表达嵌合性抗原受体的T淋巴细胞介导的肿瘤过继性免疫治疗作用的临床前研究

摘要

第一部分 CD137(4-1BB)在表达靶向叶酸受体α嵌合抗原受体T细胞介导的肿瘤过继性免疫治疗中作用的研究
　　 研究背景：
　　 肿瘤的过继性免疫治疗是指通过体外培养、筛选并扩增肿瘤特异性T细胞进而回输患者体内，以达到放大机体抗肿瘤免疫目的的肿瘤治疗方法。目前主要包括两种获得肿瘤特异性T细胞的方法：一种是存在于患者肿瘤组织内的浸润性淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes，TILs)的体外培养、扩增及肿瘤特异性的筛选；另一种是利用基因工程技术修饰外周血T细胞使其获得肿瘤特异性并在体外迅速扩增。其中，利用基因工程修饰外周血T细胞使其表达嵌合性抗原受体(chimeric angtigen receptor，CAR)来特异性识别肿瘤相关性抗原的方法是一种有前景的肿瘤免疫治疗策略。嵌合性抗原受体主要由细胞膜外抗原结合区和细胞内信号转导区两部分通过多肽接头(Linker)及跨膜区构成。膜外区具有特异性识别并结合肿瘤细胞表面抗原的功能，其构成是将单克隆抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)用一可弯曲的多肽接头将VH和VL连接起来，构建成由单链可变区结构域(single chain variable fragment，scFv)组成的抗原结合区，其形式为VH-Linker-VL或VL-Linker-VH。细胞内信号转导区主要来源于T细胞受体的CD3ζ链。近年来，随着对嵌合性抗原受体结构及功能研究的发展，更多的研究者把CD28或CD137(4-1BB)协同共刺激信号分子与CD3ζ链的细胞内区顺式组成胞内信号转导区，使表达嵌合性抗原受体的T细胞与肿瘤表面抗原结合时更充分激活及免疫应答而杀伤肿瘤细胞。T细胞通过CAR与靶细胞结合后，胞内信号转导区将信号传入T细胞，从而激活T细胞，分泌细胞因子包括穿孔素、颗粒酶、INF-γ、TNF-α等发挥杀伤作用。同时，表达嵌合性抗原受体的T细胞具有MHC非限制性靶细胞识别功能。
　　 嵌合性抗原受体应用的关键是确定一种肿瘤相关抗原，这种抗原具有在肿瘤细胞表面过表达或高表达，而在正常组织无表达或低表达。人α型叶酸受体(alpha folate receptor，FRα)是一种通过聚糖磷脂酰肌醇(GPI)锚着于膜上的糖蛋白，对叶酸具有高度亲和力，在正常组织分布较少，而在多种上皮源性肿瘤包括上皮性卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌、肾癌、肺癌、结肠癌和鼻咽癌中有过度表达或高表达。研究表明，FRα过度表达于90％上皮性卵巢癌中，可作为卵巢癌免疫治疗的一种有效的靶抗原。因此，构建靶向FRα的嵌合性抗原受体，对于过度表达FRα肿瘤的过继性T细胞免疫治疗具有重要临床前指导意义。
　　 目的：
　　 本研究旨在构建靶向FRα第一代(FR-CD3ζ)及第二代(FR-4-1BB-CD3ζ)嵌合性抗原受体及利用慢病毒载体将嵌合性抗原受体基因转导至人外周血T淋巴细胞；评价表达嵌合性抗原受体的T淋巴细胞体外及体内实验中的抗肿瘤作用以及4-1BB(CD137)在表达第二代嵌合性抗原受体T细胞中的共刺激信号作用的研究。
　　 方法：
　　 1.利用流式细胞仪技术检测肿瘤细胞表面FRα抗原的表达。
　　 2.构建靶向FRα的嵌合性抗原受体并利用慢病毒载体将嵌合性抗原受体基因转导至T淋巴细胞，并利用流式细胞仪技术检测T淋巴细胞表面嵌合性抗原受体的表达。
　　 3.检测表达嵌合性抗原受体的T淋巴细胞在体外抗肿瘤功能包括细胞因子释放及细胞杀伤试验。
　　 4.检测表达嵌合性抗原受体的T淋巴细胞在免疫缺陷小鼠SKOV3移植瘤模型中的体内抗肿瘤作用，包括WINN分析、小鼠皮下移植瘤、腹水及肺转移瘤模型。
　　 5.比较不同途径包括瘤内注射(intratumor injection，IT)、静脉注射(intravenousinjection，IV)及腹腔注射(intraperitoneal injection，IP)等输入表达嵌合性抗原受体的T淋巴细胞的抗肿瘤作用。
　　 6.比较接受表达FR-CD3z，FR-BBz，GFP以及CD19-BBζ CAR T细胞的荷瘤小鼠外周血中人CD4+和CD8+T细胞生存期。
　　 结果：
　　 1.流式细胞技术分析表明多数人卵巢癌细胞及乳腺癌细胞高表达FRα。
　　 2.靶向FRα的嵌合性抗原受体成功构建并高表达于T淋巴细胞表面。
　　 3.表达靶向FRα的嵌合性抗原受体的T细胞在体外能够特异性识别FRα(+)的肿瘤细胞，并主要释放Th1细胞因子，包括IFN-γ、TNF-α及IL-2，低表达Th2细胞因子包括IL-4和IL-10。表达靶向FRα的嵌合性抗原受体的T细胞能够杀伤并裂解FRα(+)的肿瘤细胞，但不能裂解FRα(-)的肿瘤细胞。
　　 4.表达靶向FRα嵌合性抗原受体含有CD137(4-1BB)协同刺激分子的T细胞与不含CD137(4-1BB)协同刺激分子的嵌合性抗原受体T细胞相比，在Winn分析中表现出明显抑制FRα(+)肿瘤细胞生长的活性(p=0.026)。在皮下移植肿瘤模型中，表达第一代FR-CD3z嵌合性抗原受体的T细胞只能延缓肿瘤生长，而表达第二代嵌合性抗原受体FR-BBz的T细胞却能使较大的FRα(+)皮下移植肿瘤缩小至消失(p<0.0001)，而且这种肿瘤根除是抗原特异性的，因为靶向CD19-BBz T细胞不能抑制皮下移植肿瘤的生长。在FRα(+)肿瘤转移性腹水模型中，不论是IP或者IV途径注射表达FR-BBz嵌合性抗原受体的T细胞能够明显抑制小鼠腹水的形成，并提高治疗组小鼠的生存期(IP治疗组中位生存期68天，IV治疗组中位生存期52天)，而对照组接受靶向CD19的嵌合性抗原受体T细胞治疗2-3周后小鼠却形成较大量的血型腹水(5-8ml)，所有对照组小鼠由于大量腹水、行动迟缓而被处死(IP治疗组中位生存期9天，IV治疗组中位生存期12天)。在肺移植瘤转移模型中，表达FR-BBζ嵌合性抗原受体的T细胞能够快速使肿瘤缩小、甚至消失，80％(4/5)治疗组小鼠无证据显示肿瘤存在，而对照组小鼠肺转移肿瘤生长迅速，两组差异有统计学意义(p<0.01)。
　　 5.不论是IT、IP或者IV途径注射T细胞，与对照组接受gfp、FR-△z T细胞的荷瘤小鼠相比，人CD4+和CD8+T细胞计数在接受FR-BBz嵌合性抗原受体T细胞的荷瘤小鼠外周血中最高。值得注意的是，人CD4+和CD8+T细胞计数在接受注射FR-BBz嵌合性抗原受体T细胞的荷瘤小鼠外周血中高于接受MOv19-ζ T细胞的荷瘤小鼠(p<0.01)。这表明4-1BB(CD137)在小鼠体内可延长表达嵌合性抗原受体T细胞存活期。
　　 6.人CD4+和CD8+T细胞计数在接受FR-BBz嵌合性抗原受体T细胞的荷瘤小鼠外周血中高于与接受gfp及靶向CD19-BBz嵌合性抗原受体T细胞的荷瘤小鼠(p=0.009)，提示抗原识别驱动了输入体内嵌合性抗原受体T细胞的增殖、扩增及存活。重要的是，人CD4+和CD8+T细胞计数在接受靶向CD19-BBζ嵌合性抗原受体T细胞的荷瘤小鼠外周血中高于接受gfp T细胞的荷瘤小鼠(p=0.012)，提示嵌合性抗原受体T细胞存活期可以通过引入4-1BB(CD137)协同共刺激分子而延长。
　　 结论：
　　 1.FRα是多种上皮源性肿瘤中一种很有应用价值的靶向抗原，构建靶向FRα的嵌合性抗原受体为表达FRα肿瘤的过继性细胞免疫治疗提供了新的方法。
　　 2.表达FRα嵌合性抗原受体的T细胞能够特异性识别FRα阳性的肿瘤细胞并分泌Th1为主的细胞因子，并能够特异性识别并杀伤肿瘤细胞。
　　 3.表达FRα嵌合性抗原受体的T细胞在体内能够有效的抑制肿瘤生长。而且在体内转移移植瘤模型中，表达FRα嵌合性抗原受体的T细胞能够抑制小鼠腹水形成、提高生存期并且能控制肺移植瘤的发展。
　　 4.嵌合性抗原受体含有CD137(4-1BB)协同共刺激分子能够增加体内抗肿瘤能力及延长T细胞生存期。
　　 5.表达FRα-BBz嵌合性抗原受体的T细胞抗肿瘤能力为临床应用提供了实验基础，但其有效性及安全性需要进一步临床试验确认。