草5S^l#3附加系、中国春-高大山羊草6S^l#3附加系和中国 春-高大山羊草7S^l#3附加系)和中国春小麦(参比小麦)为材料，提取高大山羊草、一套 中国春-高大山羊草附加系(1S^l-7S^l附加系)和中国春小麦的基因组DNA，用上述获得的9 对第一同源群引物对对上述材料的基因组DNA进行PCR扩增，PCR反应体系如表2所示。 PCR反应在BIO-RAD PCR扩增仪上进行，其中，MAG2137引物对的扩增程序为：94℃预变性 3min，然后进行如下35个循环：94℃变性45s，52℃退火45s，72℃延伸2min；最后72℃ 延伸10min，4℃保存；Xgwm135和Xgwm140引物对扩增程序为：94℃预变性3min，然后进 行如下35个循环：94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸2min；最后72℃延伸10min，4℃ 保存；BF200742、BE500714、BE489692、BF604958、BE585781和BG262882引物对的扩增程 序为：94℃预变性3min，然后进行如下35个循环：94℃变性45s，57℃退火45s，72℃延 伸2min；最后72℃延伸10min，4℃保存。得到上述9对引物对中的每一种引物对的高大山 羊草的PCR扩增产物、一套中国春-高大山羊草附加系(1S^l-7S^l附加系)的PCR扩增产物 和中国春小麦(参比小麦)的PCR扩增产物。

将上述9对引物对的每一种引物对的高大山羊草的PCR扩增产物、一套中国春-高大 山羊草附加系(1S^l-7S^l附加系)的PCR扩增产物和中国春小麦(参比小麦)的扩增产物进 行电泳，根据电泳结果确定每一种引物对是否可以扩增出高大山羊草1S^l特异片段，对同 一种引物对的PCR产物进行比较，如果该引物对仅能在高大山羊草和中国春-高大山羊草 1S^l附加系中扩增出该引物对的特异DNA片段，而在中国春-高大山羊草2S^l-7S^l附加系和中 国春小麦(参比小麦)中则扩增不出该特异DNA片段，说明该引物对是高大山羊草1S^l染 色体特异的分子标记。MAG2137、Xgwm135和Xgwm140引物对的扩增产物采用8％的非变性 聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，电泳缓冲液为1×TBE，分别取15μL上述同一种引物对的扩增 产物，加入3μL指示剂(含0.1％溴酚蓝和0.1％二甲苯青)，混匀，上样量为3μL，采 用180V恒定电压电泳约55min，所用康为世纪公司生产的DM2000plus DNA Marker(8条 分子量分别为：100bp，250bp,500bp,750bp,1000bp,2000bp,3000bp和5000bp)，经硝酸 银染色30min后观察照相。BF200742、BE500714、BE489692、BF604958、BE585781和BG262882 引物对的扩增产物采用2％的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳缓冲液为1×TAE，分别取上述同 一种引物对的扩增产物10μL，在150V恒定电压下电泳约25min，所用康为世纪公司生产 的DM2000plus DNA Marker(8条分子量分别为：100bp，250bp,500bp,750bp,1000bp,2000bp, 3000bp和5000bp)，然后用1μg/mL的溴化乙锭溶液进行染色30min，最后在GDS-Gel Dol 2000紫外凝胶成像系统下扫描照像。

结果表明，MAG2137引物对能够在高大山羊草和中国春-高大山羊草1S^l附加系中扩增 出650bp的高大山羊草特异DNA片段，而在中国春-高大山羊草2S^l-7S^l附加系和中国春小 麦(参比小麦)中则扩增不出该DNA片段(图1中B)；BF200742引物对能够在高大山羊 草和中国春-高大山羊草1S^l附加系中扩增出1300bp的高大山羊草特异DNA片段，而在中 国春-高大山羊草2S^l-7S^l附加系和中国春小麦(参比小麦)中则扩增不出该DNA片段(图 2中B)；Xgwm135引物对能够在高大山羊草和中国春-高大山羊草1S^l附加系中扩增出220bp 和275bp的高大山羊草特异DNA片段，而在中国春-高大山羊草2S^l-7S^l附加系和中国春小 麦(参比小麦)中则扩增不出220bp和275bp的DNA片段(图3中B)；Xgwm140引物对能 够在高大山羊草和中国春-高大山羊草1S^l附加系中扩增出200bp的高大山羊草特异DNA片 段，而在中国春-高大山羊草2S^l-7S^l附加系和中国春小麦(参比小麦)中则扩增不出该DNA 片段(图4中B)；BE500714引物对能够在高大山羊草和中国春-高大山羊草1S^l附加系中 扩增出520bp的高大山羊草特异DNA片段，而在中国春-高大山羊草附加系2S^l-7S^l和中国 春小麦(参比小麦)中则扩增不出该DNA片段(图5中B)；BE489692引物对能够在高大 山羊草和中国春-高大山羊草1S^l附加系中扩增出480bp的高大山羊草特异DNA片段，而在 中国春-高大山羊草附加系2S^l-7S^l和中国春小麦(参比小麦)中则扩增不出该DNA片段(图 6中B)；BF604958引物对能够在高大山羊草和中国春-高大山羊草1S^l附加系中扩增出 650bp的高大山羊草特异DNA片段，而在中国春-高大山羊草附加系2S^l-7S^l和中国春小麦 (参比小麦)中则扩增不出该DNA片段(图7中B)；BE585781引物对能够在高大山羊草 和中国春-高大山羊草1S^l附加系中扩增出140bp的高大山羊草特异DNA片段，而在中国春 -高大山羊草附加系2S^l-7S^l和中国春小麦中则扩增不出该DNA片段(图8中B)；BG262882 引物对能够在高大山羊草和中国春-高大山羊草1S^l附加系中扩增出770bp的高大山羊草特 异DNA片段，而在中国春-高大山羊草附加系2S^l-7S^l和中国春小麦(参比小麦)中则扩增 不出该DNA片段(图9中B)，说明上述9对引物对均为高大山羊草1S^l染色体特异标记。

4、高大山羊草1S^l单染色体臂特异标记的建立

为了进一步将获得的9个第一同源群标记定位在高大山羊草染色体臂上，以高大山羊 草、中国春-高大山羊草1S^l#2附加系、中国春-高大山羊草1S^l#2S端体附加系、中国春- 高大山羊草1S^l#2L端体附加系和中国春小麦为材料，提取高大山羊草、中国春-高大山羊 草1S^l#2附加系、中国春-高大山羊草1S^l#2S端体附加系、中国春-高大山羊草1S^l#2L端体 附加系和中国春小麦的基因组DNA，用上述筛选出的9对引物对其进行扩增，PCR反应体 系如表3所示。PCR反应在BIO-RAD PCR扩增仪上进行，各引物对的PCR扩增反应程序同 步骤3，得到上述9对引物对的高大山羊草的PCR扩增产物、中国春-高大山羊草1S^l#2附 加系的PCR扩增产物、中国春-高大山羊草1S^l#2S端体附加系的PCR扩增产物、中国春- 高大山羊草1S^l#2L端体附加系和中国春小麦的PCR扩增产物。

将上述9对引物对的每一种引物对的高大山羊草的PCR扩增产物、中国春-高大山羊 草1S^l#2附加系的PCR扩增产物、中国春-高大山羊草1S^l#2S端体附加系的PCR扩增产物、 中国春-高大山羊草1S^l#2L端体附加系和中国春小麦的PCR扩增产物进行电泳，根据电泳 结果确定每一种引物对在高大山羊草1S^l单染色体臂上的定位，对同一种引物对的PCR产 物进行比较，如果该引物对只能在高大山羊草、中国春-高大山羊草1S^l#2附加系和中国春 -高大山羊草1S^l#2S端体附加系扩增出高大山羊草特异DNA片段，而不能在中国春-高大山 羊草1S^l#2L端体附加系和中国春小麦中扩增出该特异DNA片段，说明该引物对定位在高大 山羊草1S^l短臂上；如果该引物对只能在高大山羊草、中国春-高大山羊草1S^l#2附加系和 中国春-高大山羊草1S^l#2L端体附加系扩增出高大山羊草特异DNA片段，而不能在中国春- 高大山羊草1S^l#2S端体附加系和中国春小麦扩增出该特异DNA片段，说明该引物对定位在 高大山羊草1S^l长臂上；如果该引物对在高大山羊草、中国春-高大山羊草1S^l#2附加系、 中国春-高大山羊草1S^l#2L端体附加系和中国春-高大山羊草1S^l#2S端体附加系均能扩增 出高大山羊草特异DNA片段，而不能中国春小麦扩增出该特异DNA片段，说明该引物对同 时定位在高大山羊草1S^l短臂和长臂上。9种引物对电泳方法同步骤3。

结果表明，MAG2137引物对能够在高大山羊草、中国春-高大山羊草附加系1S^l#2和中 国春-高大山羊草1S^l#2S端体附加系中扩增出650bp的高大山羊草特异DNA片段，而在中国 春-高大山羊草1S^l#2L端体附加系和中国春小麦(参比小麦)中则扩增不出该片段(图1 中C)；BF200742引物对能够在高大山羊草、中国春-高大山羊草1S^l#2附加系和和中国春- 高大山羊草1S^l#2S端体附加系中扩增出1300bp的高大山羊草特异DNA片段，而在中国春- 高大山羊草1S^l#2L端体附加系和中国春小麦(参比小麦)中则扩增不出该片段(图2中C)； Xgwm135引物对能够在高大山羊草、中国春-高大山羊草1S^l#2附加系和中国春-高大山羊草 1S^l#2L端体附加系(中扩增出220bp和275bp的高大山羊草特异DNA片段，而在中国春-高 大山羊草1S^l#2S端体附加系和中国春小麦(参比小麦)中则扩增不出220bp和275bp片段 (图3中C)；Xgwm140引物对能够在高大山羊草、中国春-高大山羊草1S^l#2附加系和中国 春-高大山羊草1S^l#2L端体附加系中扩增出200bp的高大山羊草特异DNA片段，而在中国春 -高大山羊草1S^l#2S端体附加系和中国春小麦(参比小麦)中则扩增不出该片段(图4中C)； BE500714引物对能够在高大山羊草、中国春-高大山羊草1S^l#2附加系和中国春-高大山羊 草1S^l#2L端体附加系中扩增出520bp的高大山羊草特异DNA片段，而在中国春-高大山羊草 1S^l#2S端体附加系和中国春小麦(参比小麦)中则扩增不出该片段(图5中C)；BE489692 引物对能够在高大山羊草、中国春-高大山羊草1S^l#2附加系和中国春-高大山羊草1S^l#2L 端体附加系和中国春-高大山羊草1S^l#2S端体附加系中扩增出480bp的高大山羊草特异DNA 片段，而在中国春小麦(参比小麦)中则扩增不出该片段(图6中C)；BF604958引物对 能够在高大山羊草、中国春-高大山羊草1S^l#2附加系和中国春-高大山羊草1S^l#2L端体附 加系中扩增出650bp的高大山羊草特异DNA片段，而在中国春-高大山羊草1S^l#2S端体附加 系和中国春小麦(参比小麦)中则扩增不出该片段(图7中C)；BE585781引物对能够在 高大山羊草、中国春-高大山羊草1S^l#2附加系和中国春-高大山羊草1S^l#2L端体附加系中 扩增出140bp的高大山羊草特异DNA片段，而在中国春-高大山羊草1S^l#2S端体附加系和中 国春小麦(参比小麦)中则扩增不出该片段(图8中C)；BG262882引物对能够在高大山 羊草、中国春-高大山羊草1S^l#2附加系和中国春-高大山羊草1S^l#2L端体附加系中扩增出 770bp的高大山羊草特异DNA片段，而在中国春-高大山羊草1S^l#2S端体附加系和中国春小 麦(参比小麦)中则扩增不出该片段(图9中C)；说明上述9对引物对均为高大山羊草 1S^l染色体特异标记，并且9个标记中BE489692定位在高大山羊草1S^l染色体长臂和短臂上， MAG2137和BF200742定位在高大山羊草1S^l染色体短臂上，Xgwm135、Xgwm140、BE500714、 BF604958、BE585781和BG262882定位在高大山羊草1S^l染色体长臂上。