一种牡丹花托愈伤组织诱导及分化不定芽方法

摘要

本发明涉及一种牡丹花托愈伤组织诱导及分化不定芽方法。该方法包括如下步骤：选取花托外植体并进行预处理及常规消毒；将无菌花托在启动培养基上进行诱导培养，首先暗培养一周，然后转至弱光下培养30～50d，产生初始愈伤组织；将初始愈伤组织，转接到增殖培养基中进行增殖培养；将初始或增殖愈伤组织，转接到不定芽培养基进行不定芽分化培养，首先弱光培养4天，然后转至正常环境中培养，分化出不定芽。采用本发明所述方法，可快速获得大量花托愈伤组织及不定芽，诱导率分别达100％和91％，从而攻克了牡丹愈伤组织诱导率低、诱导质量差、不定芽分化困难这一技术难题，为牡丹品种改良和生物技术育种奠定了良好的基础。

说明书

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种牡丹花托愈伤组织诱导及分化不定芽 方法。

背景技术

牡丹(Paeonia suffruticosa)是世界著名花卉，素有″国色天香″、″花中之王″的美称，其花 大、形美、色艳、香浓，为历代人们所称颂，具有很高的观赏和药用价值，在园林应用中占 有重要位置。在一些重要的观赏植物如兰花上，组织培养技术已开始应用，并大规模商品化 生产，同时利用转基因技术向矮牵牛等观赏植物中导入目的基因已经培育出转基因新品系， 这为利用转基因技术获得抗逆性强、花色特异的牡丹新品系提供了可能。自上世纪80年代以 来牡丹组织培养的研究在国内外蓬勃开展，但是至今未能获得根本性的突破。研究表明牡丹 组培苗形成途径主要以愈伤组织脱分化为主，愈伤组织的质量是脱分化的基础。牡丹体内由 于存在较高的酚类物质，存在愈伤组织较难诱导、诱导率低，形成的愈伤组织质量差等问题， 导致牡丹愈伤组织诱导与再生的研究进展缓慢。截至目前，以牡丹的胚、子叶、叶片、叶柄、 花瓣为外植体进行愈伤组织的诱导已有一些报道，但在离体诱导牡丹花托愈伤组织及分化不 定芽方面尚未见进展，因此，以花托为外植体，提高牡丹愈伤组织诱导率、诱导质量及不定 芽分化率，将在很大程度上促进牡丹产业的发展，带来巨大的经济效益。

发明内容

本发明是为了克服现有技术的不足，建立一种牡丹花托愈伤组织诱导及分化不定芽方法， 提高牡丹愈伤组织的诱导率、诱导质量及不定芽分化率，为深入开展牡丹生物技术育种研究 提供一种新的技术平台。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：首先，选取适合的牡丹花托外植体，进行 预处理及常规消毒；然后，对外植体进行初始愈伤组织的诱导，获得初始愈伤组织；再次， 对初始愈伤组织进行增殖培养，使愈伤组织快速增殖；最后，对增殖的愈伤组织进行不定芽 分化诱导，已达到再生的目的。

本发明所述牡丹花托愈伤组织诱导及分化不定芽方法包括如下步骤：

1)花托外植体的选取与消毒：选取直径为0.5～0.6cm的花蕾，4℃冰箱预处理5～6d 后，常规消毒，剥取无菌花托，花托直径为0.3～0.5cm；

2)启动培养：将无菌花托在启动培养基上暗培养一周，然后转至弱光下培养30～50d， 产生初始愈伤组织；弱光下的培养条件为：培养温度25±1℃，光照14h/d，弱光光 照强度800～1000Lx；所述启动培养基为MS+2，4-D 0.5～1.0mg/L+KT 2.0～2.5 mg/L+谷氨酰胺0.5g/L+丝氨酸0.1g/L；

3)增殖培养：将初始培养获得的愈伤组织，转接到增殖培养基中进行增殖培养；培养条 件为：培养温度25±1℃，光照14h/d，光照强度1500Lx；所述增殖培养基为MS+2， 4-D 0.5～1.0mg/L+KT 1.5～2.0mg/L+NAA 1.5～2.0mg/L+谷氨酰胺0.5g/L+丝氨 酸0.1g/L；

4)不定芽分化培养：将初始培养或增殖培养获得的愈伤组织，转接到不定芽分化培养基 上弱光环境培养4d，然后置于正常环境下培养；所述不定芽分化培养基为MS+ZT 2.0～3.0mg/L+6-BA 10.0～15.0mg/L+水解乳蛋白10.0mg/L。

作为一种优选方案，所述花托直径为0.3～0.5cm，所述步骤2)中，所述启动培养基 为MS+2，4-D 0.8mg/L+KT 2.3mg/L+谷氨酰胺0.5g/L+丝氨酸0.1g/L；所述初始愈伤组 织培养环境为弱光：光照强度800～1000Lx。

作为一种优选方案，所述步骤3)中，所述增殖培养基为MS+2，4-D 0.8mg/L+KT 1.5 mg/L+NAA 2.0mg/L+谷氨酰胺0.5g/L+丝氨酸0.1g/L；所述步骤4)中，所述不定芽分化培 养基为MS+ZT 2.5mg/L+6-BA 12.0mg/L+水解乳蛋白10.0mg/L。

作为一种优选方案，所述步骤4)中，所述弱光环境培养条件为：培养温度15±1℃，光 照14h/d，光照强度500～600Lx；所述步骤4)中，所述正常环境培养条件为：培养温度20 ±1℃，光照14h/d，光照强度2000Lx。

上述各种培养基，均以MS为基本培养基，含琼脂5.4g/L、蔗糖30g/L，培养基灭菌前 pH为5.8～6.0。

本发明的有益效果在于：采用本发明所述方法，可快速获得大量花托愈伤组织，诱导率 高达100％，诱导的愈伤组织采用本发明所述方法诱导分化不定芽，分化率达到91％，从而 攻克了牡丹愈伤组织诱导率低、诱导质量差及不定芽分化率低这一技术难题，为牡丹品种改 良和生物技术育种奠定了良好的基础。

附图说明

图1为牡丹花托在启动培养基上获得的初始愈伤组织；图2为愈伤组织在不定芽分化培 养基上获得的不定芽。

具体实施方式

以下实施例用来说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围。

以下各实施例中，实验材料均为牡丹“乌龙捧胜”和“璎珞宝珠”’，两种牡丹品种的实 验结果一致。基本培养基为MS，含琼脂5.4g/L，蔗糖30g/L，培养基灭菌前pH为5.8～6.0。 培养条件为(另有说明的除外)：培养温度25±1℃，光照14h/d，光照强度2000Lx。

实施例1花托外植体的选取与消毒

在3～4月份，选取田间直径为0.5～0.6cm、含苞欲放的牡丹花蕾，4℃冰箱预处理6d， 流水冲洗1～2h，超净工作台上将花蕾放入70％乙醇30s，再转入0.1％HgCl2溶液中8min， 无菌水冲洗3～4次，剥去花萼、花瓣、雄蕊群及雌蕊群，切成4块备用。

实施例2：不同浓度2，4-D和KT组合对愈伤组织诱导的影响

将牡丹的无菌花托切块接种到含有不同浓度2，4-D(0.5，0.8，1.0mg/L)和KT(2， 2.3，2.5mg/L)组合的MS培养基上先暗培养一周，然后转至弱光下(800～1000Lx)培养。 30d后比较外源激素对愈伤组织诱导的影响。其结果如表1所示：各启动培养基的诱导效果 有显著差异，培养基MS+2，4-D 0.8mg/L+KT 2.3mg/L的诱导率最高，诱导质量最好， 愈伤组织呈黄绿色、松散颗粒状(如图1所示)，且随培养时间的延长逐渐增多，可培养至 50d。因此，牡丹花托愈伤组织诱导的最适启动培养基为MS+2，4-D 0.8mg/L+KT 2.3mg/L， 适合的诱导时间为弱光下培养30～50d。

表1 不同浓度2，4-D、KT对愈伤组织诱导的影响

实施例3不同外植体对愈伤组织诱导的影响

在植物组织培养中，诱导愈伤组织常用的外植体为叶片、花托、叶柄、茎段。本实施例 所用外植体为：叶片，取自植株上部第三个叶；叶柄，取自植株上部第2个叶叶柄；花托， 取自小拇指大小的花蕾；花瓣，取自植株顶部盛花期含苞欲放的花朵花瓣。将上述外植体分 别接种于最适启动培养基(MS+2，4-D 0.8mg/L+KT 2.3mg/L+谷氨酰胺0.5g/L+丝氨酸 0.1g/L)中进行诱导培养，先暗培养一周，然后转至弱光下(800～1000Lx)培养30d，不同 外植体的愈伤组织诱导结果如表2所示：外植体为叶柄时，叶柄处膨大出现愈伤组织，诱导 率为75％，愈伤组织小；外植体为叶片、花瓣时，愈伤组织诱导率分别为70％、80％，愈伤 组织较小；外植体为花托时，愈伤组织诱导率为100％，且愈伤组织大而疏密适宜。因此，花 托是牡丹‘乌龙捧胜’和‘璎珞宝珠’愈伤组织诱导的最佳外植体。

表2 不同牡丹外植体对愈伤组织诱导的影响

外植体 叶柄 叶片 花托 花瓣 愈伤组织诱导率、大小 75％，小 70％，较小 100％，大 80％，较小

实施例4弱光预处理对愈伤组织分化不定芽的影响

在植物组织培养中，愈伤组织分化不定芽是植物间接再生的关键。将在最适启动培养基 诱导所得的黄绿色、松散颗粒状初始愈伤组织转接到不定芽分化培养基(MS+ZT 2.5mg/L+ 6-BA 13mg/L+水解乳蛋白10mg/L)上，采用2种培养方案：一种直接在正常环境中培养30d； 一种是先弱光环境培养4d，然后在正常环境中培养26d；所述弱光环境培养条件为：培养温 度15±1℃，光照14h/d，光照强度500～600Lx；所述正常环境培养条件为：培养温度20± 1℃，光照14h/d，光照强度2000Lx。其结果如表3所示：2种培养方案不定芽诱导率差异很 大，先弱光后正常培养的诱导率最高，诱导质量最好。

表3 不同环境处理对愈伤组织诱导的影响

培养方案 正常环境 先弱光后正常光照环境 愈伤组织诱导率、大小 63％，质量一般 91％，质量好