棉酚对新疆多浪羊淋巴细胞IL-18基因表达影响的研究方法

摘要

本发明涉及一种棉酚对新疆多浪羊淋巴细胞IL-18基因表达影响的研究方法，属于生物技术领域。其具体方法和步骤如下：(1)分离和培养淋巴细胞；(2)提取总RNA；(3)合成cDNA；(4)cDNA的纯化；(5)设计引物；(6)生成标准曲线；(7)根据2

说明书

技术领域

本发明涉及一种棉酚对新疆多浪羊淋巴细胞IL-18基因表达影响的研究方法，属于 生物技术领域。

背景技术

新疆多浪羊产于喀什地区麦盖提县，该羊具有体格大、生长发育快、产肉率高、繁 殖率高、遗传性稳定等特点，被广泛养殖于喀什和阿克苏各县市，是南疆畜牧业发展的 主要养殖家畜之一。

棉酚(gossypol)是通过棉花中倍半萜(十五碳)的法尼基焦磷酸环化后合成的次生代 谢产物，存在于锦葵科某些植物的根、茎、种子中，曾作为男性节育药为人们所熟知， 具有明显的诱导肿瘤细胞凋亡的能力，并能抑制细胞能量代谢导致细胞死亡。新疆是我 国主要棉产区，而南疆的广大牧民主要以棉副产品作为主要的饲料来源养殖绵羊，棉副 产品中含有的棉酚会对绵羊的健康产生一定程度的影响，当超过一定量会使绵羊中毒甚 至死亡，因而绵羊的棉酚中毒是亟待解决的问题。目前，解决绵羊棉酚中毒的问题大多 是从饲养的角度入手，减少绵羊对棉副产品中棉酚的摄入量来解决棉酚中毒问题。绵羊 对棉酚有一定的耐受现象，中毒后一段时间不摄入棉酚，绵羊的中毒症状会逐渐消失。 为何会出现此现象，未见有相关研究来揭示其机理。因而，该研究试图从免疫分子角度 来揭示绵羊棉酚中毒后逐渐康复的机理，试图从免疫学角度来解决绵羊棉酚中毒的问 题。

IL-18是通过NK细胞的活性发挥抗肿瘤作用，对细胞的损伤具有修复作用，能显 著刺激TH₁细胞产生干扰素，同时具有很强免疫调节作用。应用荧光定量PCR技术探 讨IL-18基因的mRNA表达量的变化，确定棉酚作用的最佳浓度和最佳作用时间，探讨 IL-18在绵羊棉酚损伤细胞中的变化规律，试图寻找免疫分子在解除多浪羊棉酚中毒方 面的作用。

发明内容

本发明通过对不同浓度的棉酚作用于新疆多浪羊淋巴细胞不同时间，应用荧光定 PCR技术，分析棉酚对新疆多浪羊淋巴细胞IL-18基因表达的影响，确定棉酚作用的最 佳浓度和最佳作用时间，探讨IL-18在绵羊棉酚损伤细胞中的变化规律，试图寻找免疫 分子在解除多浪羊棉酚中毒方面的作用，并以此作为解除棉酚对新疆多浪羊危害方面研 究的重要依据。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种棉酚对新疆多浪羊淋巴细胞IL-18基因表达影响的研究方法，具体方法和步骤 如下：

(1)分离和培养淋巴细胞：采集健康成年多浪羊新鲜抗凝血与Hank′s液等比例混 匀，然后加一定体积的人淋巴细胞分离液，以2000g／min的离心速度离心20min后， 得到淋巴细胞，然后将淋巴细胞悬浮于RPMI1640中混匀，分别于细胞培养瓶中加入棉 酚，使终浓度为(5μmol／L、10μmol／L、15μmol／L、20μmol／L、25μmol／L、30μmol／L、 35μmol／L)于37℃、CO₂培养箱(5％CO₂)中培养；

(2)提取总RNA：采用Trizol法提取多浪羊外周血淋巴细胞的总RNA。不同浓度、 不同时间棉酚作用的淋巴细胞培养液1mL／管分装，以2000g／min，离心15min中后弃 上清，加入1mLTrizol后充分混匀，室温静置5-10min裂解，然后加入200μL氯仿， 涡旋15s，静置2min，再以12000g离心15min，加500μL异丙醇，放在15-30℃ 的环境中孵育10min后，12000g离心10min，弃去上清，加入1mL的75％乙醇，涡 旋混匀，4℃，7500g离心5min，弃去上清液，室温或真空干燥5～10min，然后将RNA 溶于20μL的DEPC水中，55～60℃水浴10min，于-70℃保存，通过琼脂糖凝胶电泳 对所提取的总RNA进行检测，并用核酸测定仪测定其浓度和纯度；

(3)合成cDNA：将检测好的总RNA取出，放于冰盒中，去16μL总RNA为模 板，加入dNTP2μL，Oligod(T)2μL，混合后于65℃温浴5min后，置冰上2min， 瞬时离心10s，然后再依次加入5×Primerscript buffer8μL，RNAse Inhibitor1μL， Primerscript RTrase2μL，RNAsefree H₂O9μL，总计40μL的反应体系，放入42℃水 浴锅孵育45min，再放入70℃水浴锅，15min，保存于-20℃冰箱备用；

(4)cDNA的纯化：采用QIAquick PCR Purification Kit进行cDNA的纯化；

(5)设计引物：用引物设计软件oligo6.0对多浪羊IL-18基因进行引物设计，可 以同时用primier5.0引物设计软件对所设计引物的扩增效率进行分析，挑选最优引物。

(6)生成标准曲线：将纯化后的cDNA按原倍、2倍、4倍、8倍、16倍、32倍 的浓度梯度稀释，使用QuantiTect SYBR GEEN试剂(Qiagen)进行Real-time PCR(Real-time PCR仪-Light Cycler480)生成IL-18基因的标准曲线；以β-Actin基因作 为参照，对棉酚作用后多浪羊淋巴细胞中IL-18基因的表达量的变化；反应体系如下： QuantiTect SYBR GEEN Master10μL、H₂O6μL、上下游引物各1μL，cDNA2μL；

(7)根据2^-△△CT法分析棉酚作用后的IL-18基因的表达：根据2^-△△CT来确定棉酚 作用后的IL-18基因与未经棉酚作用的IL-18基因扩增曲线的差异及CT值的差异，确 定棉酚对多浪羊淋巴细胞的影响；

(8)分析研究不同浓度、不同时间棉酚作用后多浪羊淋巴细胞IL-18基因的表达量 变化：用EXCEL表格进行分析，确定在不同棉酚浓度和作用时间下，最高的表达量， 通过表达量来对比分析棉酚对多浪羊淋巴细胞IL-18基因表达的作用临界点。

该发明的有益效果在于：该发明通过分析研究棉酚对新疆多浪羊淋巴细胞IL-18基 因表达的影响，以此作为解除棉酚对新疆多浪羊危害方面研究的重要依据。

附图说明

图1为本发明实施例中IL-18基因的标准曲线。

图2为本发明实施例中IL-18基因的扩增曲线(用做标准曲线的样品的扩增曲线)。

图3为本发明实施例中IL-18基因的扩增曲线(所有样品结果)。

图4为本发明实施例中IL-18的溶解曲线(做标准曲线的稀释后结果)。

图5为本发明实施例中IL-18的溶解曲线(所有做标准曲线的稀释后结果)。

图6为本发明实施例中IL-18的溶解曲线(做标准曲线后的溶解曲线)。

图7为本发明实施例中IL-18的溶解曲线(所有做标准曲线后的溶解曲线的结果)。

图8为本发明实施例中β-Actin的标准曲线。

图9为本发明实施例中β-Actin的扩增曲线(用做标准曲线的样品的扩增曲线)。

图10为本发明实施例中β-Actin的扩增曲线(所有样品结果)。

图11为本发明实施例中β-Actin的溶解曲线(做标准曲线的稀释后结果)。

图12为本发明实施例中β-Actin的溶解曲线(做标准曲线后的溶解曲线)。

图13为本发明实施例中β-Actin的溶解曲线(所有做标准曲线的稀释后结果)。

图14为本发明实施例中5μmol／L棉酚作用后表达量变化图。

图15为本发明实施例中10μmol／L棉酚作用后表达量变化图。

图16为本发明实施例中15μmol／L棉酚作用后表达量变化图。

图17为本发明实施例中20μmol／L棉酚作用后表达量变化图。

图18为本发明实施例中25μmol／L棉酚作用后表达量变化图。

图19为本发明实施例中30μmol／L棉酚作用后表达量变化图。

图20为本发明实施例中35μmol／L棉酚作用后表达量变化图。

图21为本发明实施例中1h棉酚作用后表达量变化图。

图22为本发明实施例中2h棉酚作用后表达量变化图。

图23为本发明实施例中3h棉酚作用后表达量变化图。

图24为本发明实施例中4h棉酚作用后表达量变化图。

图25为本发明实施例中5h棉酚作用后表达量变化图。

具体实施方式

下面结合附图进一步阐述该发明的具体实施方式。

实施例

本实施例中，实验动物为新疆多浪羊，来源于塔里木大学动物科学学院试验站。 实验所需试剂有，RPMI-1640(Gibco31800-022)、青霉素(山西泰盛制药有限公司)、链 霉素(新泰生物有限公司)、3-5％的枸橼酸钠(实验室配置)、噻唑喃(四甲基偶氮唑 蓝，Volsen公司)、人淋巴细胞分离液(中国医学科学院生物工程研究所)、MTT(上海 源叶生物科技有限公司)、DMSO(Sigma公司)，PBS缓冲液(实验室配置)，质粒提取 试剂盒(promega公司)，SYBR Green Realtime PCR试剂盒(购自QIAGEN公司)。

本实施例中，所需仪器：电子天平(BS124S北京市赛凝胶多利斯仪器系统有限公司)； 超净工作台(SW-CJ-2F型上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；全自动摄影生物显微 (DP70+B10-olysLIA日本奥林巴斯)；电子万用炉(DL-1型北京永光明医疗仪器厂)；紫 外可见分光光度(Golds54型上海棱光技术有限公司)；PCR仪；电泳槽(DYCZ-28A北 京六一仪器厂)；电脑三恒多用电泳仪(DYY-60C型北京市六一仪器厂)；凝胶成像分 析系统(Tanon-4100上海天能科技有限公司)，移液器(德国Eppendorf公司)，Realtime PCR仪-Light Cycler480(Roche公司)。

本实施例的具体方法和步骤如下：

(1)分离和培养淋巴细胞：采集健康成年多浪羊新鲜抗凝血与Hank′s液等比例混 匀，然后加一定体积的人淋巴细胞分离液，以2000g／min的离心速度离心20min后， 得到淋巴细胞，然后将淋巴细胞悬浮于RPMI1640中混匀，分别于细胞培养瓶中加入棉 酚，使终浓度为(5μmol／L、10μmol／L、15μmol／L、20μmol／L、25μmol／L、30μmol／L、 35μmol／L)于37℃、CO₂培养箱(5％CO₂)中培养；

(2)提取总RNA：采用Trizol法提取多浪羊外周血淋巴细胞的总RNA。不同浓度、 不同时间棉酚作用的淋巴细胞培养液1mL／管分装，以2000g／min，离心15min后弃上 清，加入1mL Trizol后充分混匀，室温静置5-10min裂解，然后加入200μL氯仿， 涡旋15s，静置2min，再以12000g离心15min，加500μL异丙醇，放在15-30℃ 的环境中孵育10min后，12000g离心10min，弃去上清，加入1mL的75％乙醇，涡 旋混匀，4℃，7500g离心5min，弃去上清液，室温或真空干燥5～10min，然后将RNA 溶于20μL的DEPC水中，55℃～60℃水浴10min，于-70℃保存，通过琼脂糖凝胶电 泳对所提取的总RNA进行检测，并用核酸测定仪测定其浓度和纯度；

(3)合成cDNA：将检测好的总RNA取出，放于冰盒中，去16μL总RNA为模 板，加入dNTP2μL，Oligod(T)2μL，混合后于65℃温浴5min后，置冰上2min， 瞬时离心10s，然后再依次加入5×Primerscript buffer8μL，RNAse Inhibitor1μL， Primerscript RTrase2μL，RNAsefree H₂O9μL，总计40μL的反应体系，放入42℃水 浴锅孵育45min，再放入70℃水浴锅，15min，保存于-20℃冰箱备用；

(4)cDNA的纯化：采用QIAquick PCR Purification Kit进行cDNA的纯化。

(5)设计引物：用引物设计软件oligo6.0对多浪羊IL-18基因进行引物设计，可 以同时用primier5.0引物设计软件进行所设计引物的扩增效率的分析，挑选最优引物， 扩增β-Actin、IL-18基因片段引物见表1。

表1

(6)生成标准曲线：将纯化后的cDNA按原倍、2倍、4倍、8倍、16倍、32倍 的浓度梯度稀释，使用QuantiTect SYBR GEEN试剂(Qiagen)进行Real-time  PCR(Real-time PCR仪-Light Cycler480)生成IL-18基因的标准曲线。图1为IL-18基因 的标准曲线；图2，图3为IL-18基因的扩增曲线，图4、图5、图6、图7为IL-18基 因的溶解曲线；图8为β-Actin基因的标准曲线，图9、图10为β-Actin的扩增曲线， 图11、图12、图13为β-Actin的溶解曲线。

以β-Actin基因作为参照，反应体系如下：QuantiTect SYBR GEEN Master10μL、 H₂O6μL、上下游引物各1.0μL，扩增β-Actin、IL-18基因反应所需条件见表2。

表2

(7)根据2^-△△CT法分析棉酚作用后的IL-18基因的表达：根据2^-△△CT来确定棉酚 作用后的IL-18基因与未经棉酚作用的IL-18基因扩增曲线的差异及CT值的差异，确 定棉酚对多浪羊淋巴细胞的影响。2^-△△CT法IL-18表达量统计表见表3，2^-△△CT法IL-18 表达量分析结果见表4。

表3

表4

(8)分析研究不同浓度、不同时间下棉酚作用后表达量变化：用EXCEL表格进行 分析，确定在不同棉酚浓度和作用时间下，最高的表达量，通过表达量来对比分析棉 酚对多浪样淋巴细胞表达的作用临界点。在上述过程中，调整不同浓度，以研究棉酚 作用对IL-18基因表达量的影响。

图14为5μmol／L棉酚作用于多浪羊淋巴细胞IL-18表达量变化图。从图14可以 看出，1h-3h，IL-18基因的表达量呈现递增的趋势，在3h处IL-18基因的表达量为最 大值，3h-8h，IL-18基因的表达量开始呈现递减，尤其是到了4h以后，IL-18基因的 表达量递减的幅度较大，在8h处，IL-18基因的表达量很低，基本为不表达状态。

图15为10μmol／L棉酚作用于多浪羊淋巴细胞IL-18表达量变化图。从图15可以 看出，在10μmol／L棉酚的作用下，1h-3h，IL-18基因的表达量呈现递增的趋势，在 3h-8h，IL-18基因的表达量开始呈现递减，尤其是到了4h以后，IL-18基因的表达量 很低，但与5μmol／L棉酚作用相比，10μmol／L的棉酚作用后表达量出现了上升，要 明显大于5μmol／L时的表达量。

图16为15μmol／L棉酚作用于多浪羊淋巴细胞IL-18表达量变化图。从图16可 以看出，在15μmol／L棉酚的作用下1h-3h，IL-18基因的表达量呈现递增的趋势，在 3h-8h，IL-18基因的表达量开始呈现递减，4h以后，IL-18基因的表达量很低，但与 10μmol／L棉酚作用相比，15μmol／L的棉酚作用后于IL-18表达量出现了下降，但要 明显大于5μmol／L时的表达量。

图17为20μmol／L棉酚作用于多浪羊淋巴细胞IL-18表达量变化图。从图17可 以看出，在20μmol／L棉酚的作用下1h-3h，IL-18基因的表达量呈现递增的趋势，在 3h-8h，IL-18基因的表达量开始呈现递减，4h以后，IL-18基因的表达量达到最低点， 20μmol／L棉酚作用表达量要小于15μmol／L棉酚作用的表达量。

图18为25μmol／L棉酚作用于多浪羊淋巴细胞IL-18表达量变化图。从图18可 以看出，25μmol／L与20μmol／L的表达量变化情况大致一致，但25μmol／L的表达 量要小于20μmol／L的表达量。

图19为30μmol／L棉酚作用于多浪羊淋巴细胞IL-18表达量变化图。从图19可 以看出，30μmol／L与20μmol／L的表达量变化情况大致一致，但30μmol／L的表达 量要远远低于以上浓度的表达量。

图20为35μmol／L棉酚作用于多浪羊淋巴细胞IL-18表达量变化图。从图20可 以看出，35μmol／L的表达量变化情况在1h-3h的时间一致，也呈现递增的情况，在3h 以后，就出现了剧烈的递减情况，在8h的时候，基本为不表达的状态，表达量达到了 最低点。

图21为棉酚作用1h后多浪羊淋巴细胞IL-18表达量变化图。从图21可以看出， 在1h的作用时间内，10μmol／L时IL-18呈现最大值，在15μmol／L的时候，其表达 量要高于5μmol／L的时候，并不断下降，当到达25μmol／L的时候，表达量下降到 与5μmol／L的时候的表达量大致相等，并随着浓度的递增，表达量依旧呈现下降趋势。

图22为棉酚作用2h后多浪羊淋巴细胞IL-18表达量变化图。从图22可以看出， 当棉酚作用2h时，10μmol／L时IL-18的表达量和1h作用时间下IL-18的表达量一样， 也呈现最大值，当在15μmol／L的时候，其表达量要高于5μmol／L作用的表达量， 但从10μmol／L以后，表达量就呈现剧烈的下降趋势。

图23为棉酚作用3h后多浪羊淋巴细胞IL-18表达量变化图。从图23可以看出，3 h和2h棉酚作用的表达量相比较，3h棉酚作用的表达量要高于2h的表达量，同样， 在10μmol／L的棉酚作用的时候，IL-18基因的表达量达到最大值，10μmol／L以后， 表达量出现了迅速的下降，在35μmol／L的时候，表达量达到最低点。

图24为棉酚作用4h后多浪羊淋巴细胞IL-18表达量变化图。从图24可以看出， 4h和3h的棉酚作用相比，表达量要明显的低于3h的表达量，但是4h的棉酚作用后 的淋巴细胞同样是在10μmol／L的棉酚浓度作用的时间，IL-18基因的表达量达到最大 值，10μmol／L以后，表达量出现迅速下降，在35μmol／L的时候，表达量达到最低 点。

图25为棉酚作用5h后多浪羊淋巴细胞IL-18的表达量变化图。从图25可以看出， 棉酚作用5h后的淋巴细胞在10μmol／L的棉酚浓度达到最大值，棉酚浓度大于10μ mol／L时，IL-18的表达量出现迅速下降，在35μmol／L时，IL-18的表达量达到最低点。

从以上实施例中可以得出下列结论：

在10μmol／L棉酚的作用下，1h-3h，IL-18基因的表达量呈现递增的趋势，在 3h-8h，IL-18基因的表达量开始呈现递减，尤其是到了4h以后，IL-18基因的表达量 很低，但与5μmol／L棉酚作用相比，10μmol／L的棉酚作用后IL-18基因的表达量出 现了上升，要明显大于5μmol／L时的表达量。

在15μmol／L棉酚的作用下，1h-3h里，IL-18基因的表达量呈现递增的趋势， 在3h8h，IL-18基因的表达量开始呈现递减，4h以后，IL-18基因的表达量很低，但 与10μmol／L棉酚作用相比，15μmol／L的棉酚作用后IL-18基因的表达量出现了下 降，但要明显大于5μmol／L时的表达量。

在20μmol／L棉酚的作用下，1h-3h里，IL-18基因的表达量呈现递增的趋势， 在3h-8h，IL-18基因的表达量开始呈现递减，4h以后，IL-18基因的表达量达到最低 点，20μmol／L棉酚作用后IL-18的表达量要小于15μmol／L棉酚作用后IL-18的表达 量。

25μmol／L与20μmol／L使用后IL-18的表达量变化情况大致一致，但25 μmol／L使用后IL-18的表达量要小于20μmol／L的表达量。

30μmol／L与20μmol／L使用后IL-18的表达量变化情况大致一致，但30 μmol／L使用后IL-18的表达量要远远低于以上浓度的表达量。

35μmol／L使用后IL-18的表达量变化情况在1h-3h的时间一致，也呈现递增的 情况，在3h以后，就出现了剧烈的递减情况，在8h的时候，基本为不表达的状态， 表达量达到了最低点。

在1h的作用时间内，随着浓度的递增，多浪羊淋巴细胞IL-18的表达量依旧呈现 下降趋势。10μmol／L时多浪羊淋巴细胞IL-18的表达量呈现最大值，在15μmol／L 作用时IL-18表达量要高于5μmol／L IL-18的表达量，但低于10μmol／L时IL-18的 表达量，当棉酚浓度为25μmol／L时IL-18表达量与5μmol的时候的表达量大致相等。

当棉酚作用多浪羊淋巴细胞2h时，l0μmol／L时IL-18的表达量呈现最大值，当 在棉酚浓度为15μmol时，IL-18的表达量要高于5μmol／L时IL-18的表达量，但从 10μmol／L以后，IL-18的表达量就呈现剧烈的下降趋势。

棉酚作用于多浪羊淋巴细胞，3h和2h的IL-18的表达量相比较，棉酚作用3h 后IL-18表达量要高于2h的表达量，同样，在棉酚浓度为10μmol／L时，IL-18基因 的表达量达到最大值，10μmol／L以后，IL-18的表达量出现了迅速的下降，在35 μmol／L的时候，IL-18的表达量达到最低点。

棉酚作用于多浪羊淋巴细胞4h和3h的IL-18的表达量相比较，4h作用后IL-18 的表达量要明显的低于3h的表达量，但是在棉酚浓度为10μmol／L作用于淋巴细胞4 h时，IL-18基因的表达量达到最大值，10μmol／L以后，表达量出现迅速下降，在35 μmol／L的时候，表达量达到最低点。

棉酚作用于多浪羊淋巴细胞5h时IL-18的表达量变化，在棉酚浓度为10μmol／L 时IL-18基因的表达量达到最大值，10μmol／L以后，表达量出现迅速下降，在35 μmol／L的时候，表达量达到最低点。

总之，棉酚的浓度为15μmol／L时多浪羊淋巴细胞IL-18的表达量达到最大值， 随后出现递减，而在同一浓度不同时间的作用下，IL-18基因的表达量则在3h的表达量 达到最大值。当棉酚作用超过3h者是棉酚浓度为30μmol／L时，IL-18基本不表达。 在不同的时间作用下，多浪羊淋巴细胞IL-18的表达量呈现如下规律：1h-3h时IL-18 基因的表达量呈现递增的趋势，在3h时IL-18基因的表达量为最大值，3h-8h时IL-18 基因的表达量开始呈现递减，尤其是到了4h以后，IL-18基因的表达量递减的幅度较大， 棉酚作用8h时，IL-18基因处于基本为不表达状态。