法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2019-11-05
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C12P19/02 授权公告日:20161207 终止日期:20181115 申请日:20111115
专利权的终止
2016-12-07
授权
授权
2014-06-11
实质审查的生效 IPC(主分类):C12P19/02 申请日:20111115
实质审查的生效
2014-05-14
公开
公开
技术领域
本发明涉及使用一种或多种发酵生物从植物材料产生发酵产物的方法；可用于本发明的方法和/或工艺的组合物、转基因植物和修饰的发酵生物。
背景技术
大量难以合成产生的商品如今可通过发酵生物产生。此类产品包括醇(例如丁醇、乙醇、甲醇、1,3-丙二醇)；有机酸(例如乙酸、柠檬酸、葡糖酸酯/盐(gluconate)、葡糖酸、衣康酸、乳酸、琥珀酸、2,5-二酮-D-葡糖酸)，酮(例如丙酮)，氨基酸(例如谷氨酸)；气体(例如H2和CO2)，以及更复杂的化合物，包括，例如抗生素(例如青霉素和四环素)；酶；维生素(例如核黄素，B12，β-胡萝卜素)和激素。发酵亦常用于可消费的醇(例如啤酒和葡萄酒)，乳制品(例如，用于酸奶和奶酪的产生)，皮革，和烟草工业。
本领域中已知大量通过发酵由含淀粉材料的降解提供的糖而产生发酵产物如乙醇的方法。
然而，从此类植物材料产生发酵产物如乙醇仍然过于昂贵。因此，存在提供可增加发酵产物的收率(yield)，并由此减少生产成本的方法的需要。
本发明的一个目的是提供改善的用于产生发酵产物的方法/工艺。
发明内容
本发明涉及产生发酵产物的方法/工艺，其包括：
(a)在氨基酸氧化酶、精氨酸酶和/或天冬酰胺酶的存在下用α-淀粉酶将含淀粉材料液化为糊精；
(b)用糖化酶将糊精糖化为糖；和
(c)使用发酵生物发酵糖以产生发酵产物。
本发明亦涉及产生糖的方法/工艺，其包括：
(a)在氨基酸氧化酶、精氨酸酶和/或天冬酰胺酶的存在下用α-淀粉酶将含淀粉材料液化为糊精；和
(b)用糖化酶将糊精糖化为糖。
本发明亦涉及产生发酵产物的方法/工艺，其包括：
(a)用氨基酸氧化酶、精氨酸酶和/或天冬酰胺酶处理含淀粉材料；
(b)用α-淀粉酶将经处理的含淀粉材料液化为糊精；
(c)用糖化酶将糊精糖化为糖；和
(d)使用发酵生物发酵糖以产生发酵产物。
本发明亦涉及产生糊精的方法/工艺，其包括：
(a)在氨基酸氧化酶、精氨酸酶和/或天冬酰胺酶的存在下用α-淀粉酶将含淀粉材料液化为糊精；和
(b)回收所述糊精。
本发明亦涉及产生发酵产物的方法/工艺，其包括：
(a)用氨基酸氧化酶、精氨酸酶和/或天冬酰胺酶处理含淀粉材料；
(b)用α-淀粉酶将经处理的含淀粉材料液化为糊精；
(c)用糖化酶将糊精糖化为糖；和
(d)使用发酵生物发酵糖以产生发酵产物。
本发明亦涉及产生糖的方法/工艺，其包括：
(a)用氨基酸氧化酶、精氨酸酶和/或天冬酰胺酶处理含淀粉材料；
(b)用α-淀粉酶将经处理的含淀粉材料液化为糊精；和
(c)用糖化酶将糊精糖化为糖。
本发明亦涉及产生糊精的方法/工艺，其包括：
(a)用氨基酸氧化酶、精氨酸酶和/或天冬酰胺酶处理含淀粉材料；和
(b)用α-淀粉酶将经处理的含淀粉材料液化为糊精。
本发明亦涉及产生发酵产物的方法/工艺，其包括用α-淀粉酶将含淀粉材料转化为糊精；用葡糖淀粉酶将糊精糖化为糖；和在氨基酸氧化酶、精氨酸酶和/或天冬酰胺酶存在下在低于含淀粉材料的起始糊化温度的温度在单一步骤中使用发酵生物发酵糖。
本发明亦涉及产生发酵产物的方法/工艺，其包括：
(a)用氨基酸氧化酶、精氨酸酶和/或天冬酰胺酶处理含氨基酸和可溶性糖的植物提取物；
(b)从所述植物提取物产生糖蜜；
(c)稀释所述糖蜜；和
(d)用发酵生物发酵所述稀释的糖蜜以产生乙醇。
本发明亦涉及产生发酵产物的方法/工艺，其包括：
(a)用氨基酸氧化酶、精氨酸酶和/或天冬酰胺酶处理含氨基酸和可溶性糖的植物提取物；和
(b)用发酵生物发酵经处理的植物提取物以产生发酵产物。
本发明亦涉及产生糖的方法/工艺，其包括：
(a)用氨基酸氧化酶、精氨酸酶和/或天冬酰胺酶处理含氨基酸和可溶性糖的植物提取物；和
(b)从经处理的植物提取物回收糖。
本发明亦涉及产生蔗糖的方法/工艺，其包括：
(a)用氨基酸氧化酶、精氨酸酶和/或天冬酰胺酶处理含氨基酸和可溶性糖的植物提取物；
(b)澄清所述植物提取物；
(c)浓缩见于澄清的植物提取物中的糖(例如通过蒸发)以形成含蔗糖的糖浆；
(d)从所述糖浆结晶蔗糖；和
(e)回收蔗糖。
本发明亦涉及组合物，其包含(a)天冬酰胺酶、精氨酸酶和/或氨基酸氧化酶，(b)葡糖淀粉酶和(c)α-淀粉酶。
发明详述
定义
α-淀粉酶(α-1,4葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，EC3.2.1.1)是一组酶，其催化淀粉和其它直链和支化的1,4-葡糖苷寡糖和多糖的水解。
氨基酸氧化酶(L-氨基酸氧化酶，EC1.4.3.2和D-氨基酸氧化酶，EC1.4.3.3)是一组酶，其催化下述反应：
精氨酸酶(L-精氨酸氨基水解酶，EC3.5.3.1)是一组酶，其催化下述反应：
L-精氨酸+H2O=鸟氨酸+尿素
天冬酰胺酶是EC3.5.1.1(天冬酰胺酶或L-天冬酰胺酰胺基水解酶)和EC3.5.1.38(谷氨酰胺-天冬酰胺-酶或谷氨酰胺酶天冬酰胺酶)的酶，其催化下述 反应：
L-天冬酰胺+H2O=L-天冬氨酸+NH4+
片段：术语“片段”意指具有从成熟多肽氨基和/或羧基端缺失一个或多个(几个)氨基酸的多肽，其中所述片段具有酶活性。
葡糖淀粉酶(葡聚糖-1,4-α-葡糖苷酶，EC3.2.1.3)是一组酶，其催化从链的非还原性末端连续地水解末端(1→4)-连接的α-D-葡萄糖残基，而释放β-D-葡萄糖。
分离的：术语“分离的”和“纯化的”意指从预期天然结合的至少一种组分分离的多肽或多核苷酸。例如，多肽或变体如通过SDS-PAGE确定可为至少1%纯，例如至少5%纯，至少10%纯，至少20%纯，至少40%纯，至少60%纯，至少80%纯，和至少90%纯，而多核苷酸如通过琼脂糖电泳确定可为至少1%纯，例如至少5%纯，至少10%纯，至少20%纯，至少40%纯，至少60%纯，至少80%纯，至少90%纯，和至少95%纯。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N端加工、C端截短、糖基化、磷酸化等之后以其最终形式存在的多肽。
亲本酶：术语“亲本”意指对其进行改变以产生变体的酶。亲本可为天然存在的(野生型)多肽或其变体。
序列同一性：参数“序列同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。
就本发明而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等,2000,Trends Genet.16:276-277)，优选3.0.0版或更高版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来测定。使用的可选参数为缺口开放罚分(gap open penalty)10，缺口延伸罚分(gap extension penalty)0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性(longest identity)”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下：
(同样的残基×100)/(比对长度-比对中缺口的总数)
就本发明而言，两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等,2000,见上文)，优选3.0.0版或更高版本的Needle程序中所执 行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,见上文)来测定。使用的参数为缺口开放罚分10，缺口延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下：
(同样的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度-比对中缺口的总数)
变体：术语“变体”意指在一个或多个(几个)位置包含改变，即取代、插入和/或缺失的多肽。取代意指将占据某位置的氨基酸用不同的氨基酸替代；缺失意指去除占据某位置的氨基酸；而插入意指在邻接占据某位置的氨基酸添加1-5个氨基酸。
野生型酶：术语“野生型”酶意指由天然出现的微生物，如见于自然界的细菌、酵母或丝状真菌所表达的酶。
用于从含淀粉材料产生发酵产物、糊精和糖的方法/工艺
本发明涉及产生发酵产物的方法/工艺，其包括：
(a)在氨基酸氧化酶、精氨酸酶和/或天冬酰胺酶的存在下用α-淀粉酶将含淀粉材料液化为糊精；
(b)用糖化酶将糊精糖化为糖；和
(c)使用发酵生物发酵糖以产生发酵产物。
本发明亦涉及产生糖的方法/工艺，包括：
(a)在氨基酸氧化酶、精氨酸酶和/或天冬酰胺酶的存在下用α-淀粉酶将含淀粉材料液化为糊精；和
(b)用糖化酶将糊精糖化为糖。
本发明亦涉及产生糊精的方法/工艺，其包括：
(a)在氨基酸氧化酶、精氨酸酶和/或天冬酰胺酶的存在下用α-淀粉酶将含淀粉材料液化为糊精；和
(b)回收所述糊精。
本发明亦涉及产生发酵产物的方法/工艺，其包括：
(a)用氨基酸氧化酶、精氨酸酶和/或天冬酰胺酶处理含淀粉材料；
(b)用α-淀粉酶将经处理的含淀粉材料液化为糊精；
(c)用糖化酶将糊精糖化为糖；和
(d)使用发酵生物发酵糖以产生发酵产物。
本发明亦涉及产生糖的方法/工艺，其包括：
(a)用氨基酸氧化酶、精氨酸酶和/或天冬酰胺酶处理含淀粉材料；
(b)用α-淀粉酶将经处理的含淀粉材料液化为糊精；和
(c)用糖化酶将糊精糖化为糖。
本发明亦涉及产生糊精的方法/工艺，其包括：
(a)用氨基酸氧化酶、精氨酸酶和/或天冬酰胺酶处理含淀粉材料；和
(b)用α-淀粉酶将经处理的含淀粉材料液化为糊精。
淀粉在植物细胞中作为不溶于水的微小颗粒形成。当置于冷水中时，淀粉颗粒可吸收少量液体并膨胀(swell)。在高至50℃-75℃的温度，膨胀可为可逆的。然而，在更高温度开始称为“糊化”的不可逆膨胀。待加工的粒状淀粉可为高度精制的淀粉品质，优选至少90%，至少95%，至少97%或至少99.5%纯，或其可为更加粗制的含淀粉材料，其含有包括非淀粉部分(如胚残余物和纤维)的(例如，经磨制的)全谷粒。原材料(如全谷粒)可通过例如磨制减小粒度以打开其结构并允许进一步的加工。根据本发明优选两种方法/工艺，湿磨和干磨。在干磨中，将整粒磨碎并使用。湿磨导致胚和粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)的良好分离，并常常用于使用淀粉水解物产生例如糖浆的场合(location)。干磨和湿磨在淀粉加工领域都是众所周知的，并可用于本发明的方法/工艺中。在一个实施方案中，粒度减少至约0.05-3.0mm，优选0.1-0.5mm，或使得至少30%，优选至少50%，更优选至少70%，甚至更优选至少90%的含淀粉材料可穿过具有0.05-3.0mm筛网，优选0.1-0.5mm筛网的筛。
可使用所述含淀粉材料产生糖、糊精或发酵产物。一般而言，用α-淀粉酶将含淀粉材料液化为糊精，接着进行糖化(将糊精转化为糖的方法/工艺)和发酵(将糖转化为发酵产物的方法/工艺)。
在一个实施方案中，在液化之前，将所述含淀粉材料用氨基酸氧化酶、精氨酸酶和/或天冬酰胺酶处理。该处理可在任何适于酶活性的pH和温度进行一段时间以允许酶反应发生。在一个实施方案中，温度在20-75℃，例如20-65℃或40-60℃的范围；pH在4.5-6.5的范围；和时间为5分钟-2小时，例如5分钟-1小时的范围。
在一个实施方案中，在液化之前将谷氨酰胺酶添加至含淀粉材料。在另一个实施方案中，在液化之前将精氨酸酶添加至含淀粉材料。在另一个实施方案中，在液化之前将氨基酸氧化酶添加至含淀粉材料。在另一个实施方案中，在液化之前将谷氨酰胺酶、精氨酸酶和氨基酸氧化酶添加至含淀粉材料。
谷氨酰胺酶和/或氨基酸氧化酶亦可在液化过程中添加。在一个实施方案中，谷氨酰胺酶在液化过程中添加。在另一个实施方案中，精氨酸酶在液化过程中添加。在另一个实施方案中，氨基酸氧化酶在液化过程中添加。在另一个实施方案中，谷氨酰胺酶、精氨酸酶和氨基酸氧化酶在液化过程中存在。
液化在α-淀粉酶，优选细菌α-淀粉酶和/或酸性真菌α-淀粉酶的存在下进行。在一个实施方案中，肌醇六磷酸酶亦在液化过程中存在。
在典型的液化过程中，通过α-淀粉酶将长链淀粉降解成更短的支化和直链单元(麦芽糊精)。液化通常以三步热浆过程进行。将浆料加热至60-95℃(例如，77-86℃，80-85℃，或83-85℃)，并且加入α-淀粉酶以起始液化(稀化)。液化方法/工艺在85℃进行1-2小时。pH通常为5.5-6.2。为了确保在这些条件下最佳的酶稳定性，任选地加入1mM钙(提供约40ppm游离钙离子)。在这种处理后，液化淀粉具有10-15的“右旋糖当量”(DE)。
然后可将浆料喷射蒸煮(jet-cook)至95-140℃，例如，105-125℃进行约1-15分钟，例如约3至10分钟，特别是5分钟左右。然后将浆料冷却至60-95℃，并加入更多的α-淀粉酶以获得最终水解(次级液化)。喷射蒸煮方法/工艺在pH4.5-6.5，通常在pH5-6进行。α-淀粉酶可作为单剂例如在喷射蒸煮之前添加。
糖化可使用本领域公知的条件用葡糖淀粉酶或β-淀粉酶和任选地脱支酶如异淀粉酶或普鲁兰酶进行。例如，完整糖化步骤可持续约24至约72小时，然而，通常在30-65℃，通常约60℃的温度进行通常40至90分钟的预糖化，然后在同时糖化和发酵(SSF)方法/工艺中的发酵过程中完全糖化。糖化通常在20-75℃，例如25-65℃和40-75℃的范围，通常约60℃的温度，和在约4-5的pH，通常在约pH4.5进行。
糖化和发酵步骤可顺序或同时进行。在一个实施方案中，糖化和发酵同时进行(SSF)，其中对于糖化无保持阶段，意指发酵生物如酵母和酶一同添加。当发酵生物是酵母，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的菌株，且发酵产物是乙醇时，SSF通常在20-40℃，例如26-34℃，优选32℃左右的温度进行。
其它发酵产物可在本领域技术人员公知的、适于所讨论的发酵生物的条件和温度进行发酵。在发酵过程中，温度可向上或向下调整。
糊精可通过本领域中公知的方法来回收。
糖可通过本领域中公知的方法来回收。
发酵产物可通过本领域中公知的方法，例如通过蒸馏来回收。
在一个具体实施方案中，本发明的方法/工艺在将含淀粉材料转化为糊精和/或用氨基酸氧化酶、精氨酸酶和/或天冬酰胺酶处理含淀粉材料之前，进一步包括下述步骤：
(x)减少所述含淀粉材料的粒度；和
(y)形成包含所述含淀粉材料和水的浆料。
用于减少含淀粉材料的粒度的方法对于本领域技术人员是已知的。在一个实施方案中，磨制所述含淀粉材料以减少粒度。
水性浆料可含有含淀粉材料的10-55wt.%干固体(DS)，优选25-45wt.%干固体(DS)，更优选30-40wt.%干固体(DS)。
自未糊化的含淀粉材料产生发酵产物的方法
本发明亦涉及从未经糊化(常称作“未经烹制”)的含淀粉材料产生发酵产物的方法。在一个实施方案中，该方法包括在起始糊化温度以下，优选在α-淀粉酶和/或糖原生成酶(糖化酶)的存在下对(例如经磨制的)含淀粉材料糖化以产生糖类，所述糖类可由合适的发酵生物发酵成发酵产物。
因此，本发明的该方面涉及产生发酵产物的方法，其包括：用α-淀粉酶将含淀粉材料转化为糊精；用葡糖淀粉酶将所述糊精糖化为糖；和使用发酵生物在氨基酸氧化酶、精氨酸酶和/或天冬酰胺酶的存在下在低于所述含淀粉材料的起始糊化温度的温度在单步中发酵所述糖。
术语“起始糊化温度”意指淀粉发生糊化的最低温度。一般而言，在水中加热的淀粉在约50℃-75℃开始糊化；糊化的准确温度取决于特定的淀粉，并可方便的由本领域技术人员确定。从而，起始糊化温度可根据植物物种，植物物种的特定品种以及生长条件而改变。给定含淀粉材料的起始糊化温度可确定为使用由Gorinstein和Lii,1992,Starch/
本发明的方法可进一步包括例如通过蒸馏回收所述发酵产物。
所述发酵产物可为浆料，如可制备粒状淀粉，其具有含淀粉材料的10-55wt.%干固体(DS)，优选25-45wt.%干固体，更优选30-40wt.%干固体。浆料可包含水分和/或工艺水(process water)，例如釜馏物(逆流(backset))、洗涤水(scrubber water)、蒸发器冷凝液或馏出物、来自蒸馏的侧线汽提器水(side-stripper water)或来自其它发酵产物设备(plant)的工艺水。由于该方法/工艺在糊化温度以下进行，因此不发生显著的粘度增加，如果需要，可使用高 水平的釜馏物。在一个实施方案中，含水浆料包含约1至约70vol%，优选15-60vol%，特别为约30至50vol%水分和/或工艺水，例如釜馏物(逆流)、洗涤水(scrubber water)、蒸发器冷凝液或馏出物、来自蒸馏的侧线汽提器水或来自其它发酵产物设备的工艺水，或其组合等。
可通过优选以干磨或湿磨将其粒度减小到0.05-3.0mm，优选0.1-0.5mm来制备含淀粉材料。在进行本发明的方法或方法/工艺后，含淀粉材料中至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或者至少99%的干固体转化为可溶的淀粉水解物。
本发明该方面的方法在低于起始糊化温度的温度，例如，在24-40℃，如25-40℃，29-35℃，30-34℃范围，如32℃左右的温度进行。本领域技术人员可容易地确定合适的工艺条件。
本发明的方法可在约3-7的pH，例如3.5至6或4至5的pH进行。
在一个实施方案中，进行该方法/工艺从而使得糖水平，如葡萄糖水平保持在低水平，如6wt%以下，约3wt%以下，约2wt%以下，约1wt%以下，约0.5wt%以下或0.25wt%以下，或约0.1wt%以下。所述低水平的糖可通过简单地采用经调整量的酶和发酵生物来实现。本领域技术人员可方便地确定使用的发酵生物和酶的剂量/量。发酵生物和酶的使用量也可经选择以保持麦芽糖在发酵液中的低浓度。举例而言，麦芽糖水平可保持为约0.5wt%以下，如约0.2wt%以下。
含淀粉材料
在本发明的方法中，可使用任何合适的含淀粉的起始材料。所述起始材料通常基于期望的发酵产物而选择。适用于本发明方法/工艺的含淀粉的起始材料的实例包括大麦、豆(bean)、木薯、谷类、玉米、买罗高粱、豌豆(pea)、马铃薯、稻、黑麦、西米、高粱、甘薯、树薯、小麦、和全谷粒，或它们的组合。所述含淀粉材料亦可为蜡质或非蜡质类型的玉米和大麦。
从植物提取物产生发酵产物和糖
该发明亦涉及从含氨基酸和可溶性糖(例如果糖、半乳糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和/或其寡聚物)的植物提取物例如甘蔗产生糖和/或发酵产物如乙醇的方法/工艺，其包括将天冬酰胺酶和/或氨基酸氧化酶施于所述植物提取物。
具体而言，本发明涉及产生发酵产物的方法，其包括：
(a)用氨基酸氧化酶、精氨酸酶和/或天冬酰胺酶处理含氨基酸和可溶性糖的植物提取物；
(b)从所述植物提取物产生糖蜜；
(c)稀释所述糖蜜；和
(d)用发酵生物发酵所述稀释的糖蜜以产生乙醇。
本发明亦涉及产生发酵产物的方法/工艺，其包括：
(a)用氨基酸氧化酶、精氨酸酶和/或天冬酰胺酶处理含氨基酸和可溶性糖的植物提取物；和
(b)用发酵生物发酵经处理的植物提取物以产生发酵产物。
本发明亦涉及产生糖的方法/工艺，其包括：
(a)用氨基酸氧化酶、精氨酸酶和/或天冬酰胺酶处理含氨基酸和可溶性糖的植物提取物；和
(b)从经处理的植物提取物回收糖。
本发明亦涉及产生蔗糖的方法/工艺，其包括：
(a)用氨基酸氧化酶、精氨酸酶和/或天冬酰胺酶处理含氨基酸和可溶性糖的植物提取物；
(b)澄清所述植物提取物；
(c)浓缩见于澄清的植物提取物中的糖(例如通过蒸发)以形成含蔗糖的糖浆；
(d)从所述糖浆结晶蔗糖；和
(e)回收蔗糖。
所述糖可为任何糖，包括但不限于果糖、半乳糖、葡萄糖、麦芽糖或蔗糖。
甘蔗为任何6至37个甘蔗属(Saccharum)(禾本科(family Poaceae)，须芒草组(tribe Andropogoneae))的高的(tall)多年生草本植物的种。传统上，甘蔗加工需要两个阶段。磨坊(mill)从新鲜收获的甘蔗秆(cane)提取粗糖，并有时漂白该糖以制备“磨坊白糖(mill white sugar)”以供当地消费。提炼厂然后生产精制的白糖，其为99%蔗糖。
磨坊洗涤、砍劈甘蔗秆，并使用旋转刀(revolving knife)将甘蔗秆切碎(shred)。将切碎的甘蔗秆反复与水混合，并在称为破碎机(crusher)或浸提器(diffuser)的滚子(roller)之间压碎以产生粗甘蔗汁。粗甘蔗汁含有10-15%蔗糖，且将剩余的纤维性固体，称为甘蔗渣，作为燃料燃烧。接着将甘蔗汁与石灰 混合以将其pH调整至7。该混合阻止蔗糖分解为葡萄糖和果糖，并沉淀了一些杂质。然后静置混合物，允许石灰和其它悬浮固体沉降，得到澄清的汁液。其它用于澄清甘蔗汁的方法如亚硫酸处理和碳酸化在本领域中是已知的。将澄清的汁液在多效蒸发器(multiple-effect evaporator)中浓缩以制备含有约60wt.%蔗糖的糖浆。将该糖浆在真空下进一步浓缩，直至其变得过饱和，然后用结晶糖接种。在冷却之后，更多糖从糖浆结晶。离心使得蔗糖与糖蜜分离。进一步的结晶提取更多的蔗糖；最终残余物称为赤糖糊(blackstrap)。
在澄清之后，将水通过多步蒸发方法/工艺从甘蔗汁去除。该方法/工艺的剩余物，其不适于蔗糖提取，称为糖蜜，并通常用作供燃料乙醇产生的底物。
在本发明的方法/工艺中，将植物提取物用氨基酸氧化酶、精氨酸酶和/或天冬酰胺酶处理，并从经处理的植物提取物产生糖蜜。糖蜜通过澄清植物提取物；浓缩见于经澄清的植物提取物的糖(例如通过蒸发)以形成糖浆；和从糖浆结晶蔗糖以形成糖蜜来产生。然后将糖蜜用水或植物提取物汁(例如甘蔗汁)来稀释，并发酵经稀释的糖蜜以产生发酵产物。
所述植物提取物可用氨基酸氧化酶、精氨酸酶和/或天冬酰胺酶在任何蒸发之前的步骤中处理。例如，所述植物提取物可用氨基酸氧化酶、精氨酸酶和/或天冬酰胺酶在汁液提取、粉碎、汁液回收和/或汁液澄清过程中进行处理。因此，所述氨基酸氧化酶、精氨酸酶和/或天冬酰胺酶可在磨制方法/工艺过程中和/或在澄清步骤中添加。
本发明的方法/工艺可进一步包括回收所述发酵产物。
本发明的方法/工艺可进一步包括回收所述糖。所述糖可通过任何本领域中已知的方法/工艺回收。例如，蔗糖可通过包括下述步骤的方法/工艺回收：
(x)澄清植物提取物；
(y)浓缩见于经澄清的植物提取物的糖(例如通过蒸发)以形成糖浆；和
(z)从糖浆结晶蔗糖。
如上所述，通常，磨坊在7左右的pH进行针对糖和/或乙醇的粗汁液澄清以最小化Maillard产物形成。本发明的方法的另一个好处是可在更加碱性的pH如7.5-9，例如8-9的pH澄清粗汁液以供糖和/或乙醇产生。通过使用氨基酸氧化酶、精氨酸酶和/或天冬酰胺酶以避免Maillard产物形成，可使用更高的pH，这在品质(糖白度和/或较淡的汁液(juice lighter)、产量(减少了在精制方法/工艺中损失的糖的量)和生产力(减少了澄清的保持时间)方面改善了澄清性能。
所述植物提取物可为甜高粱、糖甜菜、甘蔗，或其任意混合物。具体而言，所述植物提取物可为粗甘蔗汁或澄清的甘蔗汁。
发酵产物
术语“发酵产物”意指包括使用发酵生物发酵的方法或方法/工艺生成的产物。根据本发明所包括的发酵产物包括醇类(例如，乙醇、甲醇、丁醇)；有机酸(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、琥珀酸、葡糖酸)；酮类(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，H2和CO2)；抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、B12、β-胡萝卜素)；以及激素。在一个优选实施方案中，所述发酵产物是乙醇，例如，燃料乙醇；饮用乙醇(即，可饮用的中性酒)；或工业乙醇或用于可饮用醇类工业(例如，啤酒和葡萄酒)、乳制品工业(例如，发酵的乳制品)、皮革工业和烟草工业的产物。优选的啤酒类型包括爱儿啤酒(ale)、烈性啤酒(stout)、钵尔透黑啤酒(porters)、陈贮啤酒(lagers)、苦味酒(bitters)、麦芽酒(malt liquors)、发泡酒(happoushu)、高醇啤酒(high-alcohol beer)、低醇啤酒(low-alcohol beer)、低热量啤酒(low-calorie beer)或清淡啤酒(light beer)。
发酵生物
术语“发酵生物”指适于产生所需发酵产物的任何生物，包括细菌和真菌生物如丝状真菌。根据本发明合适的发酵生物能够将可发酵的糖，如阿拉伯糖、果糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露糖和/或木糖直接或间接发酵即转化为所需的发酵产物。
发酵生物的实例包括真菌生物如酵母。优选的酵母包括酵母属，特别是酿酒酵母或葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)的菌株；毕赤酵母属(Pichia)，特别是树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的菌株，如树干毕赤酵母CBS5773，或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)的菌株；假丝酵母属(Candida)，特别是阿糖发酵假丝酵母(Candida arabinofermentans)、博伊丁氏假丝酵母(Candida boidinii)、迪丹斯假丝酵母(Candida diddensii)、休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)、Candida sonorensis，热带假丝酵母(Candida tropicalis)或产朊假丝酵母(Candida utilis)的菌株。其它发酵生物包括汉逊酵母属(Hansenula)，特别是异常汉逊酵母(Hansenula anomala)或多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)的菌株；克鲁维酵母(Kluyveromyces)，特别是脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)或马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)的菌株；裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，特别是粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的菌株。
优选的细菌发酵生物包括埃希氏菌属(Escherichia)，特别是大肠杆菌(Escherichia coli)的菌株，发酵单胞菌属(Zymomonas)，特别是运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的菌株，发酵细菌属(Zymobacter)，特别是棕榈发酵细菌(Zymobactor palmae)的菌株，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，特别是产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)的菌株，明串珠菌属(Leuconostoc)，特别是肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)的菌株，梭菌属(Clostridium)，特别是酪酸梭菌(Clostridium butyricum)的菌株，肠杆菌属(Enterobacter)，特别是产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)的菌株，以及热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)的菌株，特别是热厌氧杆菌BG1L1(Appl.Microbiol.Biotech.77:61-86)和乙醇热厌氧杆菌(Thermoanarobacter ethanolicus)、Thermoanaerobacter mathrani或热解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum)的菌株。还想到的是乳杆菌属(Lactobacillus)以及谷氨酸棒状杆菌R(Corynebacterium glutamicum R)，热葡糖苷酶芽孢杆菌(Bacillus thermoglucosidaisus)和热葡糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)的菌株。
在一个实施方案中，所述发酵生物是C6糖发酵生物，例如，酿酒酵母的菌株。
在一个实施方案中，将所述发酵生物添加至发酵培养基中从而使得每ml发酵培养基中活的发酵生物如酵母计数为105至1012，优选107至1010的范围内，特别是约5x107。
对于乙醇发酵，酵母是优选的发酵生物。优选酵母属(Saccharomyces)的菌株，特别是酿酒酵母菌种的菌株，优选对高水平的乙醇，即高至例如约10，12，15或20vol%或更高的乙醇具有抗性的菌株。
商业上可获得的酵母包括，例如LNF SA-1，LNF BG-1，LNF PE-2和LNF CAT-1(可从LNF Brazil获得)，RED STARTM和ETHANOL REDTM酵母(可从Fermentis/Lesaffre,USA获得)，FALI(可从Fleischmann’s Yeast,USA获得)，SUPERSTART和THERMOSACCTM新鲜酵母(可从Ethanol Technology,WI,USA获得)，BIOFERM AFT和XR(可从NABC-North American Bioproducts Corporation,GA,USA获得)，GERT STRAND(可从Gert Strand AB,Sweden获得)和FERMIOL(可从DSM Specialties获得)。
根据本发明，能够从可发酵的糖产生所需的发酵产物的发酵生物优选在准确的条件下以特定的生长速率生长。当将所述发酵生物导入/添加入所述发酵培养基时，接种的发酵生物经过许多阶段。起初，生长并未发生。该期间称为“迟 滞期”，且可视为适应期。在下一个称为“指数期”的阶段，生长速率逐渐增加。经过一段最大生长的时间，生长速率停止，且所述发酵生物进入“稳定期”。又一段时间后所述发酵生物进入“死亡期”，此时活细胞数减少。
发酵
发酵条件基于例如，植物材料的种类、可用的可发酵糖类、发酵生物和/或期望的发酵产物来确定。本领域技术人员可容易地确定合适的发酵条件。根据本发明的发酵可在通常使用的条件下进行。优选的发酵方法为厌氧方法。
举例而言，发酵可在高至75℃的温度，例如40-70℃，如50-60℃进行。然而，具有显著较低至室温左右(20℃左右)的最适温度的细菌也是已知的。合适的发酵生物的实例可见于上文“发酵生物”部分。
对于使用酵母的乙醇产生，发酵可进行24至96小时，特别是35至60小时。在一个实施方案中，发酵在20至40℃，优选26至34℃，特别是32℃左右的温度进行。在一个实施方案中，pH为3至6，优选为pH4至5左右。
其它发酵产物可在本领域技术人员已知适于所述发酵生物的温度进行发酵。
发酵通常在3至7范围的pH，优选在pH3.5至6，如pH5左右进行。发酵通常持续6-96小时。
本发明的方法可作为分批或连续过程进行。发酵可在超滤系统中进行，其中在固体、水和发酵生物存在下保持渗余物的循环，而其中渗透物为含有所期望的发酵产物的液体。同样涵盖的是在具有超滤膜的连续膜反应器中进行的方法/工艺，其中在固体、水和发酵生物存在下保持渗余物的循环，而其中渗透物为含有所期望的发酵产物的液体。
在发酵后，发酵生物可自发酵浆料分离并再循环。
发酵培养基
发酵培养基(″Fermentation media″或″fermentation medium″)指其中进行发酵的环境，并包括发酵底物，即由发酵生物代谢的糖源。
发酵培养基可包含对于发酵生物的其它营养物和生长刺激物。营养物和生长刺激物广泛用于发酵领域，并包括氮源如氨；维生素和矿物质，或其组合。
回收
在发酵之后，可将发酵产物从发酵培养基分离。可蒸馏发酵培养基以提取所需发酵产物，或可通过微滤或膜过滤技术从发酵培养基提取所需发酵产物。或者，发酵产物可通过汽提来回收。回收的方法在本领域是公知的。
酶
下述酶在本发明的方法中应以“有效量”使用。
天冬酰胺酶
所述天冬酰胺酶可为EC3.5.1.1(天冬酰胺酶或L-天冬酰胺酰胺基水解酶)或EC3.5.1.38(谷氨酰胺-天冬酰胺-酶或谷氨酰胺酶-天冬酰胺酶)的酶。
所述天冬酰胺酶可为微生物天冬酰胺酶，例如来源于细菌、古菌(archaeon)或真菌的天冬酰胺酶。例如，所述天冬酰胺酶可来源于古菌域(Archaea)、曲霉属、假丝酵母属、欧文氏菌属、镰孢属或酵母属。具体而言，所述天冬酰胺酶可来源于烟曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、产朊假丝酵母、菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemii)、大肠杆菌、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、桔青霉(Penicillium citrinum)或酿酒酵母。
在一个实施方案中，所述天冬酰胺酶与SEQ ID NO:1(米曲霉天冬酰胺酶)具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%的序列同一性。在另一个实施方案中，所述天冬酰胺酶包含或组成为SEQ ID NO:1的序列；或是SEQ ID NO:1具有天冬酰胺酶活性的片段。SEQ ID NO:1的片段包括氨基酸27-378，30-378，75-378和80-378的序列。
在另一个实施方案中，所述天冬酰胺酶与SEQ ID NO:2(黑曲霉天冬酰胺酶)具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%的序列同一性。在另一个实施方案中，所述天冬酰胺酶包含或组成为SEQ ID NO:2的序列；或是SEQ ID NO:2具有天冬酰胺酶活性的片段。SEQ ID NO:2的片段包括氨基酸80-378的序列。
在另一个实施方案中，所述天冬酰胺酶与SEQ ID NO:3(烟曲霉天冬酰胺酶)具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%的序列同一性。在另一个实施方案中，所述天冬酰胺酶包含或组成为SEQ ID NO:3的序列；或是SEQ ID NO:3具有天冬酰胺酶活性的片段。SEQ ID NO:3的片段包括氨基酸80-374的序列。
在另一个实施方案中，所述天冬酰胺酶与SEQ ID NO:4(构巢曲霉天冬酰胺酶)具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%， 至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%的序列同一性。在另一个实施方案中，所述天冬酰胺酶包含或组成为SEQ ID NO:4的序列；或是SEQ ID NO:4具有天冬酰胺酶活性的片段。SEQ ID NO:4的片段包括氨基酸80-378的序列。
在另一个实施方案中，所述天冬酰胺酶与SEQ ID NO:5(桔青霉天冬酰胺酶)具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%的序列同一性。在另一个实施方案中，所述天冬酰胺酶包含或组成为SEQ ID NO:5的序列；或是SEQ ID NO:5具有天冬酰胺酶活性的片段。SEQ ID NO:5的片段包括氨基酸80-379的序列。
在另一个实施方案中，所述天冬酰胺酶与SEQ ID NO:6(土曲霉天冬酰胺酶)具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%的序列同一性。在另一个实施方案中，所述天冬酰胺酶包含或组成为SEQ ID NO:6的序列；或是SEQ ID NO:6具有天冬酰胺酶活性的片段。SEQ ID NO:6的片段包括氨基酸80-375的序列。
在另一个实施方案中，所述天冬酰胺酶与SEQ ID NO:7(激烈火球菌天冬酰胺酶)具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%的序列同一性。在另一个实施方案中，所述天冬酰胺酶包含或组成为SEQ ID NO:7的序列；或是SEQ ID NO:7具有天冬酰胺酶活性的片段。SEQ ID NO:7的片段包括氨基酸80-375的序列。
可根据本发明使用的天冬酰胺酶可具有WO 2004/026043，WO 2004/030468，WO 2004/032648，WO 2008/110513，WO 2008/128974，WO 2008/128975，和WO 2008/151807中公开的氨基酸序列，或与本文中公开的天冬酰胺酶具有至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性的氨基酸序列。此种天冬酰胺酶优选来源于黑曲霉或米曲霉。
天冬酰胺酶的实例包括上述列出的天冬酰胺酶的变体，例如具有一个或多个保守氨基酸取代的变体。
所述天冬酰胺酶可经部分或完全的经翻译后加工。例如，它们可以在不同位置N端截短，从而会发现不同的N端序列。野生型米曲霉天冬酰胺酶(SEQ ID NO:1)当在米曲霉中产生时，发现其经非均质加工(heterogeneously processed)从而使得在纯化样品中发现至少四种N端序列，对应于多肽截短为氨基酸27-378，30-378，75-378或80-378。其它天冬酰胺酶可在相应的位置或在其它位置截短。例如，天冬酰胺酶可在紧接着对应于SEQ ID NO:1的任何位置27、30、75或80的位置之前截短。术语“紧接着…之前”意指该截短发生在提及的位置的N端侧。
所述天冬酰胺酶可显示高的热耐受性，例如高的热稳定性，或在高温下高的相对天冬酰胺酶活性。
在一个方面，所述天冬酰胺可为热稳定的，或具有高热稳定性。热稳定性可确定为热处理之后的剩余天冬酰胺酶活性除以无热处理下的天冬酰胺酶活性。热处理可在pH6或pH6左右在高温温育10、20、30或40分钟。在无热处理下的天冬酰胺酶活性可确定为在与经热处理的样品相同的缓冲液中在4℃温育相同时间的样品的天冬酰胺酶活性，或其可为热处理之前的天冬酰胺酶活性。
所述天冬酰胺酶可为热稳定的，并在pH6在高温温育一段时间例如20分钟之后，与未经热处理的天冬酰胺酶活性相比，显示至少90%，如至少80%，至少70%，至少60%，至少50%或至少40%的剩余天冬酰胺酶活性。
在本发明的语境中，高温可意指，例如55℃，58℃，60℃，61℃，62℃，63℃，64℃，65℃，66℃，67℃，68℃，69℃，70℃，72℃或75℃。
天冬酰胺酶活性可通过本领域中的任何已知方法确定。例如，天冬酰胺酶可通过将酶与L-天冬酰胺和羟胺在磷酸钾缓冲液在pH6温育20分钟，接着进行与FeCl2的偶联反应并测量A490(如WO 2008/135547的实施例4中所述)来确定。温育可为在任何合适的温度，例如55℃。
在另一个方面，所述天冬酰胺酶在高温下与参照温度例如37℃，40℃，45℃或50℃相比，可具有高相对活性。在高温和在例如37℃的天冬酰胺酶活性可如上所述确定，其中与天冬酰胺的温育在高温和37℃分别进行。在高温的天冬酰胺酶活性除以在37℃的活性可为至少110%，优选至少120%，如至少125%，130%，140%，150%，170%或200%，更优选至少250%，如至少300%，且甚至更优选至少500%或至少700%。
所述天冬酰胺酶可为变体，其在至少一个下述区域包含氨基酸差异：位置68至74，位置279至288，位置309至319，位置329至342，和/或位置356至363；其中每个位置对应于SEQ ID NO:1的氨基酸1至378的位置。
因此，所述天冬酰胺酶可在选自下组的一个或多个位置包含氨基酸序列中的差异：68，69，70，71，72，73，74，279，280，281，282，283，284，285，286，287，288，309，310，311，312，313，314，315，316，317，318，319，329，330，331，332，333，334，335，336，337，338，339，340，341，342，356，357，358，359，360，361，362，和/或363，其中每个位置对应于SEQ ID NO:1中的位置。在一个优选实施方案中，所述氨基酸差异是取代。
在另一个实施方案中，所述天冬酰胺酶在选自下组的一个或多个位置包含氨基酸差异：D88，D111，K194，R196，D206，E235，E255，R266，D275，K290，E311，和E331；其中每个位置对应于SEQ ID NO:1的氨基酸1至378的位置。优选地，所述氨基酸差异是取代。因此，在一个优选的方面，所述天冬酰胺酶包含选自下组的一个或多个取代：D88N，D111N，K194E，R196E，D206N，E235Q，E255Q，R266L，D275N，K290E，E311K，和E331Q。
在另一个实施方案中，所述天冬酰胺酶在选自下组的至少一个下述位置包含氨基酸差异：N70，G82，I83，Q84，T85，T113，D115，A137，V164，L201，N278，T280，F306，I365，和E366，其中每个位置对应于SEQ ID NO:1的氨基酸1至378的位置。优选地，所述氨基酸差异是取代。因此，在一个优选的方面，所述天冬酰胺酶包含选自下组的至少一个下述氨基酸取代：N70P，G82P，I83P，Q84P，T85P，T113P，D115P，A137P，V164P，L201P，N278P，T280P，F306P，I365P，和E366P。
在另一个实施方案中，所述天冬酰胺酶在选自下组的一个或多个位置包含氨基酸差异：S176，D223，G231，P246，Y271，S283，G328(取代为C会潜在地导致一个或多个二硫桥联的形成)；D223，K249，和D286(基于疏水或静电接触)，其中每个位置对应于SEQ ID NO:1的氨基酸1至378的位置。优选地，所述氨基酸差异是取代。因此，在一个优选的方面，所述天冬酰胺酶包含选自下组的一个或多个取代：S176C；D223C；D223N/L；G231C；P246C；K249V/I/L；Y271C；S283C；D286R/N/L；和G328C。
在另一个实施方案中，所述天冬酰胺酶在一个或多个下述位置包含氨基酸差异：D69；N70；A72；N278；D279；T280；L281；S283；D286；K290； S307；E311；D312；H317；A336；E337；Q361；和K363，其中每个位置对应于SEQ ID NO:1的氨基酸1至378的位置。优选地，所述氨基酸差异是取代。因此，在一个优选的方面，所述天冬酰胺酶包含选自下组的一个或多个取代：D69R/K；N70P/R/K；A72R/K；N278H/Q/R/K；D279N/V/R；T280D/E；L281D/E；D286N/V/R；K290E/L；S307A/D/E；E311Q/I/R；D312Y/N/V/R；H317D/E；A336P；E337Q/R/K/I；Q361K/R；和K363P/Q/E/L。
在另一个实施方案中，所述天冬酰胺酶在选自下组的一个或多个下述位置包含氨基酸差异：54，57，70，83，84，86，93-96，102，107，137，139，165，172，184-186，209，212，214，215，219，220，224，260，262，264，266，299，318，320，321，323，325，327，349，351，353和356，其中每个位置对应于SEQ ID NO:1的氨基酸1至378的位置。优选地，所述氨基酸差异是取代。因此，在一个优选的方面，所述天冬酰胺酶包含选自下组的一个或多个取代：V54I，F57L，N70K，I83V，Q84D，L86P，M93L，L94K，N95D，V96L，V102D，V107I，A137I，V139I，I165L，S172A，L184Y，Q185N，S186A，V209G，F212R，A214V，S215T，A219T，N220T，T224A，N260K，T262D，I264L，R266K，S299N，N318G，P320V，I321V，A323R，T325S，T327V，A349Q，S351A，V353I和G356M。
在一个更优选的方面，所述天冬酰胺酶包含选自下组的一个或多个取代：V54I，F57L，N70K，I83V，Q84D，L86P，V102D，N260K，T262D，A323R，T327V，A349Q，S351A和V353I，其中每个位置对应于SEQ ID NO:1中的位置。
在一个甚至更优选的方面，所述天冬酰胺酶包含选自下组的一个或多个取代：N70K，A323R，T327V，A349Q，S351A和V353I，其中每个位置对应于SEQ ID NO:1中的位置。
在另一个实施方案中，所述天冬酰胺酶在至少一个下述位置包含氨基酸差异：54，57，68-74，82-86，88，93-96，102，107，111，113，115，137，139，164，165，172，176，184-186，194，196，201，206，209，212，214，215，219，220，223，224，226，228，231，235，246，249，255，260，262，264，266，271，275，278-288，290，299，306，307，309-321，323，325，327-342，349，351，353，356-363，365，366和375，其中每个位置对应于SEQ ID NO:1中的位置。
优选地，所述天冬酰胺酶在至少一个下述位置包含氨基酸差异：54，57，70，83，84，86，102，137，164，196，201，228，260，262，278，283，290，307，312，323，327，334，336，337，349，351，353，366和/或375，其中每个位置对应于SEQ ID NO:1中的位置。
所述天冬酰胺酶可包含氨基酸取代。优选地，所述天冬酰胺酶包含至少一个下述取代：54I，57L，69K/R，70H/K/P/R/S，72K/R，82P，83P/V，84P/D，85P，86P，88N，93L，94K，95D，96L，102D，107I，111N，113P，115P，137P/S/I，139I，164D/P，165L，172A，176C，184Y，185N，186A，194E，196E/I，201P/Q，206N，209G，212R，214V，215T，219T，220T，223C/L/N，224A，228V，231C，235Q，246C，249I/L/V，255Q，260K，262D，264L，266L/K，271C，275N，278H/K/P/Q/R，279N/R/V，280D/E/P，281D/E，283C，286L/N/R/V，290E/L/V，299N，306P，307A/D/E，311I/K/Q/R，312N/R/V/Y，317D/E，318G，320V，321V，323R，325S，327V，328C，331Q，334F，336C/G/L/P，337F/I/K/Q/R，349Q，351A，353I，356M，361K/R，363E/L/P/Q，365P，366P和/或375T。更优选地，所述天冬酰胺酶包含至少一个下述取代：54I，57L，70H/K/S，83V，84D，86P，102D，137S，164D，196I，201Q，228V，260K，262D，278H/Q，283C，290V，307A，312Y，323R，327V，334F，336C/G/L，337F/I，349Q，351A，353I，366P和/或375T。甚至更优选地，所述天冬酰胺酶包含至少一个，如至少两个，至少三个，至少四个或至少五个下述取代：70K，323R，327V，349Q，351A和/或353I。甚至更优选地，所述天冬酰胺酶包含下述取代：70K，323R，327V，349Q，351A和353I。更优选地，所述天冬酰胺酶与SEQ ID NO:1或同源序列具有相同序列，除了下述取代：70K，323R，327V，349Q，351A和353I。所述天冬酰胺酶可为具有SEQ ID NO:1或同源序列的序列的亲本酶的变体。
在一个方面，所述天冬酰胺酶在对应于任何下述位置的位置包含氨基酸差异：SEQ ID NO:1中的70，137，164，196，201，228，278，290，366和/或375。优选地，所述天冬酰胺酶包含至少一个下述取代：70H/K/S，137S，164D，196I，201Q，228V，278H/Q，290V，366P和/或375T。所述天冬酰胺酶可在高温下具有较高的相对天冬酰胺酶活性。
特别优选的天冬酰胺酶包含下述取代或取代的集合：70H，70K，70K+278H，70K+278H+196I，70K+278H+201Q，70K+283C，70S，137S， 137S+228V，164D，196I，201Q，278H，278Q，290V，366P，和/或366P+375T。
在另一个优选的方面，所述天冬酰胺酶在至少一个下述位置包含氨基酸差异：70，283，307，312，334，336和/或337。优选地，所述天冬酰胺酶包含至少一个下述取代：70K，283C，307A，312Y，334F，336C/G/L和/或337F/I，其中每个位置对应于SEQ ID NO:1的氨基酸1至378的位置。
特别优选的天冬酰胺酶包含下述取代或取代组合：70K，70K+283C，70K+283C+307A+312Y，70K+283C+307A+312Y+336L+337F，70K+307A，70K+307A+312Y，70K+307A+312Y+334F，70K+307A+312Y+336G+337I，70K+307A+312Y+336L+337F，70K+312Y，和/或70K+336C+337F。
在本发明的另一个优选的方面，所述天冬酰胺酶在对应于任何下述位置的位置包含氨基酸差异：SEQ ID NO:1中的54，57，70，83，84，86，93-96，102，107，137，139，165，172，184-186，209，212，214，215，219，220，224，260，262，264，266，299，318，320，321，323，325，327，349，351，353和/或356。优选地，所述天冬酰胺酶包含至少一个下述取代：V54I，F57L，N70K，I83V，Q84D，L86P，M93L，L94K，N95D，V96L，V102D，V107I，A137I，V139I，I165L，S172A，L184Y，Q185N，S186A，V209G，F212R，A214V，S215T，A219T，N220T，T224A，N260K，T262D，I264L，R266K，S299N，N318G，P320V，I321V，A323R，T325S，T327V，A349Q，S351A，V353I和/或G356M。更优选地，所述天冬酰胺酶包含至少一个下述取代：V54I，F57L，N70K，I83V，Q84D，L86P，V102D，N260K，T262D，A323R，T327V，A349Q，S351A和/或V353I。最优选地，所述天冬酰胺酶包含至少一个，如至少两个，至少三个，至少四个或至少五个下述取代：N70K，A323R，T327V，A349Q，S351A和/或V353I。所述天冬酰胺酶可在高温下具有较高的相对天冬酰胺酶活性。
特别优选的天冬酰胺酶包含下述的取代组合：N70K+V54I+F57L，N70K+I83V+Q84D+A323R+T327V，N70K+I83V+Q84D+A323R+T327V+A349Q+S351A+V353I，N70K+L86P+V102D+A323R+T327V，N70K+V102D+A323R+T327V+A349Q+S351A+V353I，N70K+N260K+T262D，N70K+A323R+T327V，N70K+A323R+T327V+A349Q+S351A+V353I，和/或N70K+A349Q+S351A+V353I。
在一个实施方案中，天冬酰胺酶变体与SEQ ID NO:1具有至少70%序列同一性例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%，但少于100%的序列同一性。
在一个实施方案中，天冬酰胺酶变体与SEQ ID NO:2具有至少70%序列同一性例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%，但少于100%的序列同一性。
在一个实施方案中，天冬酰胺酶变体与SEQ ID NO:3具有至少70%序列同一性例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%，但少于100%的序列同一性。
在一个实施方案中，天冬酰胺酶变体与SEQ ID NO:4具有至少70%序列同一性例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%，但少于100%的序列同一性。
在一个实施方案中，天冬酰胺酶变体与SEQ ID NO:5具有至少70%序列同一性例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%，但少于100%的序列同一性。
在一个实施方案中，天冬酰胺酶变体与SEQ ID NO:6具有至少70%序列同一性例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%，但少于100%的序列同一性。
在一个实施方案中，天冬酰胺酶变体与SEQ ID NO:7具有至少70%序列同一性例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%，但少于100%的序列同一性。
天冬酰胺酶在其最具活性的形式可为四聚体。
在一个实施方案中，天冬酰胺酶以约100-10,000ASNU每kg干物质，更优选约250-8,000ASNU每kg干物质，更优选约500-7,500ASNU每kg干物 质，和最优选约1,000-5,000ASNU每kg干物质的量提供。
天冬酰胺酶单位(ASNU)定义为在37℃和pH7.0通过水解天冬酰胺生成1.0微摩尔的氨所需的酶的量。当确定活性时，天冬酰胺的浓度可为9.6mg/ml。
氨基酸氧化酶
氨基酸氧化酶，其属于酶分类EC1.4.3.2和EC1.4.3.3，是催化见于自然界的氨基酸脱氨成为相应的酮酸的氧还酶。可使用来自真菌、细菌或植物来源的氨基酸氧化酶。所述氨基酸氧化酶可例如来源于Bothrops atrox，混浊红球菌(Rhodococcus opacus)，哈茨木霉(Trichoderma harzianum)，Trigonopsis variabilis，或其它生物。
在另一个实施方案中，所述氨基酸氧化酶与SEQ ID NO:8，Bothrops atrox氨基酸氧化酶具有至少70%的序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性。在另一个实施方案中，氨基酸氧化酶包含或组成为SEQ ID NO:8的序列；或是SEQ ID NO:8具有氨基酸氧化酶活性的片段。
在另一个实施方案中，所述氨基酸氧化酶与SEQ ID NO:9，哈茨木霉氨基酸氧化酶具有至少70%的序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性。在另一个实施方案中，氨基酸氧化酶包含或组成为SEQ ID NO:9的序列；或是SEQ ID NO:9具有氨基酸氧化酶活性的片段。
在另一个实施方案中，所述氨基酸氧化酶与SEQ ID NO:10，Trigonopsis variabilis氨基酸氧化酶具有至少70%的序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性。在另一个实施方案中，氨基酸氧化酶包含或组成为SEQ ID NO:10的序列；或是SEQ ID NO:10具有氨基酸氧化酶活性的片段。
在另一个实施方案中，所述氨基酸氧化酶与SEQ ID NO:11，混浊红球菌氨基酸氧化酶具有至少70%的序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性。在另一个实施方 案中，氨基酸氧化酶包含或组成为SEQ ID NO:11的序列；或是SEQ ID NO:11具有氨基酸氧化酶活性的片段。
在另一个实施方案中，所述氨基酸氧化酶与SEQ ID NO:12，构巢曲霉氨基酸氧化酶具有至少70%的序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性。在另一个实施方案中，氨基酸氧化酶包含或组成为SEQ ID NO:12的序列；或是SEQ ID NO:12具有氨基酸氧化酶活性的片段。
在另一个实施方案中，所述氨基酸氧化酶与SEQ ID NO:13，Streptococcus oligofermentans氨基酸氧化酶具有至少70%的序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性。在另一个实施方案中，氨基酸氧化酶包含或组成为SEQ ID NO:13的序列；或是SEQ ID NO:13具有氨基酸氧化酶活性的片段。
在另一个实施方案中，所述氨基酸氧化酶与SEQ ID NO:14，粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)氨基酸氧化酶具有至少70%的序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性。在另一个实施方案中，氨基酸氧化酶包含或组成为SEQ ID NO:14的序列；或是SEQ ID NO:14具有氨基酸氧化酶活性的片段。
根据本发明可用的氨基酸氧化酶可具有WO 94/25574；WO 2005/098000；EP 1205542；Alves等，2008，UniProt Database，登录号P0CC17；Davis等，2005，Appl.Environ.Microbiol.71(7):3551–3555；Tong等，2008，J.Bacteriol.190(13):4716-4721；Niedermann等，1990，J.Biol.Chem.265(28):17246-17251中公开的氨基酸序列；或与本文中公开的氨基酸氧化酶具有至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%同一性的氨基酸序列。
精氨酸酶
精氨酸酶(L-精氨酸氨基水解酶，EC3.5.3.1)是一组酶，其催化精氨酸水解为鸟氨酸和尿素。可使用来自真菌、细菌、植物或动物来源的精氨酸酶。
在一个实施方案中，所述精氨酸酶与SEQ ID NO:15，蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)精氨酸酶具有至少70%的序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性。在另一个实施方案中，精氨酸酶包含或组成为SEQ ID NO:15的序列；或是SEQ ID NO:15具有精氨酸酶活性的片段。
在另一个实施方案中，所述精氨酸酶与SEQ ID NO:16，来自番茄的精氨酸酶具有至少70%的序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性。在另一个实施方案中，精氨酸酶包含或组成为SEQ ID NO:16的序列；或是SEQ ID NO:16具有精氨酸酶活性的片段。
在另一个实施方案中，所述精氨酸酶与SEQ ID NO:17，来自蘑菇的精氨酸酶具有至少70%的序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性。在另一个实施方案中，精氨酸酶包含或组成为SEQ ID NO:17的序列；或是SEQ ID NO:17具有精氨酸酶活性的片段。
在另一个实施方案中，所述精氨酸酶与SEQ ID NO:18，来自猪的精氨酸酶具有至少70%的序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性。在另一个实施方案中，精氨酸酶包含或组成为SEQ ID NO:18的序列；或是SEQ ID NO:18具有精氨酸酶活性的片段。
在另一个实施方案中，所述精氨酸酶与SEQ ID NO:19具有至少70%的序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性。在另一个实施方案中，精氨酸酶包含或组成为SEQ ID NO:19的序列；或是SEQ ID NO:19具有精氨酸酶活性的片段。
根据本发明，精氨酸酶和天冬酰胺酶由于其类似的作用模式为等价的酶。两种酶(即精氨酸酶和天冬酰胺酶)作用于类似氨基酸的含氮侧链，并释放含氮化合物，即分别释放尿素(CO(NH2)2)和氨(NH3)。
α-淀粉酶
根据本发明，可使用任何α-淀粉酶，如真菌、细菌或植物来源的α-淀粉酶。在一个优选实施方案中，所述α-淀粉酶是酸性α-淀粉酶，例如酸性真菌或酸性细菌α-淀粉酶。术语“酸性α-淀粉酶”意指以有效量添加时在3至7，优选3.5至6，或更优选4-5的范围内的pH具有最佳活性的α-淀粉酶(EC3.2.1.1)。
细菌α-淀粉酶
用于本发明的α-淀粉酶可为细菌α-淀粉酶，例如来源于芽孢杆菌属(Bacillus)的α-淀粉酶。在一个优选实施方案中，所述芽孢杆菌属α-淀粉酶来源于解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)，地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)，嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)或枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的菌株，但也可来源于其它芽孢杆菌属菌种。
α-淀粉酶的特定实例包括WO 99/19467的SEQ ID NO:5的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶，WO 99/19467的SEQ ID NO:4的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶，和WO 99/19467的SEQ ID NO:3的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(所有序列通过提述并入本文)。在一个实施方案中，所述α-淀粉酶可为分别与示于WO 99/19467的SEQ ID NOS:3、4或5中的任何序列具有至少60%，例如至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度的酶。
所述芽孢杆菌属α-淀粉酶也可为变体和/或杂合体，特别是WO 96/23873、WO 96/23874、WO 97/41213、WO 99/19467、WO 00/60059和WO 02/10355(所有文件通过提述并入本文)中描述的变体和/或杂合体。具体α-淀粉酶变体公开于美国专利号6,093,562、6,187,576或美国专利号6,297,038(通过提述并入本文)，并包括在位置R179到G182具有一个或两个氨基酸缺失的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(BSGα-淀粉酶)变体，优选WO 96/23873公开的双缺失-参见，例如，第20页第1-10行(通过提述并入本文)，优选与WO 99/19467公开的SEQ ID NO:3所列的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的氨基酸序列相比对应于Δ(181-182)，或使用WO 99/19467中的SEQ ID NO:3的编号方式缺失氨基酸R179和G180(所述文献通过提述并入本文)。甚至更优选的是芽孢杆菌属α-淀粉酶，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，其与WO 99/19467公开的SEQ ID NO:3所列的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比具有对应于Δ(181-182)的双缺失，且进一步包括N193F取代(也表示为I181*+G182*+N193F)。
细菌杂合体α-淀粉酶
所述α-淀粉酶可为杂合体α-淀粉酶，例如，包括地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(示于WO1999/19467的SEQ ID NO:4)的445个C-末端氨基酸残基，以及源自解淀粉芽孢杆菌的α淀粉酶(示于WO 99/19467的SEQ ID NO:5)的37个N-末端氨基酸残基，并具有下列取代中的一个或多个，特别是全部的α-淀粉酶：G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(使用WO 99/19467的SEQ ID NO:4中地衣芽孢杆菌编号方式)。也优选具有一个或多个下述突变的变体(或在其它芽孢杆菌属α-淀粉酶中的对应突变)：H154Y，A181T，N190F，A209V和Q264S和/或位置176和179之间两个残基的缺失，优选E178和G179的缺失(关于编号方式，使用WO 99/19467的SEQ ID NO:5)。
在一个实施方案中，所述细菌α-淀粉酶以0.0005-5KNU每g DS(干固体)，优选0.001-1KNU每g DS，如大约0.050KNU每g DS的量剂量添加。
真菌α-淀粉酶
真菌α-淀粉酶包括源自曲霉属菌株的α-淀粉酶，如川地曲霉(Aspergillus kawachii)，黑曲霉(Aspergillus niger)和米曲霉(Aspergillus oryzae)α-淀粉酶。
优选的酸性真菌α-淀粉酶为下述的α-淀粉酶，其与WO96/23874的SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列的成熟部分显示高同一性，即，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或甚至100%的同一性。
另一个优选的酸性α-淀粉酶源自黑曲霉的菌株。在一个优选实施方案中，所述酸性真菌α-淀粉酶是黑曲霉α-淀粉酶，其作为“AMYA_ASPNG”以原始登录号P56271公开于Swiss-prot/TeEMBL数据库中，并描述于WO 89/01969(实施例3，其通过提述并入本文)。源自黑曲霉的商业上可得到的酸性真菌α-淀粉酶是SP288(可由Novozymes A/S,Denmark得到)。
其它野生型α-淀粉酶包括源自多孔菌属(Meripilus)和根毛霉属(Rhizomucor)的菌株，优选巨多孔菌(Meripilus giganteus)或微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)(WO 2004/055178，其通过提述并入本文)的菌株的那些α-淀粉酶。
在一个优选实施方案中，所述α-淀粉酶源自川地曲霉(Kaneko等1996,J.Ferment.Bioeng.81:292-298“Molecular-cloning and determination of the nucleotide-sequence of a gene encoding an acid-stableα-amylase from Aspergillus kawachii”，并进一步为EMBL:#AB008370)。
所述真菌α-淀粉酶也可为包括淀粉结合域(SBD)和α-淀粉酶催化域的野生型酶或其变体。
真菌杂合体α-淀粉酶
在一个优选实施方案中，所述真菌酸性α-淀粉酶为杂合体α-淀粉酶。真菌杂合体α-淀粉酶的实例包括WO 2005/003311或美国专利申请公开号2005/0054071(Novozymes)和WO 2006/069290(Novozymes)中公开的那些，所述文件通过提述并入本文。杂合体α-淀粉酶可包含α-淀粉酶催化域(CD)和糖结合域/模块(CBM)，如淀粉结合域(SBD)，以及任选的接头。
杂合体α-淀粉酶的实例包括WO 2006/069290实施例中的表1到5中公开的那些，包括具有催化域JA118和罗耳阿太菌(Athelia rolfsii)SBD的变体(WO 2006/069290中的SEQ ID NO:100)，具有罗耳阿太菌AMG接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶(WO 2006/069290中的SEQ ID NO:101)，具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶(其作为美国申请号11/316,535中氨基酸序列SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:96的组合公开于表5)，或WO2006/069290中表5中作为V039的α-淀粉酶，和具有罗耳阿太菌葡糖淀粉酶接头和SBD的巨多孔菌α-淀粉酶(WO 2006/069290中的SEQ ID NO:102)。其它杂合体α-淀粉酶列于美国申请号11/316,535和WO 2006/069290(其通过提述并入本文)实施例4中表3、4、5和6中。
杂合体α-淀粉酶的其它实例包括美国专利申请公开号2005/0054071中公开的那些，包括第15页表3公开的那些，如具有川地曲霉接头和淀粉结合域的黑曲霉α-淀粉酶。
其它α-淀粉酶与任何上面提及的α-淀粉酶显示高序列同一性程度，即，与上述公开的成熟酶序列显示至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或甚至100%同一性。
酸性α-淀粉酶可根据本发明以0.001至10AFAU/g DS，优选0.01至5AFAU/g DS，特别是0.3至2AFAU/g DS，或0.001至1FAU-F/g DS，优选0.01至1FAU-F/g DS的量添加。
商业性α-淀粉酶产品
优选的包含α-淀粉酶的商业组合物包括MYCOLASETM(DSM)，BANTM，TERMAMYLTMSC，FUNGAMYLTM，LIQUOZYMETMX，LIQUOZYMETM SC和SANTM SUPER，SANTM EXTRA L(Novozymes A/S)和CLARASETM L-40,000，DEX-LOTM，SPEZYMETM FRED，SPEZYMETM AA，SPEZYMETM ALPHA，SPEZYMETM DELTA AA，GC358，GC980，SPEZYMETM CL，以及SPEZYMETM RSL(Danisco A/S)，以及称作SP288的来自黑曲霉的酸性真菌α-淀粉酶(可从Novozymes A/S,Denmark获得)。
糖源生成酶(糖化酶)
术语“糖源生成酶”包括葡糖淀粉酶(葡萄糖生成者)，β-淀粉酶和产麦芽糖淀粉酶(均为麦芽糖生成者)以及α-葡糖苷酶、异淀粉酶和普鲁兰酶。糖源生成酶能够产生碳水化合物，其可由所述发酵生物用作能量源，例如，当用于本发明的产生发酵产物如乙醇的方法时。所产生的碳水化合物可直接或间接转化为期望的发酵产物，优选乙醇。根据本发明，可使用糖源生成酶的混合物。混合物包括包含至少葡糖淀粉酶和α-淀粉酶(特别是酸性淀粉酶，甚至更优选酸性真菌α-淀粉酶)的混合物。
在本发明的一个优选实施方案中，葡糖淀粉酶活性(AGU)和酸性真菌α-淀粉酶活性(FAU-F)之间的比例(即AGU每FAU-F)可为0.1至100AGU/FAU-F，特别是2-50AGU/FAU-F，如10-40AGU/FAU-F的范围，特别是当进行一步发酵(生淀粉水解-RSH)时，即当糖化和发酵同时进行(即无液化步骤)时。
在常规的淀粉至乙醇方法/工艺(即包括液化步骤)中，所述比例可优选如EP 140410中所定义，特别是当糖化和发酵同时进行时。
葡糖淀粉酶
所述葡糖淀粉酶可源自任何合适的来源，例如源自微生物或植物。优选的葡糖淀粉酶是真菌或细菌来源的，选自下组：曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等,1984,EMBO J.3(5):1097-1102)，或其变体，如WO 92/00381,WO 00/04136和WO 01/04273(来自Novozymes,Denmark)中公开的那些；WO 84/02921中公开的泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶，米曲霉葡糖淀粉酶(Hata等,1991,Agric.Biol.Chem.,55(4):941-949)，或它们的变体或片段。其它曲霉属葡糖淀粉酶变体包括具有增强的热稳定性的变体：G137A和G139A(Chen等,1996,Prot.Eng.9:499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等,1995,Prot.Eng.8,575-582)；N182(Chen等,1994,Biochem.J.301:275-281)；二硫键、A246C(Fierobe等,1996,Biochemistry,35:8698-8704)；以及在A435和S436位置导入Pro残基(Li等,1997,Protein Eng.10:1199-1204)。
其它的葡糖淀粉酶包括罗耳阿太菌(之前表示为罗耳伏革菌(Corticium rolfsii))葡糖淀粉酶(参见美国专利号4,727,026和Nagasaka等，1998,ApplMicrobiol Biotechnol.50:323-330)，踝节菌属(Talaromyces)葡糖淀粉酶，特别是源自杜邦踝节菌(Talaromyces duponti)、埃莫森踝节菌(Talaromyces emersonii)(WO 99/28448)、Talaromyces leycettanus(美国专利号Re.32,153)、嗜热踝节菌(Talaromyces thermophilus)(美国专利号4,587,215)。
细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属(Clostridium)，特别是热解淀粉梭菌(C.thermoamylolyticum)(EP135,138)和热硫化氢梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(WO 86/01831)，均在WO 2006/069289中公开的瓣环栓菌(Trametes cingulata)、纸质大纹饰孢菌(Pachykytospora papyracea)和大白桩菇(Leucopaxillus giganteus)，PCT/US2007/066618中公开的红边隔孢伏革菌(Peniophora rufomarginata)的葡糖淀粉酶；或其混合物。杂合体葡糖淀粉酶可用于本发明。所述杂合体葡糖淀粉酶的实例在WO 2005/045018中公开。具体实例包括实施例1的表1和4中公开的杂合体葡糖淀粉酶(该杂合体通过提述并入本文)。
所述葡糖淀粉酶，可与任何上面提及的葡糖淀粉酶显示高序列同一性程度，即，与上面提及的成熟酶序列显示至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或甚至100%的同一性。
商业上可得到的包含葡糖淀粉酶的组合物包括AMG200L；AMG300L；SANTM SUPER，SANTM EXTRA L，SPIRIZYMETM PLUS，SPIRIZYMETM FUEL，SPIRIZYMETM B4U，SPIRIZYME ULTRATM和AMGTM E(来自Novozymes A/S，Denmark)；OPTIDEXTM 300，GC480TM和GC147TM(来自Genencor Int.，USA)；AMIGASETM和AMIGASETM PLUS(来自DSM)；G-ZYMETMG900，G-ZYMETM和G990ZR(来自Genencor Int.)。
所述葡糖淀粉酶可以以0.02-20AGU/g DS，优选0.1-10AGU/g DS，特别是在1-5AGU/g DS，如0.1-2AGU/g DS，如0.5AGU/g DS的量，或以0.0001-20AGU/g DS，优选0.001-10AGU/g DS，特别是0.01-5AGU/g DS，如0.1-2AGU/gDS的量添加。
β-淀粉酶
β-淀粉酶(E.C3.2.1.2)为传统上给予外作用的(exo-acting)产麦芽糖淀粉酶的名称，其催化直链淀粉、支链淀粉以及相关的葡萄糖聚合物中1,4-α-葡糖苷 键的水解。自非还原的链末端以逐步的方式连续移除麦芽糖单元直至分子降解，或者，在支链淀粉的情况下，直至到达分枝点。释放的麦芽糖具有β异头物构象，由此得到β-淀粉酶的名称。
已经从多种植物和微生物中分离了β-淀粉酶(Fogarty和Kelly,1979,Progress in Industrial Microbiology,15,112-115)。这些β-淀粉酶的特征在于具有40℃到65℃的最适温度以及4.5到7的最适pH。来自大麦的商业上可得到的β-淀粉酶为来自Novozymes A/S,Denmark的NOVOZYMTM WBA和来自Genencor Int.,USA的SPEZYMETM BBA 1500。
产麦芽糖淀粉酶
淀粉酶也可为产麦芽糖α-淀粉酶(葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶，E.C.3.2.1.133)，其催化将直链淀粉和支链淀粉水解成α构象的麦芽糖。来自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB11837的产麦芽糖淀粉酶商业上可由Novozymes A/S得到。产麦芽糖的α-淀粉酶描述于美国专利号4,598,048，4,604,355和6,162,628，其通过提述并入本文。
所述产麦芽糖淀粉酶可以0.05-5mg总蛋白/克DS或0.05-5MANU/g DS的量添加。
肌醇六磷酸酶
任何肌醇六磷酸酶可用于本发明的方法。肌醇六磷酸酶是通过特异性水解肌醇和磷之间的酯键而降解肌醇六磷酸盐和/或肌醇六磷酸的酶。肌醇六磷酸酶活性取决于许多成分中磷和离子的可获得性。在一些实施方案中，肌醇六磷酸酶能够从肌醇六磷酸(例如植酸)释放至少一个无机磷酸。肌醇六磷酸酶可根据其对于植酸分子上起始水解处的磷酸酯基团的具体位置的偏好进行分组(例如3-肌醇六磷酸酶(EC3.1.3.8)或6-肌醇六磷酸酶(EC3.1.3.26))。肌醇六磷酸酶的实例是肌醇-六磷酸-3-磷酸水解酶(myo-inositol-hexakiphosphate-3-phosphohydrolase)。
肌醇六磷酸酶可从微生物如真菌或细菌生物获得。举例而言，所述肌醇六磷酸酶可从丝状真菌如曲霉属(例如无花果曲霉(A.ficuum)，烟曲霉，黑曲霉和土曲霉(A.terreus))，支胞属(Cladospirum)，毛霉属(Mucor)(例如梨形毛霉(Mucor piriformis))，毁丝霉属(Myceliophthora)(例如嗜热毁丝霉(M.thermophila))，青霉属(例如P.hordei(ATCC No.22053)，桧状青霉(P.piceum)(ATCC No.10519)，或短密青霉(P.brevi-compactum)(ATCC No.48944))，踝节菌属(Talaromyces)(例如 嗜热踝节菌(T.thermophilus))，嗜热霉属(Thermomyces)(WO 99/49740)和木霉属菌种(Trichoderma spp.)(例如里氏木霉(T.reesei))获得。
在一个实施方案中，所述肌醇六磷酸降解酶从酵母(例如Arxula adeninivorans、异常毕赤酵母(Pichia anomala)、西方许望酵母(Schwanniomyces occidentalis))，革兰氏阴性细菌(例如大肠杆菌、克雷伯氏菌属菌种(Klebsiella spp.)、假单胞菌属菌种(Pseudomonas spp.))，和革兰氏阳性细菌(例如芽孢杆菌属菌种如枯草芽孢杆菌)获得。
所述肌醇六磷酸酶亦可从柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、肠杆菌属(Enterbacter)或隔孢伏革菌属(Peniophora)获得。
在一个实施方案中，所述肌醇六磷酸酶来源于布丘氏菌属菌种(Buttiauxiella spp.)如乡间布丘氏菌(B.agrestis)、B.brennerae、B.ferragutiase、B.gaviniae、B.izardii、B.noackiae和B.warmboldiae。在一些实施方案中，所述肌醇六磷酸酶是WO 2006/043178或美国申请号11/714,487中公开的肌醇六磷酸酶。
在一个优选实施方案中，所述肌醇六磷酸酶与美国申请号No.12/263,886的SEQ ID NO:31中所示的氨基酸序列具有至少75%，至少80%，至少85%，至少88%，至少90%，至少93%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%和至少99%的序列同一性。
商业上可获得的肌醇六磷酸酶为NATUPHOS(BASF)，RONOZYME P(Novozymes A/S)，PHZYME(Danisco A/S,Diversa)和FINASE(AB Enzymes)。用于确定微生物肌醇六磷酸酶活性的方法和肌醇六磷酸酶单位的定义公开于Engelen等,1994,Journal of AOAC International77:760-764。所述肌醇六磷酸酶可为野生型肌醇六磷酸酶，其活性变体或活性片段。
普鲁兰酶
任何普鲁兰酶可用于本发明的方法。在一个实施方案中，所述普鲁兰酶为GH57普鲁兰酶，例如从热球菌属(Thermococcus)，包括热球菌属菌种AM4，热球菌属菌种HJ21，Thermococcus barophilus，Thermococcus gammatolerans，Thermococcus hydrothermalis；Thermococcus kodakarensis，Thermococcus litoralis；和Thermococcus onnurineus的菌株；或从火球菌属(Pyrococcus)，如深海火球菌(Pyrococcus abyssi)和激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)的菌株获得的普鲁兰酶。
蛋白酶
蛋白酶可在糖化、发酵或同时糖化和发酵过程中添加。所述蛋白酶可为任 何蛋白酶。在一个优选实施方案中，所述蛋白酶为微生物来源的酸性蛋白酶，优选真菌或细菌来源的。酸性真菌蛋白酶是优选的，但也可使用其它蛋白酶。
合适的蛋白酶包括微生物蛋白酶，如真菌和细菌蛋白酶。优选的蛋白酶为酸性蛋白酶，即，特征为能够在pH7以下的酸性条件下水解蛋白质的蛋白酶。
酸性真菌蛋白酶可来源于曲霉属、假丝酵母属、革盖菌属(Coriolus)、内座壳属(Endothia)、虫霉属(Enthomophtra)、耙齿菌属(Irpex)、毛霉属(Mucor)、青霉属(Penicillium)、根霉属(Rhizopus)、丝核菌属(Sclerotium)和球拟酵母属(Torulopsis)。具体而言，所述蛋白酶可来源于棘孢曲霉(WO 95/02044)，泡盛曲霉(Hayashida等,1977Agric.Biol.Chem.,42(5),927-933)，黑曲霉(参见，例如，Koaze等,1964,Agr.Biol.Chem.Japan,28,216)，斋藤曲霉(Aspergillus saitoi)(参见，例如，Yoshida,1954,J.Agr.Chem.Soc.Japan,28,66)或米曲霉，如pepA蛋白酶，以及来自米黑毛霉(Mucor miehei)和微小毛霉(Mucor pusillus)的酸性蛋白酶。
所述蛋白酶可为中性或碱性蛋白酶，如来源于芽孢杆菌属菌株的蛋白酶。具体蛋白酶来源于解淀粉芽孢杆菌，且具有在Swissprot可作为登录号P06832得到的序列。所述蛋白酶可与在Swissprot作为登录号P06832公开的氨基酸序列具有至少90%序列同一性，如至少92%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或特别是至少99%同一性。
所述蛋白酶可与WO 2003/048353中作为SEQ ID NO:1公开的氨基酸序列具有至少90%的同一性，如至少92%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或特别为至少99%同一性。
所述蛋白酶可为选自下组的木瓜蛋白酶样蛋白酶，如E.C.3.4.22.*(半胱氨酸蛋白酶)内的蛋白酶，如EC3.4.22.2(木瓜蛋白酶)、EC3.4.22.6(木瓜凝乳蛋白酶)、EC3.4.22.7(萝藦蛋白酶(asclepain))、EC3.4.22.14(猕猴桃蛋白酶(actinidain))、EC3.4.22.15(组织蛋白酶L)、EC3.4.22.25(甘氨酰内肽酶)和EC3.4.22.30(番木瓜蛋白酶(caricain))。
在一个实施方案中，所述蛋白酶来源于曲霉属，如米曲霉的菌株的蛋白酶制备物。在另一个实施例中，所述蛋白酶来源于根毛霉属，优选曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)的菌株。在另一个实施方案中，所述蛋白酶为蛋白酶制备物，优选来源于曲霉属(如米曲霉)的菌株的蛋白水解制备物以及来源于根毛霉属(优选曼赫根毛霉)的菌株的蛋白酶的混合物。
天冬氨酸蛋白酶描述于，例如，Handbook of Proteolytic Enzymes,A.J.Barrett, N.D.Rawlings和J.F.Woessner编,Academic Press,San Diego,1998,270章。天冬氨酸蛋白酶的实例包括，例如，Berka等,1990,Gene96:313；Berka等,1993,Gene125:195-198；以及Gomi等,1993,Biosci.Biotech.Biochem.57:1095-1100中公开的那些，其通过提述并入本文。
所述蛋白酶亦可为金属蛋白酶，其定义为选自下组的蛋白酶：
(a)属于EC3.4.24(金属内肽酶)；优选EC3.4.24.39(酸性金属蛋白酶)的蛋白酶；
(b)上述手册中属于M组的金属蛋白酶；
(c)尚未分配至宗族(clan)(命名：宗族MX)，或属于宗族MA，MB，MC，MD，ME，MF，MG，MH之一(如上述手册第989-991页定义)的金属蛋白酶；
(d)其它家族的金属蛋白酶(如上述手册第1448-1452页定义)；
(e)具有HEXXH基序的金属蛋白酶；
(f)具有HEFTH基序的金属蛋白酶；
(g)属于家族M3，M26，M27，M32，M34，M35，M36，M41，M43，或M47之一(如上述手册第1448-1452页定义)的金属蛋白酶；
(h)属于M28E家族的金属蛋白酶；和
(i)属于家族M35的金属蛋白酶(如上述手册第1492-1495页定义)。
在其它具体实施方案中，金属蛋白酶是其中对肽键的亲核攻击通过由二价金属阳离子活化的水分子介导的水解酶。二价阳离子的实例是锌、钴或锰离子。所述金属离子的位置可由氨基酸配体固定。配体的数量可为五个、四个、三个、两个、一个或零个。在一个具体实施方案中，该数量为两个或三个，优选三个。
对于本发明的方法中使用的金属蛋白酶的来源并无限制。在一个实施方案中，该金属蛋白酶归类为EC3.4.24，优选EC3.4.24.39。在一个实施方案中，所述金属蛋白酶是酸稳定性金属蛋白酶，例如真菌酸稳定性金属蛋白酶，如来源于嗜热子囊菌属的菌株，优选桔橙嗜热子囊菌的菌株，特别是桔橙嗜热子囊菌CGMCC No.0670的金属蛋白酶(归类为EC3.4.24.39)。在另一个实施方案中，所述金属蛋白酶来源于曲霉属的菌株，优选米曲霉的菌株。
在一个实施方案中，所述金属蛋白酶与WO 2010/008841的SEQ ID NO:1(桔橙嗜热子囊菌金属蛋白酶)的氨基酸-178至177，-159至177，或优选氨基酸1至177具有至少约80%，至少82%，至少85%，至少90%，至少95%，或至 少97%的序列同一性程度，并具有金属蛋白酶活性。在具体实施方案中，所述金属蛋白酶由与上面提及的SEQ ID NO:1具有同一性程度的氨基酸序列组成。
所述桔橙嗜热子囊菌金属蛋白酶是适用于本发明的方法的金属蛋白酶的优选实例。另一种金属蛋白酶来源于米曲霉，并包含WO 2003/048353中公开的SEQ ID NO:11的序列，或其氨基酸-23-353；-23-374；-23-397；1-353；1-374；1-397；177-353；177-374；或177-397，和WO 2003/048353中公开的SEQ ID NO:10。
另一种适用于本发明的方法的金属蛋白酶是包含WO 2010/008841的SEQ ID NO:5的米曲霉金属蛋白酶，或下述金属蛋白酶：其为分离的多肽，与SEQ ID NO:5具有至少80%，至少82%，至少85%，至少90%，至少95%，或至少97%的同一性程度，并具有金属蛋白酶活性。在具体实施方案中，所述金属蛋白酶组成为SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
在一个具体实施方案中，金属蛋白酶具有与桔橙嗜热子囊菌或米曲霉金属蛋白酶的氨基酸序列的氨基酸-178至177，-159至177，或+1至177相差四十个、三十五个、三十个、二十五个、二十个、或十五个氨基酸的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，金属蛋白酶具有与这些金属蛋白酶的氨基酸序列的氨基酸-178至177，-159至177，或+1至177相差十个、九个、八个、七个、六个或五个氨基酸，例如四个、三个、两个或一个氨基酸的氨基酸序列。
在具体实施方案中，所述金属蛋白酶a)包含如下或b)由如下组成：
i)WO 2010/008841的SEQ ID NO:1的氨基酸-178至177，-159至177，或+1至177的氨基酸序列；
ii)WO 2010/008841的SEQ ID NO:3的氨基酸-23-353，-23-374，-23-397，1-353，1-374，1-397，177-353，177-374，或177-397的氨基酸序列；
iii)WO 2010/008841的SEQ ID NO:5的氨基酸序列；或
i)，ii)，和iii)的序列具有蛋白酶活性的等位变体或片段。
WO 2010/008841的SEQ ID NO:1的氨基酸-178至177，-159至177，或+1至177，或WO 2010/008841的SEQ ID NO:3的氨基酸-23-353，-23-374，-23-397，1-353，1-374，1-397，177-353，177-374，或177-397的片段是从这些氨基酸序列的氨基和/或羧基端缺失一个或多个氨基酸的多肽。在一个实施方案中，片段含有至少75个氨基酸残基，或至少100个氨基酸残基，或至少125个氨基酸残基，或至少150个氨基酸残基，或至少160个氨基酸残基，或至少165个氨基酸残基，或至少170个氨基酸残基，或至少175个氨基酸残基。
在另一个实施方案中，所述金属蛋白酶与另一种蛋白酶如真菌蛋白酶，优选酸性真菌蛋白酶组合。
商业上可得到的产品包括ALCALASE
所述蛋白酶可以以0.0001-1mg酶蛋白每克DS，优选0.001到0.1mg酶蛋白每克DS的量存在。或者，所述蛋白酶可以0.0001到1LAPU/g DS，优选0.001到0.1LAPU/g DS和/或0.0001到1mAU-RH/g DS，优选0.001到0.1mAU-RH/g DS的量存在。
组合物
在该方面，本发明涉及组合物，其包含(a)天冬酰胺酶和/或氨基酸氧化酶，(b)葡糖淀粉酶和(c)α-淀粉酶。
在一个实施方案中，所述组合物进一步包含一种或多种其它糖酶，如α-淀粉酶。在一个优选实施方案中，所述α-淀粉酶是酸性α-淀粉酶或真菌α-淀粉酶，优选酸性真菌α-淀粉酶。
所述组合物可包含一种或多种糖源生成酶，如特别是葡糖淀粉酶，β-淀粉酶，产麦芽糖淀粉酶，普鲁兰酶，α-葡糖苷酶或其组合。
在另一个实施方案中，所述组合物包含一种或多种天冬酰胺酶和/或氨基酸氧化酶和一种或多种发酵生物如酵母和/或细菌。发酵生物的实例可见于上文“发酵生物”部分。
用途
本发明亦涉及天冬酰胺酶和/或氨基酸氧化酶在发酵方法中的用途。在一个实施方案中，天冬酰胺酶和/或氨基酸氧化酶用于改善发酵产物收率。在另一个实施方案中，天冬酰胺酶和/或氨基酸氧化酶用于增加发酵生物的生长。
修饰的发酵生物
本发明亦涉及用编码天冬酰胺酶和/或氨基酸氧化酶的多核苷酸转化的修饰的发酵生物，其中所述发酵生物能够在发酵条件下表达所述天冬酰胺酶和/或氨基酸氧化酶。
在一个优选实施方案中，所述发酵生物是微生物，如酵母或丝状真菌，或细菌。其它发酵生物的实例可见于“发酵生物”部分。
发酵生物可用编天冬酰胺酶和/或氨基酸氧化酶的基因使用本领域公知的技术进行转化。
本文中描述并要求保护的发明不限于本文中公开的具体实施方案的范围，因为这些实施方案旨在说明本发明的几个方面。意图将任何等同的实施方案包括在本发明的范围内。事实上，根据前文的描述，除了本文中说明和记载的修饰之外对本发明的各种修饰对于本领域技术人员会是显而易见的。意欲使这些修饰也落入所附权利要求的范围内。在冲突的情况下，以包含定义的本公开为准。
此处引用了多篇参考文献，将它们整体通过提述并入。
材料和方法
葡糖淀粉酶活性(AGU)
葡糖淀粉酶活性可以以葡糖淀粉酶单位(AGU)测量。Novo葡糖淀粉酶单位(AGU)定义为在37℃，pH4.3，底物：23.2mM麦芽糖，缓冲液：乙酸盐0.1M，反应时间5分钟的标准条件下每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶量。
可使用自动分析仪系统。将变旋酶(mutarotase)添加到葡萄糖脱氢酶试剂中，使得存在的任何α-D-葡萄糖转化为β-D-葡萄糖。葡萄糖脱氢酶特异性地与β-D-葡萄糖在上述反应中反应，形成NADH，其使用光度计在340nm处测定作为起始葡萄糖浓度的量度。
α-淀粉酶活性(KNU)
α-淀粉酶活性可使用马铃薯淀粉作为底物来确定。该方法基于酶对于改性马铃薯淀粉的降解，并通过将淀粉/酶溶液的样本与碘溶液混合来跟踪反应。起初，形成了蓝黑色(blackish blue)，但在淀粉降解过程中，蓝色越来越淡，并逐渐变为红棕色(reddish-brown)，将其和有色玻璃标准(colored glass standard)进行比较。
一个千Novoα-淀粉酶单位(KNU)定义为在标准条件下(即，在37℃+/-0.05；0.0003M Ca2+；以及pH5.6)糊精化5260mg的淀粉干物质Merck Amylum Solubile所需的酶量。
酸性α-淀粉酶活性(AFAU)
酸性α-淀粉酶的活性可以以AFAU(酸性真菌α-淀粉酶单位)或FAU-F测量。酸性α-淀粉酶的活性可以以AFAU(酸性真菌α-淀粉酶单位)测量，其相对于酶标准物来确定。一AFAU定义为在下面提及的标准条件下每小时降解5.260mg淀粉干物质的酶量。
酸性α-淀粉酶，其为内切α-淀粉酶(1,4-α-D-葡聚糖-葡聚糖水解酶，EC3.2.1.1)水解淀粉分子内部区域中的α-1,4-葡糖苷键以形成具有不同链长的寡糖和糊精。与碘形成的颜色的强度与淀粉浓度成正比。使用反向比色法(reverse colorimetry)在规定的分析条件下测定淀粉浓度的降低作为淀粉酶活性。
α-淀粉酶
淀粉+碘→糊精+寡糖
40℃，pH2.5
蓝色/紫色 T=23秒脱色
标准条件/反应条件：
FAU-F的确定
FAU-F真菌α-淀粉酶单位(Fungamyl)是相对于已声明强度的酶标样测量的。
蛋白酶测定方法AU(RH)
蛋白分解活性可用变性的血红蛋白作为底物来确定。在用于确定蛋白分解活性的Anson-Hemoglobin方法中，消化变性的血红蛋白，然后将未消化的血红蛋白用三氯乙酸(TCA)沉淀。用酚试剂确定TCA可溶性产物的量，所述酚试剂遇到酪氨酸和色氨酸呈蓝色。
一Anson单位(AU-RH)定义为在标准条件下(即，25℃，pH5.5和10分钟反应时间)以使得每分钟释放的TCA可溶产物量与一毫当量的酪氨酸遇到酚试剂给出相同的颜色的起始速率消化血红蛋白。
AU(RH)方法描述于EAL-SM-0350，并可应要求从Novozymes A/S Denmark获得。
蛋白酶测定方法(LAPU)
一亮氨酸氨基肽酶单位(LAPU)是在下述条件下每分钟分解1微摩尔底物的酶量：26mM的L-亮氨酸对硝基苯胺作为底物，0.1M Tris缓冲液(pH8.0)，37℃，10分钟反应时间。
LAPU描述于EB-SM-0298.02/01，其可应要求从Novozymes A/S Denmark获得。
产麦芽糖淀粉酶活性(MANU)
一MANU(产麦芽糖淀粉酶Novo单位，Maltogenic Amylase Novo Unit)为在37℃，在每ml的0.1M柠檬酸盐缓冲液，pH5.0中10mg麦芽三糖(Sigma M8378)底物的浓度反应30分钟，每分钟释放一微摩尔麦芽糖所需的酶量。
天冬酰胺酶活性
储液
50mM Tris缓冲液，pH8.6
189mM L-天冬酰胺溶液
1.5M三氯乙酸(TCA)
Nessler试剂，Aldrich Stock No.34,514-8(Sigma-Aldrich,St.Louis,Mo.USA)
天冬酰胺酶，Sigma Stock No.A4887(Sigma-Aldrich,St.Louis,Mo.USA)
测定法
酶反应：
将
500微升缓冲液
100微升L-天冬酰胺酶溶液
350微升水
混合并平衡至37℃。
添加100微升的酶溶液，并将反应在37℃温育30分钟。
将反应通过置于冰上并添加50微升的1.5M TCA来终止。
将样品混合并在20,000x g离心2分钟
游离氨的测量
将50微升的酶反应物与100微升的水和50微升的Nessler试剂相混合。将反应物混合并在1分钟之后测量在436nm的吸光度。
实施例
实施例1：在同时糖化和发酵方法/工艺中使用天冬酰胺酶或氨基酸氧化酶
将玉米粉(corn flour)与自来水在水浴中混合以获得30-32%的总固体浓度。将玉米浆料混合良好以避免当温度提升至50℃时生面团球(dough ball)的形成。一旦将玉米浆料加热至50℃，将天冬酰胺酶(500ppm ACRYLAWAY
Maillard产物的检测
为了检测天冬酰胺酶和氨基酸氧化酶减少Maillard产物的有效性，在液化终止时收集样品。将这些样品以1942x g离心20分钟。将上清转移至微离心管并在14560x g进一步离心10分钟。将上清通过0.45微米过滤器过滤，并将200微升的经过滤的上清移液入微滴定板的孔。荧光强度通过用360mm 波长激发样品，并将发射检测设在460nm来测量。荧光强度(FI)测量使用Safire型微滴定板读板器以软件XFLUOR4Version V4.50(Tecan Co.)进行。将样品用蒸馏水稀释以在测量发射之前获得在460nm的0.05至0.1的吸收。
对于每个样品测得的荧光强度提供于表1：
结果显示天冬酰胺酶或氨基酸氧化酶的使用显著减少了产生的Maillard产物的量。
在玉米发酵中的样品制备和乙醇的HLPC定量
将经冷却、液化的玉米浆料转移至发酵容器，并添加合适量的葡糖淀粉酶(SPIRIZYME FUEL
将样品用宽口移液管从发酵物移除，并将每个样品用10微升的40%硫酸溶液/5克样品酸化来停止发酵。将样品以1942x g离心10分钟以分离上清和固体。将样品通过0.45微米过滤器过滤，并使用加热至65℃、具有0.6ml/分钟的流速的5mM硫酸的流动相的HPX-787H柱(Bio-Rad)通过HPLC来分析十微升的经过滤的上清，而折射率检测在50℃进行。
在每个发酵方法/工艺中获得的乙醇的量提供于表2：
表2
结果显示与仅用LIQUOZYME SCDS
在50ppm ACRYLAWAAY
Maillard产物的检测
将糖蜜样品用蒸馏水稀释至20Brix。将过滤的糖蜜样品通过0.45微米过滤器过滤，并将200微升的过滤的糖蜜移液入微滴定板的孔。荧光强度通过用360nm波长激发样品，并将发射检测设在460nm来测量。荧光强度(FI)测量使用TECAN Safire型微滴定板读板器以软件XFLUOR4Version V4.50进行。将样品用蒸馏水稀释以在测量发射之前获得在460nm的0.05至0.1的吸光度。
在所有筛选的糖蜜样品中检测出高水平的Maillard产物。
甘蔗汁发酵
将来自工业方法/工艺中的不同步骤的甘蔗汁(粗汁液、用于糖产生的澄清的汁液，和用于乙醇产生的澄清的汁液)用50ppm ACRYLAWAY
在每个发酵方法/工艺中获得的乙醇的量提供于表3：
表3：
HPLC分析显示在每个用天冬酰胺酶处理的样品中实现了增加的乙醇产量。
本发明在下述编号段落中进一步描述：
[1]一种产生发酵产物的方法/工艺，其包括：
(a)在氨基酸氧化酶、精氨酸酶和/或天冬酰胺酶的存在下用α-淀粉酶将含淀粉材料液化为糊精；
(b)用糖化酶将糊精糖化为糖；和
(c)使用发酵生物发酵糖以产生发酵产物。
[2]段[1]的方法/工艺，其中在天冬酰胺酶存在下将所述含淀粉材料液化为糊精。
[3]段[2]的方法/工艺，其中所述天冬酰胺酶是EC3.5.1.1的酶。
[4]段[2]的方法/工艺，其中所述天冬酰胺酶是EC3.5.1.38的酶。
[5]段[1]-[4]任一项的方法/工艺，其中在精氨酸酶的存在下将所述含淀粉材料液化为糊精。
[6]段[1]-[5]任一项的方法/工艺，其中在氨基酸氧化酶的存在下将所述含淀粉材料液化为糊精。
[7]段[6]的方法/工艺，其中所述氨基酸氧化酶是EC1.4.3.2的酶。
[8]段[6]的方法/工艺，其中所述氨基酸氧化酶是EC1.4.3.3的酶。
[9]一种产生发酵产物的方法/工艺，其包括：
(a)用氨基酸氧化酶、精氨酸酶和/或天冬酰胺酶处理含淀粉材料；
(b)用α-淀粉酶将经处理的含淀粉材料液化为糊精；
(c)用糖化酶将糊精糖化为糖；和
(d)使用发酵生物发酵糖以产生发酵产物。
[10]段[9]的方法/工艺，其中用天冬酰胺酶在20-75℃，例如25-65℃或40-60℃的温度处理所述含淀粉材料。
[11]段[10]的方法/工艺，其中所述天冬酰胺酶是EC3.5.1.1的酶。
[12]段[10]的方法/工艺，其中所述天冬酰胺酶是EC3.5.1.38的酶。
[13]段[9]-[12]任一项的方法/工艺，其中用精氨酸酶在20-75℃，例如25-65℃或40-60℃的温度处理所述含淀粉材料。
[14]段[9]-[13]任一项的方法/工艺，其中用氨基酸氧化酶在20-75℃，例如25-65℃或40-60℃的温度处理所述含淀粉材料。
[15]段[14]的方法/工艺，其中所述氨基酸氧化酶是EC1.4.3.2的酶。
[16]段[14]的方法/工艺，其中所述氨基酸氧化酶是EC1.4.3.3的酶。
[17]段[1]-[16]任一项的方法/工艺，进一步包括回收所述发酵产物。
[18]一种产生糖的方法/工艺，其包括：
(a)在氨基酸氧化酶、精氨酸酶和/或天冬酰胺酶的存在下用α-淀粉酶将含淀粉材料液化为糊精；和
(b)用糖化酶将糊精糖化为糖。
[19]段[18]的方法/工艺，其中所述糖为麦芽糖。
[20]段[18]的方法/工艺，其中所述糖为葡萄糖。
[21]段[20]的方法/工艺，进一步包括将葡萄糖转化为果糖。
[22]段[18]-[21]任一项的方法/工艺，其中在天冬酰胺酶的存在下将所述含淀粉材料液化为糊精。
[23]段[22]的方法/工艺，其中所述天冬酰胺酶是EC3.5.1.1的酶。
[24]段[22]的方法/工艺，其中所述天冬酰胺酶是EC3.5.1.38的酶。
[25]段[18]-[24]任一项的方法/工艺，其中在精氨酸酶的存在下将所述含淀粉材料液化为糊精。
[26]段[18]-[25]任一项的方法/工艺，其中在氨基酸氧化酶的存在下将所述含淀粉材料液化为糊精。
[27]段[26]的方法/工艺，其中所述氨基酸氧化酶是EC1.4.3.2的酶。
[28]段[26]的方法/工艺，其中所述氨基酸氧化酶是EC1.4.3.3的酶。
[29]一种产生糖的方法/工艺，其包括：
(a)用氨基酸氧化酶、精氨酸酶和/或天冬酰胺酶处理含淀粉材料；
(b)用α-淀粉酶将经处理的含淀粉材料液化为糊精；和
(c)用糖化酶将糊精糖化为糖。
[30]段[29]的方法/工艺，其中所述糖为麦芽糖。
[31]段[29]的方法/工艺，其中所述糖为葡萄糖。
[32]段[31]的方法/工艺，进一步包括将葡萄糖转化为果糖。
[33]段[29]-[32]任一项的方法/工艺，其中用天冬酰胺酶在20-75℃，例如25-65℃或40-60℃的温度处理所述含淀粉材料。
[34]段[33]的方法/工艺，其中所述天冬酰胺酶是EC3.5.1.1的酶。
[35]段[33]的方法/工艺，其中所述天冬酰胺酶是EC3.5.1.38的酶。
[36]段[29]-[35]任一项的方法/工艺，其中用精氨酸酶在20-75℃，例如25-65℃或40-60℃的温度处理所述含淀粉材料。
[37]段[29]-[36]任一项的方法/工艺，其中用氨基酸氧化酶在20-75℃，例如25-65℃或40-60℃的温度处理所述含淀粉材料。
[38]段[37]的方法/工艺，其中所述氨基酸氧化酶是EC1.4.3.2的酶。
[39]段[37]的方法/工艺，其中所述氨基酸氧化酶是EC1.4.3.3的酶。
[40]段[18]-[39]任一项的方法/工艺，进一步包括回收所述糖。
[41]段[21]-[28]和[32]-[40]任一项的方法/工艺，进一步包括回收所述果糖。
[42]一种产生糊精的方法/工艺，其包括：
(a)在氨基酸氧化酶、精氨酸酶和/或天冬酰胺酶的存在下用α-淀粉酶将含淀粉材料液化为糊精。
[43]段[42]的方法/工艺，其中在天冬酰胺酶的存在下将所述含淀粉材料液化为糊精。
[44]段[43]的方法/工艺，其中所述天冬酰胺酶是EC3.5.1.1的酶。
[45]段[43]的方法/工艺，其中所述天冬酰胺酶是EC3.5.1.38的酶。
[46]段[42]-[45]任一项的方法/工艺，其中在精氨酸酶的存在下将所述含淀粉材料液化为糊精。
[47]段[42]-[46]任一项的方法/工艺，其中在氨基酸氧化酶的存在下将所述含淀粉材料液化为糊精。
[48]段[47]的方法/工艺，其中所述氨基酸氧化酶是EC1.4.3.2的酶。
[49]段[47]的方法/工艺，其中所述氨基酸氧化酶是EC1.4.3.3的酶。
[50]一种产生糊精的方法/工艺，其包括：:
(a)用氨基酸氧化酶、精氨酸酶和/或天冬酰胺酶处理含淀粉材料；和
(b)用α-淀粉酶将经处理的含淀粉材料液化为糊精。
[51]段[50]的方法/工艺，其中用天冬酰胺酶在20-75℃，例如25-65℃或40-60℃的温度处理所述含淀粉材料。
[52]段[51]的方法/工艺，其中所述天冬酰胺酶是EC3.5.1.1的酶。
[53]段[51]的方法/工艺，其中所述天冬酰胺酶是EC3.5.1.38的酶。
[54]段[50]-[53]任一项的方法/工艺，其中用精氨酸酶在20-75℃，例如25-65℃或40-60℃的温度处理所述含淀粉材料。
[55]段[50]-[54]任一项的方法/工艺，其中用氨基酸氧化酶在20-75℃，例如25-65℃或40-60℃的温度处理所述含淀粉材料。
[56]段[55]的方法/工艺，其中所述氨基酸氧化酶是EC1.4.3.2的酶。
[57]段[55]的方法/工艺，其中所述氨基酸氧化酶是EC1.4.3.3的酶。
[58]段[42]-[57]任一项的方法/工艺，进一步包括回收所述糊精。
[59]段[1]-[58]任一项的方法/工艺，其中在65-110℃，例如80-100℃或80-90℃的温度将含淀粉材料液化为糊精。
[60]段[1]-[59]任一项的方法/工艺，其中所述液化包括在95-140℃的温度进行喷射蒸煮。
[61]段[1]-[41]和[59-60]任一项的方法/工艺，进一步包括在20至75℃，优选25至65℃的温度进行通常40至90分钟的预糖化。
[62]段[1]-[41]和[59]-[61]任一项的方法/工艺，其中所述糖化在20至75℃，优选25至65℃的范围的温度进行。
[63]段[1]-[41]和[59]-[62]任一项的方法/工艺，其中所述糖化酶是β-淀粉酶、葡糖淀粉酶或产麦芽糖α-淀粉酶。
[64]段[1]-[41]和[59]-[63]任一项的方法/工艺，其中用糖化酶和普鲁兰酶和/或异淀粉酶将所述糊精糖化为糖。
[65]段[1]-[41]和[59]-[64]任一项的方法/工艺，其中所述糖化和/或发酵在蛋白酶的存在下进行。
[66]段[1]-[41]和[59]-[65]任一项的方法/工艺，其中所述糖化和发酵同时进行。
[67]段[66]的方法/工艺，其中所述糖化和发酵在20-40℃的温度进行。
[68]段[1]-[67]任一项的方法/工艺，其中所述含淀粉材料选自下组：大麦、豆、木薯、谷类、玉米、买罗高粱、豌豆、马铃薯、稻、黑麦、西米、高粱、甘薯、树薯、小麦、和全谷粒，或其任意混合物。
[69]一种产生发酵产物的方法/工艺，其包括用α-淀粉酶将含淀粉材料转化为糊精；用葡糖淀粉酶将糊精糖化为糖；和在氨基酸氧化酶、精氨酸酶和/或天冬酰胺酶存在下在低于含淀粉材料的起始糊化温度的温度在单一步骤中使用发酵生物发酵糖。
[70]段[1]-[17]和[59]-[69]任一项的方法/工艺，其中所述发酵产物选自下组：醇(例如丁醇、乙醇、甲醇、1,3-丙二醇)；有机酸(例如乙酸、柠檬酸、衣康酸、葡糖酸、葡糖酸盐/酯、乳酸、琥珀酸、2,5-二酮-D-葡糖酸)，酮(例如丙酮)，氨基酸(例如谷氨酸)；气体(例如H2和CO2)，以及更复杂的化合物，包括，例如抗生素(例如青霉素和四环素)；酶；维生素(例如核黄素，B12，β-胡萝卜素)和激素。
[71]段[70]的方法/工艺，其中所述发酵产物是乙醇。
[72]段[1]-[17]和[59]-[71]任一项的方法/工艺，其中所述发酵生物是酵母。
[73]一种产生发酵产物的方法/工艺，其包括：
(a)用氨基酸氧化酶、精氨酸酶和/或天冬酰胺酶处理含氨基酸和可溶性糖的植物提取物；
(b)从所述经处理的植物提取物产生糖蜜；
(c)稀释所述糖蜜；和
(d)用发酵生物发酵所述稀释的糖蜜以产生发酵产物。
[74]段[73]的方法/工艺，其中用天冬酰胺酶处理所述植物提取物。
[75]段[74]的方法/工艺，其中所述天冬酰胺酶是EC3.5.1.1的酶。
[76]段[74]的方法/工艺，其中所述天冬酰胺酶是EC3.5.1.38的酶。
[77]段[73]-[76]任一项的方法/工艺，其中用精氨酸酶处理所述植物提取物。
[78]段[73]-[77]任一项的方法/工艺，其中用氨基酸氧化酶处理所述植物提取物。
[79]段[78]的方法/工艺，其中所述氨基酸氧化酶是EC1.4.3.2的酶。
[80]段[78]的方法/工艺，其中所述氨基酸氧化酶是EC1.4.3.3的酶。
[81]段[73]-[80]任一项的方法/工艺，其中所述植物提取物是粗甘蔗汁或澄清的甘蔗汁。
[82]段[73]-[81]任一项的方法/工艺，其中糖蜜的产生包括：
(x)澄清植物提取物；
(y)浓缩见于经澄清的植物提取物的糖(例如通过蒸发)以形成糖浆；和
(z)从糖浆结晶蔗糖以形成糖蜜。
[83]段[73]-[82]任一项的方法/工艺，其中步骤(a)发生在蒸发之前的任何时间。
[84]段[83]的方法/工艺，其中步骤(a)发生在汁液提取、粉碎、汁液回收和/或汁液澄清过程中。
[85]一种产生发酵产物的方法/工艺，其包括：
(a)用氨基酸氧化酶、精氨酸酶和/或天冬酰胺酶处理含氨基酸和可溶性糖的植物提取物；和
(b)用发酵生物发酵经处理的植物提取物以产生发酵产物。
[86]段[85]的方法/工艺，其中用天冬酰胺酶处理所述植物提取物。
[87]段[86]的方法/工艺，其中所述天冬酰胺酶是EC3.5.1.1的酶。
[88]段[86]的方法/工艺，其中所述天冬酰胺酶是EC3.5.1.38的酶。
[89]段[85]-[88]任一项的方法/工艺，其中用精氨酸酶处理所述植物提取物。
[90]段[85]-[89]任一项的方法/工艺，其中用氨基酸氧化酶处理所述植物提取物。
[91]段[90]的方法/工艺，其中所述氨基酸氧化酶是EC1.4.3.2的酶。
[92]段[90]的方法/工艺，其中所述氨基酸氧化酶是EC1.4.3.3的酶。
[93]段[85]-[92]任一项的方法/工艺，其中所述植物提取物是粗甘蔗汁或澄清的甘蔗汁。
[94]段[73]-[93]任一项的方法/工艺，进一步包括回收所述发酵产物。
[95]段[73]-[94]任一项的方法/工艺，其中所述发酵产物选自下组：醇(例如丁醇、乙醇、甲醇、1,3-丙二醇)；有机酸(例如乙酸、柠檬酸、衣康酸、葡糖酸、葡糖酸盐/酯、乳酸、琥珀酸、2,5-二酮-D-葡糖酸)，酮(例如丙酮)，氨基酸(例如谷氨酸)；气体(例如H2和CO2)，以及更复杂的化合物，包括，例如抗生素(例如青霉素和四环素)；酶；维生素(例如核黄素，B12，β-胡萝卜素)和激素。
[96]段[95]的方法/工艺，其中所述发酵产物是乙醇。
[97]段[73]-[96]任一项的方法/工艺，其中所述发酵生物是酵母。
[98]一种产生糖的方法/工艺，其包括：
(a)用氨基酸氧化酶、精氨酸酶和/或天冬酰胺酶处理含氨基酸和可溶性糖的植物提取物；和
(b)从植物提取物回收糖。
[99]段[98]的方法/工艺，其中所述糖是果糖、半乳糖、葡萄糖、麦芽糖或蔗糖。
[100]一种产生蔗糖的方法/工艺，其包括：
(a)用氨基酸氧化酶、精氨酸酶和/或天冬酰胺酶处理含氨基酸和可溶性糖的植物提取物；
(b)澄清所述植物提取物；
(c)浓缩见于澄清的植物提取物中的糖(例如通过蒸发)以形成含蔗糖的糖浆；
(d)从所述糖浆结晶蔗糖；和
(e)回收蔗糖。
[101]段[98]-[100]任一项的方法/工艺，其中用天冬酰胺酶处理所述植物提取物。
[102]段[101]的方法/工艺，其中所述天冬酰胺酶是EC3.5.1.1的酶。
[103]段[101]的方法/工艺，其中所述天冬酰胺酶是EC3.5.1.38的酶。
[104]段[98]-[103]任一项的方法/工艺，其中用精氨酸酶处理所述植物提取物。
[105]段[98]-[104]任一项的方法/工艺，其中用氨基酸氧化酶处理所述植物提取物。
[106]段[105]的方法/工艺，其中所述氨基酸氧化酶是EC1.4.3.2的酶。
[107]段[105]的方法/工艺，其中所述氨基酸氧化酶是EC1.4.3.3的酶。
[108]段[98]-[107]任一项的方法/工艺，其中所述植物提取物是粗甘蔗汁或澄清的甘蔗汁。
[109]段[98]-[108]任一项的方法/工艺，其中步骤(a)发生在蒸发之前的任何时间。
[110]段[109]的方法/工艺，其中步骤(a)发生在汁液提取、粉碎、汁液回收和/或汁液澄清过程中。
[111]段[98]-[110]任一项的方法/工艺，其中用天冬酰胺酶处理粗甘蔗汁。
[112]段[98]-[111]任一项的方法/工艺，其中用精氨酸酶处理粗甘蔗汁。
[113]段[98]-[112]任一项的方法/工艺，其中用氨基酸氧化酶处理粗甘蔗汁。
[114]段[98]-[113]任一项的方法/工艺，其中用天冬酰胺酶处理用于糖产生的澄清的甘蔗汁。
[115]段[98]-[114]任一项的方法/工艺，其中用精氨酸酶处理用于糖产生的澄清的甘蔗汁。
[116]段[98]-[115]任一项的方法/工艺，其中用氨基酸氧化酶处理用于糖产生的澄清的甘蔗汁。
[117]段[98]-[116]任一项的方法/工艺，其中用天冬酰胺酶处理用于乙醇产生的澄清的甘蔗汁。
[118]段任一项的方法/工艺[98]-[117]，其中用精氨酸酶处理用于乙醇产生的澄清的甘蔗汁。
[119]段任一项的方法/工艺[98]-[118]，其中用氨基酸氧化酶处理用于乙醇产生的澄清的甘蔗汁。
[120]段[73]-[119]任一项的方法/工艺，其中所述植物提取物可选自下组：甜高粱、糖甜菜、甘蔗，或其任意混合物。
[121]段[73]-[120]任一项的方法/工艺，其中在7.5-9例如8-9的pH澄清所述粗汁液以供糖和/或乙醇产生。
[122]段[1]-[121]任一项的方法/工艺，其中所述天冬酰胺酶
(a)与SEQ ID NO:1具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；或
(b)是SEQ ID NO:1具有天冬酰胺酶活性的片段。
[123]段[1]-[121]任一项的方法/工艺，其中所述天冬酰胺酶
(a)与SEQ ID NO:2具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；或
(b)是SEQ ID NO:2具有天冬酰胺酶活性的片段。
[124]段[1]-[121]任一项的方法/工艺，其中所述天冬酰胺酶
(a)与SEQ ID NO:3具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；或
(b)是SEQ ID NO:3具有天冬酰胺酶活性的片段。
[125]段[1]-[121]任一项的方法/工艺，其中所述天冬酰胺酶
(a)与SEQ ID NO:4具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；或
(b)是SEQ ID NO:4具有天冬酰胺酶活性的片段。
[126]段[1]-[121]任一项的方法/工艺，其中所述天冬酰胺酶
(a)与SEQ ID NO:5具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；或
(b)是SEQ ID NO:5具有天冬酰胺酶活性的片段。
[127]段[1]-[121]任一项的方法/工艺，其中所述天冬酰胺酶
(a)与SEQ ID NO:6具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；或
(b)是SEQ ID NO:6具有天冬酰胺酶活性的片段。
[128]段[1]-[121]任一项的方法/工艺，其中所述天冬酰胺酶
(a)与SEQ ID NO:7具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；或
(b)是SEQ ID NO:7具有天冬酰胺酶活性的片段。
[129]段[1]-[121]任一项的方法/工艺，其中所述天冬酰胺酶是热稳定性天冬酰胺酶。
[130]段[1]-[129]任一项的方法/工艺，其中所述氨基酸氧化酶
(a)与SEQ ID NO:8具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；或
(b)是SEQ ID NO:8具有氨基酸氧化酶的片段。
[131]段[1]-[129]任一项的方法/工艺，其中所述氨基酸氧化酶
(a)与SEQ ID NO:9具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；或
(b)是SEQ ID NO:9具有氨基酸氧化酶的片段。
[132]段[1]-[129]任一项的方法/工艺，其中所述氨基酸氧化酶
(a)与SEQ ID NO:10具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；或
(b)是SEQ ID NO:10具有氨基酸氧化酶的片段。
[133]段[1]-[129]任一项的方法/工艺，其中所述氨基酸氧化酶
(a)与SEQ ID NO:11具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；或
(b)是SEQ ID NO:11具有氨基酸氧化酶的片段。
[134]段[1]-[129]任一项的方法/工艺，其中所述氨基酸氧化酶
(a)与SEQ ID NO:12具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；或
(b)是SEQ ID NO:12具有氨基酸氧化酶的片段。
[135]段[1]-[129]任一项的方法/工艺，其中所述氨基酸氧化酶
(a)与SEQ ID NO:13具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；或
(b)是SEQ ID NO:13具有氨基酸氧化酶的片段。
[136]段[1]-[129]任一项的方法/工艺，其中所述氨基酸氧化酶
(a)与SEQ ID NO:14具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；或
(b)是SEQ ID NO:14具有氨基酸氧化酶的片段。
[137]段[1]-[129]任一项的方法/工艺，其中所述氨基酸氧化酶是热稳定性氨基酸氧化酶。
[138]段[1]-[137]任一项的方法/工艺，其中所述精氨酸酶
(a)与SEQ ID NO:15具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；或
(b)是SEQ ID NO:15具有氨基酸氧化酶的片段。
[139]段[1]-[137]任一项的方法/工艺，其中所述精氨酸酶
(a)与SEQ ID NO:16具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；或
(b)是SEQ ID NO:16具有氨基酸氧化酶的片段。
[140]段[1]-[137]任一项的方法/工艺，其中所述精氨酸酶
(a)与SEQ ID NO:17具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；或
(b)是SEQ ID NO:17具有氨基酸氧化酶的片段。
[141]段[1]-[137]任一项的方法/工艺，其中所述精氨酸酶
(a)与SEQ ID NO:18具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；或
(b)是SEQ ID NO:18具有氨基酸氧化酶的片段。
[142]段[1]-[137]任一项的方法/工艺，其中所述精氨酸酶
(a)与SEQ ID NO:19具有至少70%序列同一性，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；或
(b)是SEQ ID NO:19具有氨基酸氧化酶的片段。
[143]段[1]-[137]任一项的方法/工艺，其中所述氨基酸氧化酶是热稳定性精氨酸酶。
[144]一种组合物，其包含(a)天冬酰胺酶，精氨酸酶，和/或氨基酸氧化酶，(b)葡糖淀粉酶和(c)α-淀粉酶。
[145]段[144]的组合物，其包含天冬酰胺酶。
[146]段[145]的组合物，其包含EC3.5.1.1的天冬酰胺酶。
[147]段[145]的组合物，其包含EC3.5.1.38的天冬酰胺酶。
[148]段[144]-[147]的组合物，其包含精氨酸酶。
[149]段[144]-[148]的组合物，其包含氨基酸氧化酶。
[150]段[149]的组合物，其包含EC1.4.3.2的氨基酸氧化酶。
[151]段[149]的组合物，其包含EC1.4.3.3的氨基酸氧化酶。
[152]段[144]的组合物，其包含天冬酰胺酶，精氨酸酶，和氨基酸氧化酶。
[153]段[152]的组合物，其包含EC3.5.1.1的天冬酰胺酶。
[154]段[152]的组合物，其包含EC3.5.1.38的天冬酰胺酶。
[155]段[152]-[154]任一项的组合物，其包含EC1.4.3.2的氨基酸氧化酶。
[156]段[152]-[154]任一项的组合物，其包含EC1.4.3.3的氨基酸氧化酶。
[157]段[144]-[156]任一项的组合物，其进一步包含普鲁兰酶。
机译： 使用氨基酸氧化酶，精氨酸酶和/或天冬酰胺酶生产发酵产物的过程
机译： 存在氨基酸氧化酶，精氨酸酶和/或天冬酰胺酶的发酵产品的生产过程
机译： 存在氨基酸氧化酶，精氨酸酶和/或天冬酰胺酶的发酵产品的生产过程
