CmEF1α基因和CmRAN基因在甜瓜果实基因表达分析中作为内参基因的应用

摘要

本发明属于基因表达分析技术领域，公开了CmEF1α基因和CmRAN基因在分析甜瓜果实的基因表达时作为内参基因的应用，所述CmEF1α基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述CmRAN基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明还公开了一种采用实时荧光定量PCR分析甜瓜果实基因表达的方法，它是将CmEF1α基因和CmRAN基因组合的几何平均数作为甜瓜果实基因表达分析中的内参基因。CmEF1α基因和CmRAN基因在不同坐果方式的甜瓜果实的不同发育阶段均能稳定表达，是甜瓜果实发育过程中利用实时荧光定量PCR技术检测基因表达分析的可靠内参基因组合。

说明书

技术领域

本发明属于植物分子生物学技术领域，涉及采用实时荧光定量PCR方法分 析甜瓜果实基因表达过程中所需的内参基因。

背景技术

甜瓜(Cucumis melo L.)是一种世界广泛栽培的葫芦科作物，具有重要的经 济价值。甜瓜果实在大小、颜色、甜度、风味以及质地方面表现出丰富的多样 性。此外，基于果实成熟过程中的呼吸速率和乙烯变化趋势不同，甜瓜又可分 为呼吸跃变型和非呼吸跃变型。因此，在果实发育研究方面，甜瓜被认为是一 种理想的模式植物。

分析甜瓜果实发育中基因的表达是研究其果实膨大和成熟机制的重要手 段。实时荧光定量PCR(简称为qRT-PCR)由于灵敏度高、重复性好，已经成 为基因表达定量分析的首选方法。然而该技术由多个步骤构成，从样本收集到 数据分析，存在着很多非生物变异，这些变异会影响结果的准确性。为了克服 非生物变异的影响，确保结果的准确性，选择表达稳定的基因作为内参进行数 据的标准化最为关键。

目前，应用qRT-PCR进行甜瓜果实中基因表达定量分析的内参基因有Actin、 Cyclophilin、GAPDH，但这些基因在甜瓜果实中的表达稳定性并没有被系统地 评估过。有研究筛选出了在甜瓜根、茎、叶中表达稳定的内参基因(Kong,Q.Yuan, J.Niu,P.Xie,J.Jiang,W.Huang,Y.Bie,Z.,Screening Suitable Reference Genes for  Normalization in Reverse Transcription Quantitative Real-Time PCR Analysis in  Melon.PLoS ONE 2014,9,e87197；Sestili,S.Sebastiani,M.Belisario,A. Ficcadenti,N.,Reference gene selection for gene expression analysis in melon  infected by Fusarium oxysporum f.sp.melonis.Journal of Plant Biochemistry and  Biotechnology 2013,1-11)，但不包括果实。使用表达不稳定的基因作为内参会 导致目的基因的表达数据发生很大的偏差，因此，在甜瓜果实中缺乏系统验证 的内参基因的状况将会严重影响甜瓜果实发育过程中进行基因表达定量分析的 准确性。同时，甜瓜基因组序列及大规模转录组序列的公布将加速功能基因组 学的研究，尤其是对甜瓜果实发育和成熟机制的研究。因此，甜瓜果实中稳定 表达内参基因的筛选尤为最要。

授粉和单性结实是甜瓜生产中普遍采用的坐果方式。自然授粉的坐果方式 多在在露天种植中采用，然而，由CPPU(N-(2-chloro-4-pyridyl)-N’-phenylurea) 诱导的单性结实则主要在由温室生产中应用。CPPU是一种人工合成的细胞分裂 素，能够在缺乏受精作用下诱导单性结实。两种不同的坐果方式能够在随后果 实发育中引起不同的基因表达和调控模式，这给甜瓜果实发育中筛选稳定表达 内参基因提供了一个很好的机会。

糖的含量及组成成分是评判甜瓜果实质量的主要指标之一。成熟甜瓜果实 中的糖主要是蔗糖。现有研究表明，可溶性酸性转化酶(AI)和蔗糖磷酸合成 酶(SPS)是甜瓜果实中蔗糖的合成代谢中的关键催化酶。在甜瓜基因组上分别 鉴别出编码AI的两个基因(CmAIN1和CmAIN2)，和编码SPS的三个基因 (CmSPS1,CmSPS2,and CmSPS-LIKE1)。然而通过深度测序发现与成熟甜瓜果实 中蔗糖积累相关的基因只有CmAIN2和CmSPS1(Dai,N.；Cohen,S.；Portnoy,V.； Tzuri,G.；Harel-Beja,R.；Pompan-Lotan,M.；Carmi,N.；Zhang,G.；Diber,A.； Pollock,S.；Karchi,H.；Yeselson,Y.；Petreikov,M.；Shen,S.；Sahar,U.；Hovav,R.； Lewinsohn,E.；Tadmor,Y.；Granot,D.；Ophir,R.；Sherman,A.；Fei,Z.；Giovannoni, J.；Burger,Y.；Katzir,N.；Schaffer,A.A.,Metabolism of soluble sugars in developing  melon fruit:a global transcriptional view of the metabolic transition to sucrose  accumulation.Plant Molecular Biology 2011,76,1-18)。因此，在甜瓜果实发育中， 可通过对CmAIN2和CmSPS1的相对表达定量、AI和SPS酶活性及蔗糖积累 的平行分析，评价内参基因的可靠性。

发明内容

为解决在甜瓜果实发育过程中进行基因表达定量分析时缺乏经系统验证 的、表达稳定的内参基因问题，本发明提供了专门用于甜瓜果实发育过程中基 因表达分析的可靠的内参基因。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：选择12个基因作为候选内参 基因，为其中7个候选内参基因设计了跨外显子接头位点的引物，5个候选内参 基因设计位于相邻外显子上的引物；用qRT-PCR分析了这12个候选内参基因在 人工授粉和CPPU处理两种不同坐果方式下22个不同发育时期的甜瓜果实样本 中的表达量；用geNorm软件计算候选内参基因的表达稳定值，确定CmEF1 α 基因和CmRAN基因为最佳内参组合；用该内参组合标准化目标基因CmAIN2的 表达，并平行分析了其与AI酶活性及蔗糖含量在甜瓜果实成熟过程中的相关性， 验证了CmEF1 α和CmRAN组合作为内参基因对甜瓜果实发育过程中基因表达 进行相对定量的可靠性。

本发明的特点在于：为候选内参基因设计了跨相邻外显子接头位点或位于 相邻外显子上的特异引物；全面分析了不同坐果方式和不同发育阶段对候选基 因表达的影响；筛选出专门用于甜瓜果实发育过程中基因表达分析的内参组合 CmEF1 α和CmRAN，并验证了该组合作为甜瓜果实发育过程中基因表达分析时 内参基因的可靠性。

本发明的优点是：

(1)专门针对于甜瓜果实发育过程中基因表达变化，第一次筛选出了表达 稳定的、适用于做内参的CmEF1 α和CmRAN组合。

(2)可靠性。首先，本发明考虑到坐果方式和不同发育阶段对候选内参基 因表达稳定的影响，选出了表达最为稳定的内参基因组合；其次，本发明通过 对CmAIN2和CmSPS1的表达与甜瓜果实中AI和SPS酶活性变化及蔗糖含量变 化的平行分析，证实了CmEF1 α和CmRAN内参基因组合的可靠性。

(3)实用性。本发明具有广泛的适用性，可以用于不同坐果方式和不同发 育阶段的甜瓜果实样品中基因表达分析时的内参基因，为甜瓜果实发育中基因 表达分析提供了一个一致的比较标准。

附图说明

图1：12个候选内参基因的PCR扩增及琼脂糖电泳检测结果。

图2：geNorm软件计算的12个候选内参基因在甜瓜果实发育过程中的表达 稳定性值。

图3：用CmEF1 α和CmRAN组合基因标准化目标基因CmAIN2的表达，以 CmCYP7为对照，检验CmAIN2基因的表达模式与甜瓜果实中酸性转化酶AI及 蔗糖含量的相关性。

图4：用CmEF1 α和CmRAN组合基因标准化目标基因CmSPS1的表达，以 CmCYP7为对照，检验CmSPS1基因的表达模式与甜瓜果实中蔗糖磷酸合成酶 SPS及和蔗糖含量的相关性。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为是对本发明保 护范围进行的限制。

实施例1

(1)植物材料和处理：选用甜瓜商业种伊丽莎白为材料，种植在塑料大棚 中，开花前一天对即将开花的子房进行套袋隔离。开花当天分别进行人工授粉 和CPPU处理诱导甜瓜坐果。CPPU(氯吡脲0.1％；四川国光农化股份有限公司) 使用浓度为2.5mg/L，早晨8点取下纸袋，均匀喷在甜瓜子房上，然后再套袋隔 离。分别在授粉及CPPU处理后1，3，5，7，10，15，20，25，28，30和32 天对果实进行取样，每个取样点随机取3个果实，每个果实作为一次生物学重 复。授粉和CPPU处理后1，3天取子房，3天后的果实取中果皮，液氮速冻， -80℃保存，用于后续RNA提取和酶活及蔗糖含量测定。

(2)总RNA的分离，第一链cDNA的合成和DNA的分离：甜瓜果实样本 采用TaKaRa(Plant RNA Extraction Kit；包含gDNA去除的步骤)分离总RNA， 两种处理间均有3个生物学重复。用Nanodrop2000检测RNA的浓度和质量， A260/A280和A260/A230的比值在1.8-2之间。RNA的完整性采用1％的琼脂糖 凝胶电泳进行检测。RNA检测合格后，再进行反转录反应。1uL总RNA采用 PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)试剂盒首先进行gDNA 去除步骤，然后进行反转录(两步法：37℃15min；85℃5s)形成20μL第一 链cDNA。两种处理间样本分别进行反转录，然后每一份材料进行重复，作为备 份。-80℃保存。基因组DNA的分离，采用甜瓜叶片作为材料，使用天根生化 有限公司试剂盒-植物基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取。

(3)候选内参基因的选择，引物设计和PCR扩增：选择ACT，CAC，CYP7， EF1 α，GAPDH，PP2A，RAN，RP2，RPS15，SAND，TBP2和RPS15作为候 选内参基因，在拟南芥网站(http://www.arabidopsis.org/)搜索对应的拟南芥 cDNA序列的ID，然后在甜瓜基因组数据库(https://melonomics.net/)对甜瓜 CDS进行BLASTN，得到甜瓜的同源基因ID，用 Primer3Plus(http://primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi)采用跨外显子接头 位点或位于相邻外显子上的方式设计引物，引物产物的扩增长度控制在 80-150bp之间。甜瓜物种名的缩写词“Cm”被添加到已通过特异性鉴定的甜瓜 同源基因名前。用合成的引物对cDNA和gDNA进行常规PCR扩增(常规PCR 程序：95℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，31个循 环，72℃延伸4min)，PCR的扩增采用2×Easy Taq SuperMix(北京全式金生物 技术有限公司)，产物用2％琼脂糖凝胶电泳进行检测。CmACT，CmCAC， CmPP2A，CmRP2，CmRPS15，CmSAND，CmTBP2在cDNA模板上扩增出目标 片段，在gDNA模板上无扩增条带，表明该引物具有特异性，并可以排除gDNA 的污染的影响。CmCYP7，CmEF1 α，CmGAPDH，CmRAN，CmYLS8在gDNA 模板上扩增出的产物长度大于cDNA模板，表明它们在gDNA上的扩增片段中 包含了内含子序列，同时，它们在gDNA和cDNA模板上都唯一的扩增出了目 标片段，表明样品cDNA中不存在gDNA污染。候选内参基因的引物序列及扩 增特征见表1，其扩增特异性检测结果见图1。

表1候选内参基因的引物序列及qRT-PCR的扩增特征

序列表SEQ ID NO：1是CmEF1 α基因的核苷酸序列；序列表SEQ ID NO： 2是CmRAN基因的核苷酸序列；序列表SEQ ID NO：3是CmEF1 α基因的位于 相邻外显子上的正向引物序列；序列表SEQ ID NO：4是CmEF1 α基因的位于 相邻外显子上的反向引物序列；序列表SEQ ID NO：5是CmRAN基因的位于相 邻外显子上的正向引物序列；序列表SEQ ID NO：6是CmRAN基因的位于相邻 外显子上的反向引物序列。

(4)qRT-PCR分析：qRT-PCR采用的是TransStart^TM Top Green qPCR  SuperMix(北京全式金生物技术有限公司)作为荧光染料。试验采用10μL上 样体系，包括1μL模版(100ng)，前后引物各1μL(5nmol)，5μL的2×TransStart  Top Green qPCR SuperMix和2μL的ddH₂O。qRT-PCR在Roche480实时定量 PCR检测系统中进行，PCR循环如下：

在58℃这一步采集荧光。最终的Cp(Crossing point)值包括了所有果实样 本的生物学重复以及技术重复。分析引物标准曲线，计算引物扩增效率(E)。 通过混合样品cDNA以5倍的浓度梯度依次稀释5个浓度(800，160，32，6.4和 1.28ng/μL)，进行qRT-PCR，运用扩增效率的计算公式E＝(10^-1//slope-1)×100 进行计算。

(5)候选内参基因稳定性分析：对12个候选内参基因在22个样本中的Cp值， 按照Q＝(1+E)^{(minCp-sampleCp)}公式进行数据转换，然后对每个候选内参转换后的数 据，用geNorm软件计算表达稳定值M，结果见表2、图2。由表2和图2可知CmEF1 α和CmRAN的M最小，表明其在甜瓜果实发育过程中表达最稳定，是最佳的组合 内参基因。当前在甜瓜果实中普遍作为作内参基因进行定量表达分析的CmCYP7 只排在第10位，表明其并不适于用作甜瓜果实的内参基因。

表2用geNorm计算的候选内参基因的稳定值及排序

(6)内参基因可靠性的验证：对甜瓜在人工授粉后7，10，15，20，25，28 和32天进行采样，用来分析CmAIN2(MELO3C005363)(CmAIN2基因参考文 献:Dai,N.；Cohen,S.；Portnoy,V.；Tzuri,G.；Harel-Beja,R.；Pompan-Lotan,M.； Carmi,N.；Zhang,G.；Diber,A.；Pollock,S.；Karchi,H.；Yeselson,Y.；Petreikov,M.； Shen,S.；Sahar,U.；Hovav,R.；Lewinsohn,E.；Tadmor,Y.；Granot,D.；Ophir,R.； Sherman,A.；Fei,Z.；Giovannoni,J.；Burger,Y.；Katzir,N.；Schaffer,A.A., Metabolism of soluble sugars in developing melon fruit:a global transcriptional view  of the metabolic transition to sucrose accumulation.Plant Molecular Biology 2011, 76,1-18)的表达模式。在甜瓜基因组数据库(https://melonomics.net/)获得该基 因的序列，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：7所示。用Primer3Plus设计引 物，引物产物的扩增长度控制在80-150bp之间，获得CmAIN2的正向引物序列 为：5’-AATGACGTGCTCCTCGTACC-3’，反向引物序列为：5’- TTCCACTTCAAACTCCGCCA-3’。按照上述步骤(2)中的方法进行总RNA的 分离，第一链cDNA的合成。用geNorm鉴定出来的最佳组合内参CmEF1 α和 CmRAN作为内参基因对CmAIN2的表达进行相对定量，同时选用在甜瓜果实中 基因表达分析过程中广泛使用的内参CmCYP7作为对照。qRT-PCR分析按照上 述步骤(4)所述方法进行。对组合内参CmEF1 α和CmRAN先计算其几何平均 数，然后再进行相对定量，相对表达量的计算运用公式：2^-△△Cp＝2^{[(目标基因对照Cp-目标基因样品CP)-(内参基因对照Cp-内参基因样品Cp)]}(Schmittgen,T.D,Livak,K.J:Analyzing real-time  PCR data by the comparative CT method.Nature Protocols 2008,3,1101-1108)。选 用人工授粉后7天的CmAIN2表达量作为对照。根据Hubbard等的方法测定人 工授粉后10，15，20，25，28和32天酸性转化酶和蔗糖磷酸合成酶的活性 (Hubbard,N.L.；Huber,S.C.；Pharr,D.M.,Sucrose Phosphate Synthase and Acid  Invertase as Determinants of Sucrose Concentration in Developing Muskmelon (Cucumis melo L.)Fruits.Plant physiology 1989,91,1527-34)。按照Liu等的方法 测定人工授粉后10，15，20,25，28和32天蔗糖含量(Liu C,Zhang H,Dai Z,Liu  X,Liu Y,Deng X,Chen F,Xu J:Volatile chemical and carotenoid profiles in  watermelons[Citrullus vulgaris(Thunb.)Schrad(Cucurbitaceae)]with different  flesh colors.Food Sci Biotechnol 2012,21(2):531-541)。所采用的安捷伦7890A气 相色谱仪，配有一个HP-5毛细管柱，1个CTC PAL自动进样器。在qRT-PCR 分析、酶活测定及蔗糖含量的测定中设置3个生物学重复，结果见图3。由图3 可知，甜瓜果实中蔗糖含量在授粉后20天以前均很低，授粉后20天开始随着 甜瓜果实成熟蔗糖含量急剧增加。体外AI酶活性在授粉后10天达到最高，然 后随着果实成熟急剧下降。当用最佳内参组合CmEF1 α和CmRAN定量CmAIN2 基因的表达时，CmAIN2基因的表达水平自7天开始表现出下降的趋势，与AI 酶活性及蔗糖含量表现出了很好的相关性。但当以CmCYP7为内参时，CmAIN2 在授粉后7-10天表达水平出现了一个明显增加的趋势，这与发育中AI酶活性的 下降的事实不一致。因此，利用本发明中筛选出的内参组合CmEF1 α和CmRAN 能够获得更准确的定量结果。

实施例2

(1)植物材料：将甜瓜商业种伊丽莎白种植在塑料大棚中，开花当天分行 人工授粉并标记。在人工授粉后7，10，15，20，25，28和32对果实进行取样， 每个时间点随机取2个果实，作为一次生物学重复，设三个生物学重复。取甜 瓜果实的中果皮，液氮速冻，-80℃保存。

(2)总RNA的分离：第一链cDNA的合成和DNA的分离按照实施例1中 描述的方法进行。

(3)目标基因：选择与甜瓜果实中蔗糖积累息息相关的蔗糖磷酸合成酶基 因CmSPS1((MELO3C010300))作为目标基因，分析其在甜瓜果实成熟过程中 的表达。该基因的信息从文献(Dai,N.；Cohen,S.；Portnoy,V.；Tzuri,G.；Harel-Beja, R.；Pompan-Lotan,M.；Carmi,N.；Zhang,G.；Diber,A.；Pollock,S.；Karchi,H.； Yeselson,Y.；Petreikov,M.；Shen,S.；Sahar,U.；Hovav,R.；Lewinsohn,E.；Tadmor, Y.；Granot,D.；Ophir,R.；Sherman,A.；Fei,Z.；Giovannoni,J.；Burger,Y.；Katzir,N.； Schaffer,A.A.,Metabolism of soluble sugars in developing melon fruit:a global  transcriptional view of the metabolic transition to sucrose accumulation.Plant  Molecular Biology 2011,76,1-18)中获得，该基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID  NO：8所示。

(4)引物设计：按照实施例1中描述的方法进行。目标基因引物序列如下： 正向引物序列为：5’-GACACTTCAGTCCCACTCGG-3’，反向引物序列为： 5’-TCTAGTATTCCTCTCCTGCGGA-3’。

(5)qRT-PCR分析：采用10μL反应体系，包括1μL模版(100ng)，正 向引物和反向引物各1μL(5nmol)，5μL的2×TransStart Top Green qPCR  SuperMix(北京全式金生物技术有限公司)和2μL的ddH₂O。qRT-PCR在 Roche480实时定量PCR检测系统中进行，PCR循环如下：94℃30s预变性； 然后94℃5s，58℃15s，72℃10s进行40个循环，在58℃这一步采集荧光。 采用2次技术重复，3次生物学重复，最终的Cp(Crossing point)值包括了所 有果实样本的生物学重复以及技术重复。CmEF1 α和CmRAN作为内参基因。

(6)目标基因相对表达量计算：选用7天基因表达的Cp值为对照，CmEF1  α和CmRAN的组合作为内参，采用2-^△△Cp＝2^{[(目标基因对照Cp-目标基因样品CP)-(内参基因对照Cp-内参基因样品Cp)]}法计算目标基因的相对表达量(Schmittgen,T.D,Livak,K.J:Analyzing  real-time PCR data by the comparative CT method.Nature Protocols 2008,3, 1101-1108)。组合内参先计算两个基因Cp值的几何平均数，然后将几何平均数 带入公式2^-△△Cp，计算目标基因的相对表达量。CmEF1 α和CmRAN组合为内参时 CmSPS1基因在甜瓜果实成熟过程中的相对表达量见图4。

由图可知，以CmEF1 α和CmRAN组合为内参时，目标基因CmSPS1在甜瓜果 实成熟过程中从授粉后7天到20天表现逐渐上升的趋势，授粉后20天表达量达到 最高，从授粉后20天开始下降，授粉后25天以后趋于稳定。甜瓜果实中蔗糖磷 酸合成酶自授粉后10天活性开始缓慢升高，25天达到最高，随后缓慢下降，这 与CmSPS1的相对表达量变化表现出相同的趋势，而SPS酶活性的最高点有所延 迟，可认为是植物体内转录与翻译及翻译后修饰的时差。而对照以CmCYP7为内 参基因，目标基因CmSPS1的相对表达量最高点出现在15天，与SPS酶活性最高 的25天，相差过大。由此可见，利用本发明中筛选出的内参组合CmEF1 α和 CmRAN能够获得更准确的定量结果。