编码GPC-3嵌合抗原受体蛋白的核酸及表达GPC-3嵌合抗原受体蛋白的T淋巴细胞

摘要

编码表达于人T淋巴细胞表面的嵌合抗原受体蛋白的核酸，所述嵌合抗原受体蛋白包含顺序连接的胞外结合区，跨膜区和胞内信号区，其中所述胞外结合区包含特异性识别GPC3的C末端表位的单链抗体scFv(GPC3)。

说明书

技术领域

本发明涉及肿瘤细胞治疗领域，更具体地，涉及对特异性表达GPC3的上皮来源的肿瘤的转基因T淋巴细胞治疗领域。 

背景技术

磷脂酰肌醇蛋白多糖-3(Glypican-3，GPC3，又称DGSX，GTR2-2，MXR7，OCI-5，SDYS，SGB，SGBS或SGBS1)是一种细胞表面蛋白，属于硫酸乙酰肝素蛋白多糖家族。GPC3基因编码产生70-kDa左右的前体核心蛋白，该前体蛋白能够被弗林蛋白酶(furin)剪切产生40-kDa左右的可溶性的能够进入血液的氨基端(N末端)肽和30-kDa左右含有2个硫酸乙酰肝素(HS)糖链的膜结合的羧基端(C末端)肽。GPC3蛋白通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚依附在细胞膜上。 

GPC3高度表达于胎儿肝脏，而不表达于正常成年人的肝组织，但在肝细胞肝癌中恢复表达，与肝癌的发生发展有十分密切的关系，不仅在肝癌发生的早期检出率较高，而且随着肝癌的发展，其检出率也随之增高。而GPC3的表达在肝腺癌，胆管细胞癌，肝转移癌和12种常见实体瘤和21种非肝癌细胞系中均未检测出。此外，GPC3也在例如黑色素瘤，卵巢透明细胞癌、卵黄囊瘤、神经母细胞瘤等肿瘤中表达。考虑到GPC3在肝细胞肝癌，黑色素瘤等肿瘤中特异性的高表达，其被认为是肿瘤免疫治疗的一个候选靶标。 

利用抗GPC3抗体进行肝癌检测和利用抗GPC3抗体的抗体依赖的(ADCC)或补体依赖的(CDC)细胞毒性研究方案已有报道。一般用于治疗的抗体识别的是GPC3蛋白的C末端。然而，抗体治疗存在着抗体在体内血液循环中半衰期的限制，一般来说，半衰期大多在23天以内。因此，持续给药和/或增大给药剂量是肿瘤抗体治疗所要求的，这导致患者治疗成本的增加，以及某些情况下，甚至不得已终结治疗。另外，治疗性抗体作为异源蛋白，还有可能在体内产生过敏反应及针对该治疗性抗体的中和性抗抗体的风险。 

T淋巴细胞在肿瘤免疫应答中的作用日益受到重视。基于T淋巴细胞的过继性免疫治疗在部分肿瘤中取得了一定的效果，并且该种免疫治疗方法可以克服抗体治疗的上述缺陷，但在大多数肿瘤的疗效仍不能令人满意[Grupp SA，et al.Adoptive cellular therapy.Curr  Top Microbiol Immunol.，.2011；344：149-72.]。近年来，根据CTL对靶细胞的识别特异性依赖于T淋巴细胞受体(T Cell Receptor，TCR)的发现，将针对肿瘤细胞相关抗原的抗体的scFv与T淋巴细胞受体的CD3ζ或FcεRIγ等胞内信号激活基序融合成嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)，并将其通过如慢病毒感染等方式基因修饰在T淋巴细胞表面。这种CAR T淋巴细胞能够以主要组织相容性复合物(Major Histocompatibility Complex，MHC)非限制性方式选择性地将T淋巴细胞定向到肿瘤细胞并特异性地杀伤肿瘤。CAR T淋巴细胞是肿瘤免疫治疗领域的一个新的免疫治疗策略[Schmitz M，et al.Chimeric antigen receptor-engineered T cells for immunotherapy of Cancer.J Biomed Biotechnol，2010，doi：10.1155/2010/956304.]。 

嵌合抗原受体包括胞外结合区，跨膜区和胞内信号区。通常胞外区包含能够识别肿瘤相关抗原的scFv，跨膜区采用CD8，CD28等分子的跨膜区，胞内信号区采用免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)CD3ζ或FcεRIγ及共刺激信号分子CD28、CD137、CD134等的胞内信号区。 

胞内信号区仅包含ITAM的为第一代CAR T淋巴细胞，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scFv-TM-ITAM。该种CAR T可以激发抗肿瘤的细胞毒性效应，但是细胞因子分泌比较少，并且在体内不能激发持久的抗肿瘤效应[Zhang T.et al.Chimeric NKG2D-modified T cells inhibit systemic T-cell lymphoma growth in a manner involving multiple cytokines and cytotoxic pathways，Can Res2007，67(22)：11029-11036.]。 

随后发展的第二代CAR T淋巴细胞加入了CD28或CD137(又名4-1BB)的胞内信号区，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scFv-TM-CD28-ITAM或scFv-TM-/CD137-ITAM。胞内信号区发生的B7/CD28或4-1BBL/CD137共刺激作用引起T淋巴细胞的持续增殖，并能够提高T淋巴细胞分泌IL-2和IFN-γ等细胞因子的水平，同时提高CAR T在体内的存活周期和抗肿瘤效果[Dotti G.et al.CD28costimulation improves expansion and persistence of chimeric antigen receptor modified T cells in lymphoma patients.J Clin Invest，2011，121(5)：1822-1826.]。 

近些年发展的第三代CAR T淋巴细胞，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scFv-TM-CD28-CD137-ITAM或scFv-TM-CD28-CD134-ITAM，进一步提高了CAR T在体内的存活周期和其抗肿瘤效果[Carpenito C.，et al.Control of large established tumor xenografts with genetically retargeted human T cells containing CD28and CD137domains.PNAS，2009，106(9)：3360-3365.]。 

尽管CAR T淋巴细胞在肿瘤免疫治疗中具有诱人的前景，但一些潜在的风险亦需要考虑。比如，由于某些/种正常组织低表达CAR所能识别的特异性抗原可能造成CAR T淋巴细胞对表达相应抗原的正常组织的损伤。如，针对肾细胞癌患者肿瘤细胞上表达的抗原碳酸酐酶IX(CAIX)是第一个用于临床的CAR T淋巴细胞过继治疗的案例，也是第一个报道含CAR细胞的脱靶效应的案例。病人在多次输入CAR T淋巴细胞后出现2-4级肝毒性。分析原因为肝胆管上皮细胞低表达CAIX，原临床试验被迫中断同时排除了病人治疗效果的任何评价[Stoter G.et al.Treatment of metastatic renal cell carcinoma with autologous T-lymphocytes genetically retargeted against carbonic anhydrase IX：first clinical experience.J clin oncol，2006，24(13)：e20-e22.；Ngo MC.，et al.Ex vivo gene transfer for improved adoptive immunotherapy of cancer.Human Molecular Genetics，2011，R1-R7]。另外，CAR中过多的共刺激信号会降低效应细胞激活所需的阈值，使得基因修饰的T淋巴细胞在低水平抗原或没有抗原触发的条件下也可能会被活化，导致大量细胞因子的释放以致可能引发所谓的“细胞因子风暴”。这种信号外漏(singnal leakage)会导致脱靶细胞毒性，从而产生非特异性的组织损伤。例如，在采用针对Her2的第三代CAR临床治疗一个具有肝和肺转移的晚期结肠癌患者的过程中由于正常肺组织中低表达Her2而引发所谓的“细胞因子风暴”致病人猝死[Morgan RA.，et al.Report of a serious adverse event following the administration of T cells transduced with a chimeric antigen receptor recognizing Erbb2.Molecular Therapy，2010，18(4)：843-851.]。 

因此，本领域存在着对克服上述缺陷的编码GPC3嵌合抗原受体蛋白的淋巴细胞肿瘤治疗方案的强烈需求。 

发明内容

本发明的第一方面涉及编码一种表达于T淋巴细胞表面的GPC3嵌合抗原受体蛋白的核酸，其表达的嵌合抗原受体蛋白使得表达该受体的T淋巴细胞针对高表达GPC3的肿瘤细胞具有高度特异性的细胞毒性作用。所述GPC3嵌合抗原受体蛋白包含顺序连接的胞外结合区，跨膜区和胞内信号区，其中所述胞外结合区包含特异性识别GPC3的C末端表位的单链抗体scFv(GPC3)。上述嵌合抗原受体蛋白的胞外结合区通过CD8铰链区与CD8或者CD28的跨膜区相连接，跨膜区后紧接胞内信号区。 

本发明的核酸序列可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。本发明的编码嵌合抗原受体蛋白氨基酸序列的核酸密码子可以是简并的，即编码同一氨基 酸序列的多种简并核酸序列都包含在本发明的范围之中。编码对应氨基酸的简并核酸密码子是本领域公知的。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。 

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％，最佳地至少90％或至少95％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：22-25之一所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。 

特异性识别人GPC3的C末端表位的单克隆抗体已被公开在例如，中国专利文献CN101186650A中外制药株式会社)，此外据文献Advances in Liver Cancer Antibody Therapies：A Focus on Glypican-3and Mesothelin，BioDrugs.2011 October1；25(5)：275-284其他已知特异性识别C末端表位的单克隆抗体包括GC33和hGC33也分别被报道，其针对GPC3的抗原决定簇位于C端524-563位氨基酸残基，同时被报道的还包括GPC3-C02和1G12等单克隆抗体。这些被公开的单克隆抗体可以用于制备本发明的核酸所编码的嵌合抗原受体蛋白中的单链抗体部分。其他识别GPC3的C末端表位的单克隆抗体也可以合适的方式运用于本发明。 

单链抗体scFv(GPC3)可以根据上述公开的GPC3单克隆抗体的序列通过基因工程方法或化学合成方法制备。本发明中使用的术语“单链抗体(scFv)片段”指的是通过如下定义的抗体片段，其是包含通过接头(linker)连接的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的重组蛋白，接头使得这两个结构域相关联，以最终形成抗原结合位点。scFv的大小一般是一个完整抗体的1/6。单链抗体优选是由一条核苷酸链编码的一条氨基酸链序列。本发明使用的单链抗体可单独或联合使用本领域已知的常规技术，例如氨基酸缺失、插入、取代、增加、和/或重组以及/或其他修饰方法作进一步修饰。根据一种抗体的氨基酸序列在其DNA序列中引入这种修饰的方法对本领域技术人员来说是众所周知的；见例如，Sambrook，分子克隆：实验手册，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)N.Y.。所指的修饰优选在核酸水平上进行。上述单链抗体还可以包括其衍生物。本发明中“抗体的衍生物” 包括例如当通过噬菌体展示技术获得所述抗体的衍生物时，可使用如BIAcore系统中使用的表面等离子共振技术来增加与GPC3抗原表位结合的噬菌体抗体的效率(Schier，人抗体杂交瘤7(1996)，97-105；Malmborg，免疫学方法杂志183(1995)，7-13)。还包括，例如WO89/09622中描述的嵌合抗体的产生的方法，EP-A10239400和WO90/07861中描述的人源化抗体产生的方法，WO91/10741，WO94/02602和WO96/33735中有描述的产生异种抗体例如小鼠中的人抗体的方法所产生的抗体的衍生物。 

本发明的术语“特异性识别”的意思是本发明的双特异性抗体不与或基本上不与目标抗原以外的任意多肽交叉反应。其特异性的程度可以通过免疫学技术来判断，包括但不限于免疫印迹，免疫亲和层析，流式细胞分析等。在本发明中，特异性识别优选通过流式细胞技术来确定，而具体情况下特异性识别的标准可由本领域一般技术人员根据其掌握的本领域常识来判断。 

嵌合抗原受体的跨膜区可以选自CD8或CD28等蛋白的跨膜区。CD8或CD28是T淋巴细胞表面的天然标记物。人CD8蛋白是个异二聚体，由αβ或者γδ两条链组成。在本发明的一个实施方案中，跨膜区选自CD8α或者CD28的跨膜区。此外，CD8α铰链区(hinge)是一个柔性区域，因此，CD8或CD28和跨膜区加上铰链区被用于将嵌合抗原受体CAR的靶点识别结构域scFv和胞内信号区连接起来。 

胞内信号区可以选自CD3ζ，FcεRIγ，CD28，CD137，CD134蛋白的胞内信号区，及其组合。CD3分子由五个亚单位组成，其中CD3ζ亚单位(又称CD3zeta，简称Z)含有3个ITAM基序，该基序是TCR-CD3复合体中重要的信号转导区。CD3δZ是截短的不具有ITAM基序的CD3ζ序列，在本发明实践中一般作为阴性对照的构建。FcεRIγ主要分布在肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面，其含有一个ITAM基序，在结构、分布及功能上与CD3ζ类似。此外如前所述，CD28，CD137，CD134是共刺激信号分子，在与各自配体结合后其胞内信号区段产生的共刺激作用引起T淋巴细胞的持续增殖，并能够提高T淋巴细胞分泌IL-2和IFN-γ等细胞因子的水平，同时提高CAR T淋巴细胞在体内的存活周期和抗肿瘤效果。 

本发明的核酸所编码的GPC3嵌合抗原受体蛋白可以选自按如下方式顺序连接的嵌合抗原受体蛋白： 

scFv(GPC3)-CD8-CD3ζ， 

scFv(GPC3)-CD8-CD137-CD3ζ， 

scFv(GPC3)-CD28a-CD28b-CD3ζ， 

scFv(GPC3)-CD28a-CD28b-CD137-CD3ζ， 

及其组合，其中相关嵌合抗原受体蛋白中CD28a代表CD28分子的跨膜区，CD28b代表CD28分子的胞内信号区。上述各种抗GPC3嵌合抗原受体统称为scFv(GPC3)-CAR。 

在本发明的一个实施方案中，本发明的核酸具有如SEQ ID NO：18～21所述的序列。在本发明的另一个实施方案中，本发明的核酸是编码具有如SEQ ID NO：22-25之一的嵌合抗原受体蛋白的核酸。 

本发明的第二方面包括包含上述编码表达于T淋巴细胞表面的嵌合抗原受体蛋白的核酸的载体。在一个具体实施方案中，本发明使用的载体是一种慢病毒质粒载体pPWT-eGFP。该质粒属于第三代自灭活慢病毒载体系统，该系统共有三个质粒即编码蛋白Gag/Pol、编码Rev蛋白的包装质粒psPAX2；编码VSV-G蛋白的包膜质粒PMD2.G；及空载体pPWT-eGFP，其可以用于重组引入目的核酸序列，即编码CAR的核酸序列。空载体pPWT-eGFP(其本身为后续试验中的mock)中由延长因子-1α(elongation factor-1α，EF-1α)启动子调控增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，eGFP)的表达。而包含编码CAR的目的核酸序列的重组表达载体pWPT-eGFP-F2A-CAR是通过由来自口蹄疫病毒(food-and-mouth disease virus，FMDV)的核糖体跳跃序列(ribosomal skipping sequence2A)(简称F2A)实现eGFP与CAR的共表达的。在一个具体实施方案中，本发明的载体具有如SEQ ID NO：27-30之一的核酸序列。 

本发明的第三方面包括包含上述载体的病毒。本发明的病毒包括包装后的具有感染力的病毒，也包括包含包装为具有感染力的病毒所必需成分的待包装的病毒。本领域内已知的其他转导T淋巴细胞的病毒及其对应的质粒载体也可用于本发明。 

在本发明的一个实施方案中，所述病毒是包含上述pWPT-eGFP-F2A-CAR重组载体(即含有scFv(GPC3)-CAR)的慢病毒。 

本发明的第四方面包括一种转基因T淋巴细胞，其被转导有本发明的核酸或被转导有本发明的上述包含所述含有该核酸的重组质粒，或包含该质粒的病毒。本领域常规的核酸转导方法，包括非病毒和病毒的转导方法都可以用于本发明。基于非病毒的转导方法包括电穿孔法和转座子法。近期Amaxa公司研发的nucleofector核转染仪能够直接将外源基因导入细胞核获得目的基因的高效转导。另外，基于睡美人转座子(Sleeping Beauty system)或PiggyBac转座子等转座子系统的转导效率较普通电穿孔有较大提高，将nucleofector转染仪与睡美人转座子系统联合应用已有报道[Davies JK.，et al.Combining CD19redirection and alloanergization to generate tumor-specific human T cells for allogeneic cell therapy of B-cell malignancies.Cancer Res，2010，70(10)：OF1-10.]，该方法既具有较高的转导效率又能够实现目的基因的定点整合。在本发明的一个实施方案中，实现嵌合抗 原受体基因修饰的T淋巴细胞的转导方法是基于病毒如逆转录病毒或慢病毒的转导方法。该方法具有转导效率高，外源基因能够稳定表达，且可以缩短体外培养T淋巴细胞到达临床级数量的时间等优点。在该转基因T淋巴细胞表面，转导的核酸通过转录、翻译表达在其表面。通过对各种不同的培养的肿瘤细胞进行体外细胞毒实验证明，本发明的表面表达嵌合抗原受体的转基因T淋巴细胞具有高度特异性的肿瘤细胞杀伤效果(亦称细胞毒性)。因此本发明的编码嵌合抗原受体蛋白的核酸，包含该核酸的质粒，包含该质粒的病毒和转导有上述核酸，质粒或病毒的转基因T淋巴细胞可以有效地用于肿瘤的免疫治疗。 

在一个实施方案中，本发明的T淋巴细胞，其表面表达一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体由SEQ ID NO：18-21之一的核酸编码表达。在另一个实施方案中，本发明的转基因T淋巴细胞表面表达一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列选自SEQ ID NO：22-25之一。 

附图说明

图1显示的是作为示例的本发明的包含编码CAR序列的慢病毒载体pWPT-eGFP-F2A-CAR的结构示意图。 

图2显示的是作为示例的包含在慢病毒载体中的本发明的CAR的不同区之间连接关系的示意图，其中由核糖体跳跃序列F2A连接的eGFP和svFv(GPC3)特异性嵌合抗原受体。 

图3显示的是MluI和SalI双酶切鉴定实施例1的慢病毒质粒的核酸电泳图。其中M1是DS2000分子量标记物(广州东盛生物科技有限公司)；M2是Hind III标记物(广州东盛生物科技有限公司)。泳道1-5分别是 

1：pWPT-eGFP-F2A-GPC3-δZ； 

2：pWPT-eGFP-F2A-GPC3-Z； 

3：pWPT-eGFP-F2A-GPC3-BBZ； 

4：pWPT-eGFP-F2A-GPC3-28Z； 

5：pWPT-eGFP-F2A-GPC3-28BBZ。 

图4显示的是本发明实施例2的病毒感染CTL(细胞毒性T淋巴细胞)后细胞表达的eGFP的流式细胞技术检测结果。 

图5显示的是本发明实施例2的表达不同嵌合抗原受体(CAR⁺)的CTL细胞的体外生长情况。图中显示在病毒感染后第9天，表达不同嵌合抗原受体的CTL细胞体外扩增20～40倍。 

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不能理解为用于限制本发明的范围。下面实施例中如未注明具体条件的实验方法，则按照常规条件如Sambrook等，“分子克隆：实验手册(New York：Cold Spring Harbor laboratory Press，1989)”中所述的条件，而在实施例中明确说明有试剂公司说明书时，则按照说明书所建议的条件进行。 

实施例1.表达本发明核酸编码的嵌合抗原受体蛋白的慢病毒质粒的构建及病毒包装 

下表1解释了本发明示例的嵌合抗原受体各部分的连接顺序，该连接还可参见图2中所示。表1 

嵌合抗原受体 胞外结合区-跨膜区-胞内信号区1-胞内信号区2etc 描述 GPC3-δZ scFv(GPC3)-CD8-CD3δzeta 阴性对照 GPC3-Z scFv(GPC3)-CD8-CD3zeta 第一代 GPC3-BBZ scFv(GPC3)-CD8-CD137-CD3zeta 第二代 GPC3-28Z scFv(GPC3)-CD28a-CD28b-CD3zeta 第二代 GPC3-28BBZ scFv(GPC3)-CD28a-CD28b-CD137-CD3zeta 第三代

1.核酸片段的扩增 

(1)scFv(GPC3)序列的扩增 

scFv(GPC3)序列的扩增以本实验室构建的单链双功能抗体核苷酸GPC3/CD3为模板，模板的序列参见中国专利申请201210480326.x中的SEQ ID NO：9。扩增所采用的引物对为上游引物5’-gatgttgtgatgactcagtctc-3’(SEQ ID NO：1)和下游引物5’-gcgctggcgtcgtggttgaggagacggtgaccag-3’(SEQ ID NO：2)用于扩增scFv(GPC3)；目的扩增条带大小均为746bp。PCR扩增条件为预变性：94℃，4min；变性：94℃，40s；退火：58℃，40s；延伸：68℃，40s；进行25个循环，然后总延伸68℃，10min。PCR扩增条带通过琼脂糖凝胶电泳确认符合预计的片段大小。 

(2)嵌合抗原受体其他部分的核酸序列 

GPC3嵌合抗原受体蛋白的除scFv(GPC3)外其他部分的核酸序列分别以专利申请号为201310108532.2中公开的序列SEQ ID NO：1～4为模板通过PCR方式获得。具体地，其 中如下各种GPC3嵌合抗原受体蛋白除scFv(GPC3)外的CAR部分，其中CD8-CD3ζ(Z)和CD28a-CD28b-CD137-CD3ζ(28BBZ)，分别以scFv(EFGR)-CD8-CD3ζ(专利申请201310108532.2中SEQ ID NO：1)和scFv(EFGR)-CD28a-CD28b-CD137-CD3ζ(专利申请201310108532.2中SEQ ID NO：2)为模板，采用上游引物5’-accacgacgccagcgccgcgaccac-3’(SEQ ID NO：3)和下游引物5’-gaggtcgacctagcgagggggcagggcctgcatgtgaag-3’(SEQ ID NO：4)扩增，PCR扩增条件为预变性：94℃，4min；变性：94℃，40s；退火：60℃，40s；延伸：68℃，40s；进行25个循环，然后总延伸68℃，10min。目的条带分别为549bp和816bp，PCR扩增条带通过琼脂糖凝胶电泳确认符合预计的片段大小。 

另外，CD8-CD3deltaζ(delta Z)，CD8-CD137-CD3ζ(BBZ)和CD28a-CD28b-CD3ζ(28Z)分别通过如下方式获得： 

A)加1ml Trizol(Invitrogen公司)于1×107健康人外周血单个核细胞(上海市血液中心提供)中裂解细胞后，采用酚-氯仿法抽提总RNA，采用ImProm-II^TM逆转录试剂盒(promaga公司)逆转录制备cDNA。以上述制备的cDNA为模板，分别： 

(i)以上游引物5’-gtcaccgtctcctcaaccacgacgccagcg-3’(SEQ ID NO：5)和下游引物5’-ggtgataaccagtgacaggag-3’(SEQ ID NO：6)扩增获得CD8α铰链区-跨膜区，PCR扩增条件为预变性：94℃，4min；变性：94℃，30s；退火：58℃，30s；延伸：68℃，30s；进行25个循环，然后总延伸68℃，10min。条带理论大小为198bp，扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一致。 

(ii)以上游引物5’-gtcaccgtctcctcaaccacgacgccagcg-3’(SEQ ID NO：5)和下游引物5’-gaggtcgacctacgcgggggcgtctgcgctcctgctgaacttcactctggtgataaccagtg-3’(SEQ ID NO：7)扩增获得CD8α铰链区-跨膜区-delta Z(即CD8-CD3deltaζ)，PCR扩增条件同上。条带理论大小为261bp，扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一致。 

(iii)以上游引物5’-ttttgggtgctggtggtggttgg-3’(SEQ ID NO：8)和下游引物5’-gctgaacttcactctggagcgataggctgcgaag-3’(SEQ ID NO：9)扩增获得CD28跨膜区-胞内信号区片段，PCR扩增条件同上，条带理论大小为219bp，扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一致。 

(iiii)以上游引物5’-aaacggggcagaaagaaactc-3’(SEQ ID NO：10)和下游引物5’-cagttcacatcctccttc-3’(SEQ ID NO：11)扩增获得CD137胞内区，PCR扩增条件同上，条带理论大小为126bp，扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一致。 

(iiiii)以上游引物5’-cactggttatcaccagagtgaagttcagcaggagc-3’(SEQ ID NO：12)和下游引物5’-gaggtcgacctagcgagggggcagggcctgcatg-3’(SEQ ID NO：13)扩增获得CD3zeta信 号区，PCR扩增条件同上，条带理论大小为339bp，扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一致。 

B)核酸片段的拼接 

(i)以上游引物5’-accacgacgccagcgccg-3’(SEQ ID NO：14)和下游引物5’-cacccagaaaataataaag-3’(SEQ ID NO：15)拼接获得CD8α铰链区-CD28跨膜区，拼接条件：CD8α铰链区(50ng)+CD28跨膜区(50ng)预变性：94℃，4min；变性：94℃，30s；退火：60℃，30s；延伸：68℃，30s，进行5个循环，然后总延伸68℃，10min，补充DNA聚合酶及上下游引物后PCR扩增25个循环，扩增条件为预变性：94℃，4min；变性：94℃，30s；退火：60℃，30s；延伸：68℃，30s，进行25个循环，然后总延伸68℃，10min。理论大小为216bp。扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一致。 

(ii)以上游引物5’-aaacggggcagaaagaaactc-3’(SEQ ID NO：10)和下游引物5’-gaggtcgacctagcgagggggcagggcctgcatg-3’(SEQ ID NO：13)拼接扩增获得CD137-CD3ζ，即为BBZ，拼接和PCR扩增条件同上。条带理论大小为478bp，扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一致。 

(iii)以上游引物5’-gtcaccgtctcctcaaccacgacgccagcg-3’(SEQ ID NO：5)和下游引物5’-gaggtcgacctagcgagggggcagggcctgcatg-3’(SEQ ID NO：13)将CD8α铰链区-跨膜区与BBZ拼接及PCR获得目的片段：CD8α铰链区-跨膜区-BBZ胞内区，即CD8-CD137-CD3ζ，拼接和PCR扩增条件同上。理论大小为691bp。扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一致。 

(iiii)以上游引物5’-gtcaccgtctcctcaaccacgacgccagcg-3’(SEQ ID NO：5)和下游引物5’-gaggtcgacctagcgagggggcagggcctgcatg-3’(SEQ ID NO：13)将CD8α铰链区-CD28跨膜区-胞内区与Z采用同上的拼接和PCR扩增获得目的片段：CD8α铰链区-CD28跨膜区-28Z胞内区，即CD28a-CD28b-CD3ζ，拼接和PCR扩增条件同上。条带理论大小为706bp，扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一致。 

(3)3’端带有F2A及CD8α信号肽的eGFP核酸片段的获得 

以上游引物5’-cttacgcgtcctagcgctaccggtcgccaccatggtgagcaagggcgaggag-3’(SEQ ID NO：16)和下游引物5’-cggcctggcggcgtggagcag-3’(SEQ ID NO：17)扩增慢病毒载体中3’端带有F2A及CD8α信号肽的eGFP核酸片段，以专利申请201310108532.2中公开的pWPT-eGFP-F2A-806-Z为模板，PCR扩增条件为预变性：94℃，4min；变性：94℃，40s；退火：56℃，40s；延伸：68℃，50s，进行25个循环，然后总延伸68℃，10min，理论大 小为883bp，扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一致。 

2.核酸片段的拼接 

分别将如前述段落“(2)嵌合抗原受体其他部分的核酸序列”中扩增获得的片段CD8-CD3ζ，CD8-CD137-CD3ζ，CD28a-CD28b-CD3ζ，CD28a-CD28b-CD137-CD3ζ与等摩尔的前述段落“(3)嵌合抗原受体其他部分的核酸序列”中扩增获得的3’端带有F2A及CD8α信号肽的eGFP核酸片段(质量约为50ng)及等摩尔的scFv(GPC3)(质量约为50ng)三片段按图2所示模式拼接并PCR，拼接条件为：预变性：94℃，4min；变性：94℃，40s；退火：60℃，40s；延伸：68℃，140s，进行5个循环，然后总延伸68℃，10min，补充DNA聚合酶及上游引物5’-cttacgcgtcctagcgctaccggtcgccaccatggtgagcaagggcgaggag-3’(SEQ ID NO：16)和下游引物5’-gaggtcgacctagcgagggggcagggcctgcatg-3’(SEQ ID NO：13)后PCR扩增25个循环，扩增条件为预变性：94℃，4min；变性：94℃，40s；退火：60℃，40s；延伸：68℃，140s，进行25个循环，然后总延伸68℃，10min。扩增获得eGFP-GPC3-Z、eGFP-GPC3-BBZ、eGFP-GPC3-28Z及eGFP-GPC3-28BBZ理论大小分别为2161bp，2278bp，2302bp和2428bp。扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一致。 

在与同上相同的实验条件下，采用上游引物5’-gatgttgtgatgactcagtctc-3’(SEQ ID NO：1)和下游引物5’-gaggtcgacctagcgagggggcagggcctgcatg-3’(SEQ ID NO：13)，在不添加3’端带有F2A及CD8α信号肽的eGFP核酸片段(质量约为50ng)，可以获得编码GPC3嵌合抗原受体蛋白的核酸GPC3-Z(SEQ ID NO：18)、GPC3-BBZ(SEQ ID NO：19)、GPC3-28Z(SEQ ID NO：20)及GPC3-28BBZ(SEQ ID NO：21)序列，上述各核酸序列分别编码具有如下氨基酸序列的GPC3嵌合抗原受体蛋白，GPC3-Z(SEQ ID NO：22)、GPC3-BBZ(SEQ ID NO：23)、GPC3-28Z(SEQ ID NO：24)及GPC3-28BBZ(SEQ ID NO：25)。 

此外，分别将如前述段落“(2)嵌合抗原受体其他部分的核酸序列”中扩增获得的片段CD8-CD3deltaζ片段与等摩尔的前述段落“(3)嵌合抗原受体其他部分的核酸序列”中扩增获得的片段及等摩尔的scFv(GPC3)采用上游引物5’-cttacgcgtcctagcgctaccggtcgccaccatggtgagcaagggcgaggag-3’(SEQ ID NO：16)和下游引物5’-gaggtcgacctacgcgggggcgtctgcgctcctgctgaacttcactctggtgataaccagtg-3’(SEQ ID NO：7)同上条件进行拼接并PCR，扩增获得eGFP-GPC3-δZ(SEQ ID NO：31)，理论大小为1858bp，扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一。 

3.慢病毒质粒载体的构建 

作为示例的构建本发明的慢病毒质粒载体使用的载体系统属于第三代自灭活慢病毒载体系统，该系统共有三个质粒即编码蛋白Gag/Pol、编码Rev蛋白的包装质粒psPAX2；编码VSV-G蛋白的包膜质粒PMD2.G及基于空载体pPWT-eGFP的编码目的基因CAR的重组表达载体。 

在空载体pPWT-eGFP中，延长因子-1α(elongation factor-1α，EF-1α)的启动子调控增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，eGFP)的表达，而在编码目的基因CAR的重组表达载体中通过来自口蹄疫病毒的核糖体跳跃序列(food and mouth disease virus，FMDV，ribosomal skipping sequence，F2A)实现eGFP与目的基因CAR的共表达。F2A是来自口蹄疫病毒的2A(或称为“自剪切多肽2A”)的一段核心序列，具备2A的“自剪切”功能，可以实现上游和下游基因共表达。2A由于其剪切效率高、上下游基因表达平衡性高及自身序列短小的优点为构建基因治疗多顺反子载体提供了一种有效的可行策略。尤其在基于嵌合抗原受体基因修饰T淋巴细胞的免疫治疗中多应用该序列实现目的基因与GFP或者eGFP的共表达，通过检测GFP或者eGFP即可间接检测CAR的表达。 

本实施例构建了由F2A相连的eGFP与特异性CAR共表达的慢病毒表达载体，统称为pWPT-eGFP-F2A-CAR。上述步骤2中获得的目的基因eGFP-F2A-CAR通过MluI和SalI限制性内切酶双酶切，连入同样双酶切的pWPT载体中，从而构建表达各嵌合抗原受体的慢病毒载体。构建成功的载体经MluI和SalI酶切鉴定(图3)及序列测定正确后，可以准备用于慢病毒包装。如前所述，eGFP-F2A-CAR转录为一条mRNA，但最终翻译为eGFP和抗GPC3嵌合抗原受体两条肽链，其中在CD8α信号肽的引导下抗GPC3嵌合抗原受体将定位在细胞膜上。用作阴性对照的eGFP-GPC3-δZ在插入到慢病毒质粒载体后在细胞膜表面表达含有截短的δZ的GPC3嵌合抗原受体(GPC3-δZ)，其氨基酸序列为SEQ ID NO：32。 

得到的含有各目的CAR的载体的核酸全序列如下：pWPT-eGFP-F2A-GPC3-δZ(SEQ ID NO：26)；pWPT-eGFP-F2A-GPC3-Z(SEQ ID NO：27)；pWPT-eGFP-F2A-GPC3-BBZ(SEQ ID NO：28)；pWPT-eGFP-F2A-GPC3-28Z(SEQ ID NO：29)；pWPT-eGFP-F2A-GPC3-28BBZ(SEQ ID NO：30)。 

4.质粒转染293T包装慢病毒 

以6×10⁶的密度接种培养至第6～10代的293T细胞(ATCC：CRL-11268)于10cm培养皿中，37℃，5％CO₂培养过夜准备用于转染。培养基为含10％胎牛血清(PAA公司)的DMEM(PAA公司)，次日，在转染前约2小时更换培养液为无血清DMEM。 

转染的步骤如下： 

4.1将20μg空质粒pWPT-eGFP(mock对照)或20μg的各目的基因质粒pWPT-eGFP-F2A-CAR，分别与15μg包装质粒PAX2：和6μg包膜质粒pMD2.G：，溶入500μL MillQ水中，混匀， 

4.2逐滴加入62μL2.5M CaCl₂(Sigma公司)，以1200rpm/min vortex混匀， 

4.3最后逐滴加入500μL2×HeBS(280mM NaCl，10mM KCl，1.5mM Na2HPO4·2H2O，12mM葡萄糖，50mM Hepes(Sigma公司)，pH7.05，0.22μM过滤除菌)，1200rpm/min vortex混匀10s， 

4.4立即逐滴加入培养皿中，轻轻摇匀，37℃，5％CO₂，培养4～6h后，更换为含10％胎牛血清的DMEM。 

在转染次日观察转染效率(即呈绿色荧光的细胞比例)，～80％的阳性转染效率即为转染实验成功。在转染48h或72h后，使用0.45μm滤器(Millipore公司)过滤收集病毒，然后采用Beckman Optima L-100XP超速离心机28000rpm，4℃离心2小时，弃离心上清，离心所得沉淀用1/10～1/50原液体积的Quantum007培养液(PAA公司)进行重悬，以100μL/管分装冻存于-80℃，以待病毒滴定或感染T淋巴细胞。 

5.测定包装有mock或者eGFP-F2A-CAR的慢病毒滴度 

第一天，以1×10⁵/mL接种293T细胞于96孔培养板，100μL/孔，37℃，5％CO2培养，培养液为含10％胎牛血清的DMEM。第二天，弃50μL/孔培养上清，补加50μL/孔新鲜上述培养液，并含终浓度为6μg/mL的polybrene，37℃，5％CO2孵育30min。加10μL/孔的病毒原液或1μL/孔的病毒浓缩液，5倍稀释，4个梯度，两个复孔，37℃，5％CO₂培养。感染48h后，流式细胞仪检测eGFP，以阳性率为5～20％的细胞数为宜，计算滴度(U/mL)＝阳性率×稀释倍数×100×10⁴。磷酸钙转染法包装的上述包含mock即空载体对照和各eGFP-F2A-CAR的病毒的滴度均为约0.5～2×10⁶U/mL的水平，经浓缩后所测的病毒滴度约为2×10⁷U/mL。 

实施例2.重组慢病毒感染CTL细胞 

由健康人外周血通过密度梯度离心法获得人外周血单个核细胞(上海市血液中心提供)，外周血单个核细胞通过CTL细胞磁珠(Stem Cell Technologies)负性分选方法获得CTL，分选后的CTL细胞进行流式细胞检测CTL细胞的纯度，以CTL细胞的阳性率≥95％为宜进行下一步操作。以约1×10⁶/mL密度加入Quantum007淋巴细胞培养基液(PAA公 司)培养并以细胞：磁珠比例为1∶1加入同时包被有抗CD3和CD28抗体的磁珠(Invitrogen公司)和终浓度100U/mL的重组人IL-2(上海华新生物高技术有限公司)刺激培养24h。然后以MOI≈5用上述重组慢病毒感染CTL细胞。感染后的细胞每隔一天采用5×10⁵/mL的密度进行传代，同时在淋巴细胞培养液中补加终浓度100U/mL的重组人IL-2。 

感染的CTL细胞在培养第8天时通过流式细胞检测各不同嵌合抗原受体表达，由于eGFP与CAR共表达，检测eGFP的阳性细胞即为表达嵌合抗原受体的阳性细胞(图4)。以未感染的T淋巴细胞作为阴性对照，表达不同嵌合抗原受体的病毒感染CTL细胞其阳性率如下表所示。该阳性率结果表明通过慢病毒感染的方法能够获得一定阳性率的CAR⁺CTL细胞。 

表2 

转染有下列CAR的CTL细胞 CTL细胞eGFP阳性率 Mock(空载体对照) 37％ GPC3-Z 32％ GPC3-28BBZ 37％

CTL细胞在分别感染包装有不同嵌合抗原受体的病毒后，以细胞密度为5×10⁵/ml隔天传代培养、计数、并对传代的细胞培养液补加IL-2(终浓度为100U/ml)，培养第11天约有20～40倍的扩增(见图5)，表明表达不同嵌合抗原受体的CTL细胞在体外能够进行一定数量的扩增，为后续体外毒性试验及体内试验提供了保证。 

实施例3.表达嵌合抗原受体细胞的体外毒性效果实验 

体外毒性实验使用的材料如下： 

如下表3所示的肝细胞癌细胞系作为靶细胞，效应细胞为如实施例2所验证的体外培养12天的FACS检测嵌合抗原受体表达的阳性细胞记为嵌合抗原受体阳性(CAR⁺)的CTL， 

表3 

肿瘤类型 细胞名称 来源 性质 肝细胞瘤 PLC/PRF/5 ATCC：CRL-8024 高表达GPC3 肝细胞癌 Hep3B2.1-7 ATCC：HB-8064 高表达GPC3 肝腺癌 SK-HEP-1 ATCC：HTB-52 GPC3阴性

效靶比视情况分别为3∶1，1∶1和1∶3，靶细胞数量为10000/孔，根据不同效靶比对应效应细胞。各组均设5个复孔，取5个复孔的平均值。检测时间为第18h。 

其中各实验组和各对照组如下： 

各实验组：各靶细胞+表达不同嵌合抗原受体的CTL， 

对照组1：靶细胞最大释放LDH， 

对照组2：靶细胞自发释放LDH， 

对照组3：效应细胞自发释放LDH。 

检测方法：采用CytoTox96非放射性细胞毒性检测试剂盒(Promega公司)进行。该方法是基于比色法的检测方法，可替代⁵¹Cr释放法。CytoTox检测定量地测量乳酸脱氢酶(LDH)。LDH是一种稳定的胞质酶，在细胞裂解时会释放出来，其释放方式与⁵¹Cr在放射性分析中的释放方式基本相同。释放出的LDH培养基上清中，可通过30分钟偶联的酶反应来检测，在酶反应中LDH可使一种四唑盐(INT)转化为红色的甲臜(formazan)。生成的红色产物的量与裂解的细胞数成正比。具体参照CytoTox96非放射性细胞毒性检测试剂盒说明书。 

细胞毒性计算公式为： 

实验结果表明： 

具体如表4所示，本发明的表达嵌合抗原受体GPC3-Z CAR⁺的CTL和GPC3-28BBZCAR⁺的CTL对高表达GPC3的肝细胞癌细胞系PLC/PRF/5和Hep3B均表现出非常显著的特异性细胞毒性作用，并呈现效靶比梯度依赖性即效靶比越高细胞毒性作用越强，而对GPC3阴性的肝细胞癌细胞系SK-HEP-1没有特异性细胞毒性作用。其中GPC3-28BBZ在效靶比3∶1时对高表达GPC3的肝癌细胞PLC/PRF/5的细胞毒性高达97％，对高表达GPC3的肝癌细胞Hep3B的细胞毒性高达81％。 

效靶比依赖性的数据进一步显示本发明的表达本发明的GPC3嵌合抗原受体的CTL对高表达GPC3的肝癌细胞的特异性细胞毒性作用。 

相比较而言，被含有mock质粒(不携带GPC3-CAR的空质粒载体pPWT-eGFP)的病毒转染的作为空白对照的CTL显示对上述三种细胞的细胞毒性作用均非常低，显示出对GPC3表达的不敏感，其细胞毒性与表达本发明的GPC3嵌合抗原受体的CTL的细胞毒性数据呈现出非常显著大的差异。 

表4 

表5本发明中的序列 

序列 说明 SEQ ID NO：1～17 引物序列 SEQ ID NO：18 编码嵌合抗原受体蛋白GPC3-Z的核酸序列 SEQ ID NO：19 编码嵌合抗原受体蛋白GPC3-BBZ的核酸序列 SEQ ID NO：20 编码嵌合抗原受体蛋白GPC3-28Z的核酸序列 SEQ ID NO：21 编码嵌合抗原受体蛋白GPC3-28BBZ的核酸序列 SEQ ID NO：22 嵌合抗原受体蛋白GPC3-Z氨基酸序列 SEQ ID NO：23 嵌合抗原受体蛋白GPC3-BBZ氨基酸序列 SEQ ID NO：24 嵌合抗原受体蛋白GPC3-28Z氨基酸序列 SEQ ID NO：25 嵌合抗原受体蛋白GPC3-28BBZ氨基酸序列 SEQ ID NO：26 pWPT-eGFP-F2A-GPC3-δZ载体全序列 SEQ ID NO：27 pWPT-eGFP-F2A-GPC3-Z载体全序列 SEQ ID NO：28 pWPT-eGFP-F2A-GPC3-BBZ载体全序列 SEQ ID NO：29 pWPT-eGFP-F2A-GPC3-28Z载体全序列 SEQ ID NO：30 pWPT-eGFP-F2A-GPC3-28BBZ载体全序列 SEQ ID NO：31 编码阴性对照的嵌合抗原受体蛋白eGFP-GPC3-δZ的核酸序列 SEQ ID NO：32 编码阴性对照的嵌合抗原受体蛋白GPC3-δZ的氨基酸序列

所有本说明书中列出的出版物的内容都包含在本说明书中。此外，本领域技术人员可以理解，在不背离权利要求书中所述的技术范围和实质内容的情况下，对本发明进行多种不同的修饰和改变是可能的。本发明还包括上述这些修饰和改变。