一种急性单核细胞白血病相关抗原MLAA-34 表位多肽及其疫苗和制药应用

摘要

本发明公开了一种急性单核细胞白血病相关抗原MLAA-34表位多肽及其应用，属于生物技术领域。本发明提供的急性单核细胞白血病相关抗原MLAA-34表位多肽CP701，能够诱导特异性CTL，在体外对同时表达MLAA-34和HLA-A*0201的肿瘤细胞及负载肽的T2细胞产生确定的特异性杀伤作用，将该表位多肽为CP701应用于制备针对急性单核细胞白血病的多肽疫苗，MLAA-34表位肽CP701(236ILDRHNFAI244)、T辅助性表位和弗氏不完全佐剂组成的多肽疫苗能够抑制荷人单核细胞白血病细胞THP-1的hu-PBL-SCID小鼠瘤体增殖，延长其生存，体内可诱导特异性CTL杀伤活性和NK细胞毒活性。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种急性单核细胞白血病相关抗原MLAA-34表位多肽及其疫苗和制药应用。 

背景技术

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)预后较差，特别是伴有不良染色体或分子异常者，主要是由于化疗诱导缓解后复发率较高。缓解后根除微小残留病变(microresidual disease，MRD)的治疗仍具有巨大挑战。异基因造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)显示有效的抗白血病作用，但因其配型困难、费用昂贵，更重要的是本身存在一些危及生命的并发症，如移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)，仅适于少部分年轻合适的患者。因此，亟需发展基于不同抗白血病机制的新的治疗方法。免疫系统拥有特异性杀伤表达特殊抗原细胞的精巧能力，这种特异性是免疫治疗能够清除肿瘤细胞而不伤害正常细胞的核心。免疫学新近进展和有价值的白血病相关抗原的鉴定使得抗原特异性免疫治疗能够根除化疗后白血病MRD，有望改善AML患者的总生存。 

急性单核细胞白血病(acute monocytic leukemia，M5)是AML中较常见的类型，在我国AML中，M5发病率仅次于M2，占AML的23.2％-26.9％，明显高于西方国家Beutler E等报导的8％。大多数M5患者临床表现为白细胞过多症、易发生髓外浸润(包括肝、脾、淋巴结、齿龈、皮肤、眼睛、喉、肺、膀胱、脑脊膜、中枢神经系统)、不良染色体核型比例高、完全缓解(complete remission，CR)率低、易复发、预后不佳。M5的异质性和复杂性决定其尚缺乏分子诊断和靶向治疗的特异性肿瘤相关标志物。 

急性单核细胞白血病相关抗原-34(monocytic leukemia associated antigen-34，MLAA-34)是发明人的研究课题组利用“重组cDNA表达文库血清学分析法(serological identification of antigens by recombinant expression cloning，SEREX)”对人单核细胞白血病细胞株筛选的具有代表性的新抗原。后利用5’和3’-cDNA末端快速扩增(rapid amplication of cDNA ends，RACE)技术扩增获得MLAA-34的全长cDNA序列，序列编号为：AY288977.2。用NCBI网站(www.ncbi.nlm.nih.gov)的开放读码框Finder软件分析，发现MLAA-34基因可能定位于人染色体13q14.2；是功能未知的钙结合蛋白样39(calcium binging protein 39-like，CAB39L)基因的一个新的转录剪接变体。应用RNAi技术研究发现MLAA-34基因是和急性单核细胞白血病发生相关的新的抗凋亡分子，慢病毒介导的过表达MLAA-34的U937细胞可显著抑制细胞凋亡，并增加潜在的致瘤性。免疫共沉淀，鸟枪法测序和生物信息学分析示71种蛋白质涉及细胞凋亡或增殖的生物过程和信号通路。到目前为止，我们已应用SYBR GreenⅠ荧光染料法的实时荧光定量逆转录多聚酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)及Western blot技术对M5、非M5白血病骨髓原始细胞及正常健康的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)中表达情况进行了检测，发现：MLAA-34基因的mRNA及蛋白水平在AML-M5型白血病细胞中都是特异性高表达的，而在非M5患者和健康对照中低表表或不表达。 

近年来，来源于白血病相关抗原的多肽疫苗已进行了临床实验，AML多肽疫苗有WT1多肽疫苗、RHAMM多肽疫苗等，这些多肽疫苗对AML主动免疫治疗有一定疗效，但对M5患者是否为特异有效的疫苗，未行单独研究。目前尚未见有应用MLAA-34多肽疫苗免疫治疗急性单核细胞白血病的报道。 

多肽疫苗是按照病原体/肿瘤抗原基因中已知或预测的某段抗原表位的氨基酸序列，通过化学合成技术制备的疫苗。肿瘤多肽疫苗具有如下优点： 如抗原肽直接刺激产生特异性免疫反应而不会诱发自身免疫反应或免疫抑制；生产过程简单快速价格低廉，相对易于规模化生产；无致癌性，安全。单一多肽疫苗的最大弱点是免疫原性差，多肽在体内易被肽酶降解，所诱导的CTL不易突破使肿瘤消退所需的阈值。如WT1表位肽疫苗虽然在临床试验中初见成效，但由于目前的研究者往往是采用单一CTL表位的肽、分子量小易于被蛋白水解酶降解，只能激发低水平的免疫应答，通过联合多个CTL表位、增加Th表位、使用免疫佐剂、构建多表位肽和融合肽等方法可提高多肽的免疫原性。 

Th表位在体内可以激活CD4⁺的T细胞，CD4⁺T细胞在激发和维持免疫治疗起着重要作用，故在表位肽疫苗中添加Th表位成为提高表位疫苗免疫原性和增强T细胞反应的一个有的途径。Th表位亦可激活CD4⁺的CTLs而直接杀死肿瘤细胞。佐剂本身虽不能有效的引起抗肿瘤免疫反应，但可增强非特异性免疫应答，参与淋巴细胞增殖与分化，而且可以保护表位肽不易被蛋白酶降解。常用的佐剂有粒巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、IL-2、热休克蛋白和弗氏不完全佐剂(incomplete Freund's adjuvant，IFA)等。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种急性单核细胞白血病相关抗原MLAA-34表位多肽及其疫苗和制药应用，经动物实验验证该多肽疫苗具有抗急性单核细胞白血病的效应。 

本发明是通过以下技术方案来实现： 

一种急性单核细胞白血病相关抗原MLAA-34表位多肽，该表位多肽为CP701，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。 

一种急性单核细胞白血病相关抗原MLAA-34表位多肽疫苗，该多肽疫苗含有一个CP701表位多肽和一个用于增强疫苗免疫原性的T细胞辅助表位多肽。 

所述的用于增强疫苗免疫原性的T细胞辅助表位多肽为破伤风类毒素tt830-843，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。 

所述多肽疫苗中还添加用于增强疫苗免疫原性的弗氏不完全佐剂。 

急性单核细胞白血病相关抗原MLAA-34表位多肽在制备针对急性单核细胞白血病的药物中的应用。 

所述的药物为抑制人急性单核细胞白血病THP-1增殖的药物。 

所述的药物为诱导特异性CTL杀伤活性和NK细胞毒活性的药物。 

所述的药物为刺激CD3⁺CD8⁺T淋巴细胞增殖的药物。 

所述的药物为刺激T细胞分泌IFN-γ和IL-2的药物。 

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果： 

本发明提供的急性单核细胞白血病相关抗原MLAA-34表位多肽CP701，能够诱导特异性CTL，在体外对同时表达MLAA-34和HLA-A*0201的肿瘤细胞及负载CP701多肽的T2细胞产生确定的特异性杀伤作用，是有效的MLAA-34抗原HLA-A*0201限制性CTL表位。 

一种急性单核细胞白血病相关抗原MLAA-34表位多肽疫苗，含有MLAA-34表位肽CP701(²³⁶ILDRHNFAI²⁴⁴)、T辅助性表位和弗氏不完全佐剂组成的多肽疫苗能够抑制荷人单核细胞白血病细胞THP-1的人外周血淋巴细胞免疫重建重症联合免疫缺陷(hu-PBL-SCID)小鼠瘤体增殖，延长其生存，体内可诱导特异性CTL杀伤活性和NK细胞毒活性。通过一系列的体内动物实验证实其具备的抗急性单核细胞白血病效应： 

1、MLAA-34 CP701(²³⁶ILDRHNFAI²⁴⁴)多肽疫苗对荷瘤小鼠肿瘤生长有明显的抑制作用，使肿瘤THP-1细胞明显减少，白血病细胞大量变性坏死； 

2、MLAA-34多肽疫苗可延长荷THP-1白血病细胞hu-PBL-SCID鼠生存。MLAA-34多肽疫苗组荷瘤小鼠的平均生存时间显著长于WT1多肽疫苗组、灭活的THP-1细胞瘤苗组、T辅助多肽疫苗组及对照组荷瘤小鼠的平均 生存时间； 

3、MLAA-34多肽疫苗治疗组脾细胞在不同效靶比对THP-1细胞CTL特异性和NK细胞非特异性的杀伤效率均明显高于空白对照组、WT1多肽疫苗组、T辅助多肽疫苗组及灭活的THP-1瘤苗组，随着效靶比增高，杀伤效率明显增高。MLAA-34多肽疫苗治疗组脾细胞对在不同效靶比对THP-1细胞特异性CTL和NK细胞非特异性的杀伤效率均明显高于人单核细胞白血病细胞U937、人乳腺癌细胞MCF-7和人肺腺癌细胞A549； 

4、MLAA-34多肽疫苗治疗组CD3⁺CD8⁺T细胞的比例显著高于其他组别，而Treg细胞的比例显著低于其他组别。MLAA-34多肽疫苗治疗组MLAA-34合成肽刺激的T细胞分泌IFN-γ和IL-2明显增高，与对照组相比有显著差异，其余各组与对照组比亦有一定差异，但IFN-γ和IL-2分泌量明显低于MLAA-34多肽疫苗治疗组。检测IL-10和IL-4结果显示，MLAA-34多肽疫苗治疗组MLAA-34合成肽刺激的T细胞分泌IL-10和IL-4显著低于其他各组。 

通过作用机制研究表明，本发明的表位多肽为CP701能够有效应用于制备针对急性单核细胞白血病的药物，为M5型急性髓系白血病的治疗开辟了新的研究方向。 

附图说明

图1为各实验组与对照组的HE染色病理切片照片；其中，(a)为对照组移植瘤组织病理切片；(b)为T辅助肽疫苗治疗组移植瘤组织病理切片；(c)为灭活的THP-1细胞瘤苗组移植瘤组织病理切片；(d)为WT1多肽疫苗治疗组移植瘤组织病理切片；(e)为MLAA-34多肽疫苗治疗组移植瘤组织病理切片； 

图2为不同疫苗治疗组小鼠的生存时间比较图； 

图3为不同疫苗治疗组小鼠的Kaplan-Meier生存分析图； 

图4为不同疫苗对THP-1细胞(HLA-A*0201⁺MLAA34⁺)的CTL杀伤活性测定图； 

图5为CP701多肽疫苗对不同细胞的CTL毒性测定图； 

图6为不同疫苗对THP-1细胞(HLA-A*0201⁺MLAA34⁺)的NK细胞毒活性测定图； 

图7为CP701多肽疫苗对不同细胞的NK细胞毒活性测定图； 

图8为不同免疫治疗组荷瘤hu-PBL-SCID鼠外周血中CD3⁺CD4⁺T细胞测定图；其中，(a)为对照组；(b)为WT1多肽疫苗组；(c)为T辅助肽疫苗组；(d)为MLAA-34多肽疫苗组；(e)为灭活的THP-1细胞瘤苗组； 

图9为不同免疫治疗组荷瘤hu-PBL-SCID鼠外周血中CD3⁺CD8⁺T细胞测定图；其中，(a)为对照组；(b)为WT1多肽疫苗组；(c)为T辅助肽疫苗组；(d)为MLAA-34多肽疫苗组；(e)为灭活的THP-1细胞瘤苗组； 

图10为不同免疫治疗组荷瘤hu-PBL-SCID鼠外周血中Treg细胞测定图；其中，(a)为对照组；(b)为WT1多肽疫苗组；(c)为T辅助肽疫苗组；(d)为MLAA-34多肽疫苗组；(e)为灭活的THP-1细胞瘤苗组； 

图11为外周血中IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-4的检测图；其中，(a)为IFN-γ；(b)为IL-2；(c)为IL-10；(d)为IL-4； 

图12为不同疫苗治疗组瘤体的大体标本照片。 

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。 

本发明提供了一种急性单核细胞白血病相关抗原MLAA-34表位多肽，为CP701 CTL表位肽九肽，其氨基酸序列为²³⁶ILDRHNFAI²⁴⁴(如SEQ.ID.NO.1所示)，分子量为1098.8Da。 

本发明提供了一种新的抗急性单核细胞白血病多肽疫苗，给出了该多肽 疫苗的制备方法，且通过动物实验证实此多肽疫苗抗急性单核细胞白血病的疗效。该多肽疫苗的组成为MLAA-34 CP701多肽(50μg)+通用性T辅助细胞表位(T)(破伤风内毒素)(50μg)+弗氏不完全佐剂(incomplete freund’s adjuvant，IFA)(1mL)。 

其中，急性单核细胞白血病抗原MLAA-34 CP701 CTL表位肽为九肽，氨基酸序列为²³⁶ILDRHNFAI²⁴⁴，分子量为1098.8Da，T辅助细胞表位为破伤风类毒素(tt830-843)，氨基酸序列为QYIKANSKFIGITE。根据设计的序列人工来合成，具体的委托上海强耀生物科技有限公司利用多肽合成仪合成这2条多肽，采用半自动固相多肽方法合成，多肽的纯化和纯度分析采用RP-HPLC(美国Waters公司)方法，用电喷雾质谱(electrospray ionization mass spectrometers，ESI-MS)串联质谱(美国PE公司)测定其分子量并进行鉴定。MLAA-34 CP701多肽与T辅助细胞表位肽纯度均达到95％以上。合成的多肽冻干粉，以10μmol/L的浓度溶于DMSO中，置于-20℃条件下备用。 

前期采用生物信息学预测、半自动固相多肽方法合成MLAA-34表位肽，经典肽-MHC结合力实验显示MLAA-34表位肽CP701(²³⁶ILDRHNFAI²⁴⁴)与HLA-A*0201具有很强的亲和力，且体外实验显示MLAA-34表位肽CP701(²³⁶ILDRHNFAI²⁴⁴)可以诱导特异性CTL，对同时表达MLAA-34和HLA-A*0201的肿瘤细胞及负载CP701多肽的T2细胞产生确定的特异性杀伤作用，这些结果提示CP701(²³⁶ILDRHNFAI²⁴⁴)是有效的MLAA-34抗原HLA-A*0201限制性CTL表位。 

本发明公开了急性单核细胞白血病相关抗原MLAA-34表位多肽在制备针对急性单核细胞白血病的药物中的应用，该药物为生物基因工程抗体药物。 

本发明的MLAA-34多肽疫苗体内抗白血病疗效的测定： 

一、制备疫苗 

1、多肽疫苗：临用前配制。 

多肽治疗组疫苗组成为多肽(50μg)+通用性T辅助细胞表位(T)(破伤风内毒素)(50μg)+弗氏不完全佐剂(incomplete freund’s adjuvant，IFA)； 

WT1多肽疫苗组即为WT1多肽(¹²⁶RMFPNAPYL¹³⁴，50μg)+T(50μg)+IFA，T辅助多肽疫苗组为T(50μg)+IFA； 

空白组为IAF。 

抗原与IFA佐剂按100μg:1mL完全乳化后注射给小鼠。 

2、灭活的THP-1细胞瘤苗制备：取对数生长良好的THP-1细胞，加入丝裂霉素C终浓度为20mg/mL灭活THP-1细胞，37℃作用30min后，以2000转/分离心5min，弃上清液，PBS洗2遍，调细胞数1×10⁶/mL于PBS中，加入IFA，二者的体积比例是1：1。 

二、动物模型的建立 

以HLA-A*0201阳性人外周血淋巴细胞重建SCID小鼠免疫系统24h后，皮下接种THP-1细胞，建立人免疫重建的荷瘤SCID小鼠模型； 

1、人外周血淋巴细胞分离 

(1)健康人的浓缩白细胞悬液购自西安市中心血站，HLA-A*0201抗体标注后采用流式细胞仪检测，以HLA-A*0201阳性者作为研究对象。 

(2)在10mL离心管中加入5mL淋巴细胞分离液，取健康女性志愿者肝素抗凝静脉血5mL，用滴管沿管壁缓慢叠加于淋巴细胞分离液液面上，保持清楚的界面，2000rpm水平离心20min。 

(3)离心后管内分为三层，上层为血清，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞(包括淋巴细胞和单核细胞)为主的白色云雾层即白膜层。 

(4)用毛细吸管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一1.5mL离心管中，加入PBS液，1200rpm离心5min，洗涤细胞两次。 

(5)末次离心后，弃上清，加入1mLPBS液重悬细胞。取一滴细胞悬液于细胞计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。 

单个核细胞浓度(细胞数/1mL细胞悬液)＝4个大方格内细胞总数/4×10⁴

(6)用淋巴细胞分离液常规分离后用PBS重悬细胞并调细胞密度为8×10⁷/mL。 

2、选择合格C.B17/SCID纯系小鼠(已用ELISA方法测定鼠IgG＜1μg/mL)，6-8周龄，雌性，用anti-asialo GM1封闭NK细胞活性后进行人外周血淋巴细胞的免疫重建。 

第-1d：每只SCID小鼠腹腔注射20μl anti-asialo GM1以封闭NK细胞活性，并行X线亚致死量照射(3Gy，X线电离箱M-150WE)。 

第0d：免疫重建：腹腔注射0.5mL外周血淋巴细胞(浓度为8×10⁷/mL)。 

第1d：免疫重建24h后每只hu-PBL-SCID鼠皮下接种体外培养的对数生长期THP-1细胞(浓度为1×10⁷个/mlPBS)，每只左右腋窝和背部共3点，每点接种量为0.2ml。 

3、实验分组，选择无免疫渗漏SCIID鼠45只，随机分为5组。 

第一组9只，空白组：疫苗成份仅为弗氏不完全佐剂； 

第二组9只，WT1多肽疫苗组：疫苗成份为WT1多肽+通用性T辅助细胞表位(破伤风内毒素)+弗氏不完全佐剂； 

第三组9只，T辅助多肽疫苗组：疫苗成份为通用性T辅助细胞表位(破伤风内毒素)+弗氏不完全佐剂； 

第四组9只，MLAA-34多肽疫苗治疗组：疫苗成份为前面优选的MLAA-34多肽(CP701，²³⁶ILDRHNFAI²⁴⁴)+通用性T辅助细胞表位(破伤风内毒素)+弗氏不完全佐剂； 

第五组：9只，灭活的THP-1细胞瘤苗组：疫苗成份为灭活的THP-1细胞瘤苗。 

4.接种疫苗 

当肿瘤体积约为100-120mm³时，三次于背部皮下接种疫苗，每次接种间隔一周。免疫治疗结束第14d，处死SCID鼠，各组分别随机留6只观察自然生存时间。 

5.HLA-A*0201检测 

SCID小鼠HLA-A*0201阳性人外周血淋巴细胞免疫重建2周后采集小鼠外周血，淋巴细胞分离液常规分离后获得淋巴细胞，用人HLA-A*0201单克隆抗体标记后，流式细胞仪测定显示小鼠外周血淋巴细胞中人HLA-A*0201阳性的淋巴细胞占95％，提示SCID小鼠免疫重建成功，且小鼠体内的人淋巴细胞的HLA型别为HLA-A*0201。 

6.血清中人IgG的测定 

处死SCID鼠前，经眼球采集未抗凝血液，用ELISA法测定人IgG。 

(1)血标本装离心管，离心，37℃，1500rpm×20min，分离得到血清，-80℃保存，所有标本同时检测； 

(2)取出酶标板，依照次序对应分别加100μl的标准品与质控品于空白微孔中； 

(3)分别标记样品编号，加100μl样品于空白微孔中； 

(4)每孔加入50μl的酶标记溶液，18-25℃孵育反应90min； 

(5)洗板机清洗5次，每次静置10-20s； 

(6)每孔加入底物A、B液各50μl，18-25℃避光孵育反应15min； 

(7)每孔加入50μl终止液，终止反应； 

(8)在酶标仪上读取各孔的OD值，波长为450nm。 

人外周血淋巴细胞(PBL)腹腔注射2周后，ELISA法在小鼠血清中便能检测到人IgG。第4周不同组别小鼠血清人IgG水平：空白对照组(3.84±0.20mg/mL)，WT1多肽疫苗组(8.42±0.28mg/mL)，T辅助肽疫苗组 (6.36±0.35mg/mL)，MLAA-34多肽疫苗组(17.20±2.21mg/mL)，灭活的THP-1细胞瘤苗组(4.66±0.30mg/mL)。移植第6周空白对照组小鼠血清人IgG水平为6.18±0.36mg/mL，而MLAA-34多肽疫苗组为37.31±4.68mg/mL，显著增高(p<0.01)。第8周MLAA-34多肽疫苗组小鼠血清人IgG水平为76.18±8.36mg/mL，呈逐渐升高趋势。 

三、疗效观察 

皮下接种THP-1细胞后每3天测量免疫治疗后SCID小鼠瘤体体积，瘤体体积(mm³)＝瘤体长度×(瘤体宽度)²×π/6。免疫治疗后第14d，各组随机取SCID小鼠三只，处死后，取瘤体组织进行常规固定、石蜡包埋及切片，观察肿瘤病理改变(HE染色)。观察模型小鼠生存期，确定多肽疫苗的体内作用效果。 

参见图12，免疫治疗2周后瘤体大小分别为：对照组(11.06±5.64cm³)，T辅助肽疫苗组(7.28±2.21cm³)，灭活的THP-1细胞瘤苗组(6.82±1.70cm³)，WT1多肽疫苗组(3.03±0.33cm³)，MLAA-34多肽疫苗组(1.39±0.36cm³)。由此可见，MLAA-34多肽疫苗对荷瘤小鼠肿瘤有明显的生长抑制作用(p＝0.002)，肿瘤生长缓慢，而对照组和单纯T辅助肽疫苗组、灭活的THP-1细胞瘤苗组肿瘤呈进行性生长。与对照组相比，WT1多肽疫苗对肿瘤亦有显著的抑制作用(p＝0.006)，由此可见MLAA-34多肽疫苗可抑制荷THP-1白血病细胞hu-PBL-SCID鼠瘤体生长。 

参见图1，(a)～(e)的各个实验分组HE染色的病理切片，对照组HE病理切片中可见大量白血病细胞，生长明显活跃，大小均匀，形态一致，轮廓清晰，细胞胞膜完整，胞核较大，染色深蓝。与对照组相比，T辅助肽疫苗治疗组THP-1细胞形态无变化；灭活的THP-1细胞瘤苗组可见小部分THP-1细胞死亡，胞膜破损，大小不一，轮廓模糊；WT1多肽疫苗组多数细胞形态不规则，胞膜破损，细胞核皱缩，多数白血病细胞变性坏死；MLAA-34 多肽疫苗组肿瘤切片中THP-1细胞明显减少，细胞轮廓模糊，胞膜破损，核固缩碎裂，白血病细胞大量变性坏死。 

参见图2，观察小鼠的生存期，结果显示，对照组荷瘤小鼠平均生存时间为48.50±4.89d；MLAA-34 CP701(²³⁶ILDRHNFAI²⁴⁴)多肽疫苗治疗组和WT1多肽疫苗组荷瘤小鼠平均生存时间分别为88.33±1.63d和66.17±3.06d，T辅助多肽疫苗组和灭活的THP-1细胞瘤苗组荷瘤小鼠平均生存时间分别为52.50±3.02d和54.34±3.14d。MLAA-34 CP701(²³⁶ILDRHNFAI²⁴⁴)多肽疫苗治疗组、WT1多肽疫苗组和灭活的THP-1细胞瘤苗组荷瘤小鼠的平均生存时间显著长于对照组(p<0.01，p<0.01，p＝0.034)，而T辅助多肽疫苗组荷瘤小鼠的平均生存时间与对照组相比，无显著性差异(p＝0.119)。T辅助多肽疫苗组和灭活的THP-1细胞瘤苗组荷瘤小鼠的平均生存时间相比，亦无显著性差异(p＝0.334)，而这两组与MLAA-34 CP701(²³⁶ILDRHNFAI²⁴⁴)多肽疫苗组和WT1多肽疫苗组相比，具有显著性差异(p<0.01，p<0.01，p<0.01，p<0.01)。MLAA-34 CP701(²³⁶ILDRHNFAI²⁴⁴)多肽疫苗组荷瘤小鼠的平均生存时间长于WT1多肽疫苗组(p<0.01)。 

参见图3，采用Kaplan-Meier进行生存分析，结果显示与对照组相比，MLAA-34 CP701(²³⁶ILDRHNFAI²⁴⁴)多肽疫苗可显著改善THP-1荷瘤小鼠的生存(p<0.01)。WT1多肽疫苗和灭活的THP-1细胞瘤苗亦改善了THP-1荷瘤小鼠的生存(p＝0.01，p＝0.007)，而单纯T辅助多肽疫苗未能明显改善THP-1荷瘤小鼠的长期生存(p＝0.055)，由此可见，MLAA-34多肽疫苗可延长荷THP-1白血病细胞hu-PBL-SCID鼠生存。 

四、作用机制研究 

疫苗注射后，检测白血病小鼠CTL活性和NK细胞毒活性、外周血T细胞亚群和Treg细胞、外周血中IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-4的变化，以确定不同疫苗的作用效果和作用机制。 

1、CTL活性和NK细胞毒活性测定 

1)白血病模型小鼠予以疫苗注射结束后14d时，检测其特异性CTL杀伤活性及NK细胞毒活性； 

2)CTL活性测定 

效应细胞制备：无菌条件下取各实验及对照组小鼠的脾细胞制备单细胞悬液，用RPMI 1640培养液(含10％FCS)调整细胞浓度至5×10⁶/mL，3mL/孔接种至6孔板培养。加入MLAA-34多肽CP701(²³⁶ILDRHNFAI²⁴⁴)，50μg/孔。培养基中加入重组人IL-2 20U/mL(每三天补充一次)。培养5d后，1000rpm离心5min，收集细胞，并计数，即为效应细胞。 

靶细胞制备：收集对数生长期THP-1细胞(HLA-A2⁺MLAA-34⁺)、人单核细胞系U937(HLA-A2^-MLAA-34⁺)、人乳腺癌细胞MCF-7(HLA-A2⁺MLAA-34^-)和人肺腺癌细胞A549(HLA-A2^-MLAA-34^-)，用含5％FCS的RPMI 1640培养液调整靶细胞浓度至1×10⁵/mL。 

效/靶细胞共培养：按不同效靶比例(50：1、25：1、12.5：1和6.25：1)加效应细胞和靶细胞各50μL于96孔培养板(3孔重复)，培养4h，用乳酸脱氢酶法测定CTL活性。 

3)NK细胞毒活性测定 

无菌条件下取小鼠脾脏，制备单细胞悬液作为效应细胞。收集对数生长期THP-1细胞(HLA-A2⁺MLAA-34⁺)、人单核细胞系U937(HLA-A2^-MLAA-34⁺)、人乳腺癌细胞MCF-7(HLA-A2⁺MLAA-34^-)和人肺腺癌细胞A549(HLA-A2-MLAA-34-)，用含5％FCS的RPMI 1640培养液调整细胞浓度至4×10⁵/mL，即为靶细胞。其余操作步骤同CTL活性测定。 

参见图4～7，体外CTL杀伤活性结果：MLAA-34 CP701(²³⁶ILDRHNFAI²⁴⁴)多肽疫苗治疗组脾细胞在不同效靶比对THP-1细胞(HLA-A2⁺MLAA34⁺)特异性CTL和NK细胞的杀伤效率均明显高于空白 对照组、WT1多肽疫苗组、T辅助多肽疫苗组及灭活的THP-1细胞瘤苗组(p<0.05)，随着效靶比增高，杀伤效率明显增高。MLAA-34 CP701(²³⁶ILDRHNFAI²⁴⁴)多肽疫苗治疗组脾细胞对在不同效靶比对THP-1细胞(HLA-A2⁺MLAA34⁺)特异性CTL和NK细胞的杀伤效率均明显高于人单核细胞系U937(HLA-A2^-MLAA-34⁺)、人乳腺癌细胞MCF-7(HLA-A2⁺MLAA-34^-)和人肺腺癌细胞A549(HLA-A2^-MLAA-34^-)(p<0.05)。这些体内实验结果提示MLAA-34 CP701(²³⁶ILDRHNFAI²⁴⁴)多肽疫苗诱导的CTL特异杀伤作用具有MHC(HLA-A*0201)和MLAA-34表位双重限制性。 

2、外周血中T细胞亚群及Treg细胞的检测 

白血病模型小鼠予以疫苗注射结束后14d时，眼球取血。T细胞亚群的测定，取肝素钠抗凝全血50μl加入10μl PerCp-CD3/FITC-CD4/PE-CD8三联抗体，4℃下避光孵育30min，溶血并洗涤后用FACS检测，并采用BDFACSDiva软件分析数据，以分析CD4⁺、CD8⁺T细胞的变化。以CD4、CD25单抗标记细胞，用FACS检测Treg细胞的变化。 

参见图8～10，检测不同免疫治疗组别中CD3⁺CD4⁺T细胞比例：对照组(13.2％)，WT1多肽疫苗组(21.7％)；T辅助肽疫苗组(23.8％)，MLAA-34多肽疫苗治疗组(25.4％)，灭活的THP-1细胞瘤苗组(16.3％)，MLAA-34多肽疫苗治疗组CD3⁺CD4⁺T细胞比例显著高于对照组(p<0.05)，比其他组别升高，差异无统计学意义；CD3⁺CD8⁺T细胞比例：对照组(15.7％)，WT1多肽疫苗组(18.3％)；T辅助肽疫苗组(16.5％)，MLAA-34多肽疫苗治疗组(58.7％)，灭活的THP-1细胞瘤苗组(17.1％)。MLAA-34多肽疫苗治疗组CD3⁺CD8⁺T细胞的比例显著高于其他组别(p<0.05)。Treg细胞的比例：对照组(45.2％)，WT1多肽疫苗组(37.7％)；T辅助肽疫苗组(40.6％)，MLAA-34多肽疫苗治疗组(16.4％)，灭活的THP-1细胞瘤苗组(41.7％)。 MLAA-34多肽疫苗治疗组Treg细胞的比例显著低于其他组别(p<0.05)。 

3、外周血中IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-4的检测 

白血病模型小鼠予以疫苗注射结束后14d时，眼球取血。应用ELISA方法，分别检测血清中IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10的水平。 

检测IFN-γ结果显示，参见图11，MLAA-34 CP701(²³⁶ILDRHNFAI²⁴⁴)多肽疫苗治疗组MLAA-34合成肽刺激的T细胞分泌IFN-γ明显增高，与对照组相比有显著差异(p<0.05)，其余各组与对照组比亦有一定差异，但IFN-γ分泌量明显低于MLAA-34 CP701(²³⁶ILDRHNFAI²⁴⁴)多肽疫苗治疗组(p<0.05)。检测IL-2结果显示，MLAA-34 CP701(²³⁶ILDRHNFAI²⁴⁴)多肽疫苗治疗组MLAA-34合成肽刺激的T细胞分泌IL-2显著高于其他各组(p<0.05)。检测IL-10和IL-4结果显示，MLAA-34 CP701(²³⁶ILDRHNFAI²⁴⁴)多肽疫苗治疗组MLAA-34合成肽刺激的T细胞分泌IL-10和IL-4显著低于其他各组(p<0.05)。上述结果提示MLAA-34多肽可诱导Th1和Th2活化，Th1型细胞因子水平显著增加，Th2型细胞因子水平下降，可以诱导细胞免疫应答逐渐向Th1方向发展，诱导CTL应答。