一种快速分析啤酒半成品总联二酮含量的方法

摘要

本发明公开了一种快速分析啤酒半成品总联二酮含量的方法，包括步骤：1）一定浓度的过氧化物溶液的配制；2）蒸馏前添加一定体积、一定浓度的过氧化物溶液于样品中；3）样品采取直接加热蒸馏的方式，整个蒸馏约6分钟完成；4）蒸馏前添加一定体积、一定浓度的盐酸溶液至25ml馏液收集容量瓶，馏液定容至满刻度时PH约为1.2，使联二酮与邻苯二胺完全反应生成2,3-二甲基喹喔啉；5）用分光光度计比色测定，计算总联二酮含量。本发明的快速分析法具有快速、操作简单、方便，准确，灵敏度高等优点，重复性、再现性的变异系数均少于5%，回收率达80%以上，分析时间从EBC法的120分钟缩短至30分钟，检测效率比EBC法提高了3倍。

说明书

技术领域

本发明属于啤酒生产的检测分析技术领域，具体涉及一种快速分析啤酒半成品总联 二酮含量的方法。

背景技术

啤酒总联二酮含量包括游离的双乙酰和戊二酮、前驱体a–乙酰乳酸和a–乙酰羟基 丁酸转化生成联二酮的总和。戊二酮在啤酒中的含量远较双乙酰低，其味阈值（1mg/L) 又远较双乙酰（0.1mg/L)高，对啤酒风味不起什么大的作用，对啤酒风味起主要作用的 是双乙酰，它被认为是衡量啤酒成熟与否的决定性指标，当含量超过其味阈值0.10ppm， 会给啤酒带来不愉快的馊饭味。双乙酰是啤酒的关键控制指标，最终关系到产品的质量。

控制好成品啤酒双乙酰的前提是控制好半成品总联二酮。目前国外测定半成品总联 二酮含量的方法很多，主要包括EBC法、气相色谱法，国内大部分啤酒企业仍多使用 国标GB/T4928啤酒分析方法。国标法用于检测半成品总联二酮存在较大的缺陷，检测 的不是总联二酮含量，仅是半成品游离联二酮和部分前驱体转化成联二酮的总和，检测 值明显偏低，导致在啤酒包装杀菌、贮存过程中，酒体中的前驱物又慢慢转化成双乙酰， 从而造成成品酒双乙酰超标；气相色谱法因色谱仪费用昂贵，只有少数啤酒企业有能力 配置，导致该方法难以在国内啤酒企业推广；同时，色谱法和EBC法，均需对啤酒半 成品作前处理，60℃水浴90分钟使联二酮前驱体转化为联二酮，耗时较长。

可见，控制好半成品总联二酮含量意义重大，而如何建立一种快速分析啤酒半成品 总联二酮含量的方法，则是我们分析工作中急需解决的一个技术难题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速分析啤酒半成品总联二酮含量的方法，有快速、操 作简单、方便，准确，灵敏度高等优点，重复性、再现性的变异系数均少于5%，回收 率达80%以上，分析时间从EBC法的120分钟缩短至30分钟，检测效率比EBC法提 高了3倍。

本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。依据本发明提出的 一种快速分析啤酒半成品总联二酮含量的分析方法，包括以下步骤：

1）5%的过氧化氢溶液的配制：用20ml的刻度吸管准确吸取16.7ml市售的30% （m/m）过氧化氢至100ml棕色容量瓶，用蒸馏水定容至刻度；

0.2%的过氧乙酸溶液的配制：用量程1000ul-5000ul的移液枪准确吸取1.33ml市售 的15%（m/m）过氧乙酸至100ml棕色容量瓶，用蒸馏水定容至刻度；两种溶液均需放 冰箱低温保存，可存放一周；

2）用量筒取100ml发酵液的上清液于500ml长颈平底烧瓶，如果发酵液明显混浊， 需用离心或过滤方法使之澄清，用量程10ul-100ul的移液枪准确添加5%的过氧化氢溶 液100ul于其中；或用量程1000ul-5000ul的移液枪准确添加0.2%的过氧乙酸溶液5ml 于其中，摇匀，盖塞，待蒸馏用；

3）其蒸馏装置由500ml长颈平底烧瓶、带防溅球的弯头、球形冷凝管、接液弯头 组成；采取直接加热蒸馏的方式，开始蒸馏的速度稍慢，以免泡沫溢出，整个蒸馏过程 控制在6分钟，蒸馏过程不添加消泡油；

4）馏液接于25ml收集容量瓶中，蒸馏前收集容量瓶需添加1ml4M盐酸，定容至 刻度的馏液PH为1.2；分别吸取馏出液10.0ml于两支干燥的比色管中，并于第一支管 中加入10g/L邻苯二胺溶液0.50ml，第二支不加作空白，摇匀，置于暗处放置20分钟， 然后加入4M盐酸溶液2ml；于第二支管中加入4M盐酸溶液2.5ml，混匀，待测；

5）用10mm的石英比色皿，于波长335nm下，以空白作参比，采用紫外分光光度 计测定其吸光度，计算联二酮的总和（以总双乙酰表示）。

借由上述技术方案，本发明具有的优点和有益效果是：

1、本发明采用过氧化物（双氧水、过氧乙酸）与联二酮前驱物氧化脱羧生成联二 酮的技术，EBC法和气相色谱法前处理均需60℃水浴90分钟，该方法最大的优点是检 测速度快，前处理无需时间，并且简单易行，能达到良好的定量检测效果。

2、本发明通过添加一定体积、浓度的盐酸溶液至馏液接收容量瓶，调整蒸馏液PH 值，避免联二酮与啤酒挥发物中的络合物发生副反应，明显提高了联二酮与邻苯二胺反 应的回收率。

3、本发明的方法重复性、再现性的变异系数均少于5%，回收率达80%以上，分析 时间从EBC法的120分钟缩短至30分钟，检测效率比EBC法提高了3倍。

4、该方法使用过氧化物如双氧水和过氧乙酸，安全毒性低，不会对检测人员身体 造成毒害，安全性高。

附图说明

图1是啤酒半成品的蒸馏装置结构图。

图2是5%双氧水添加量在0-0.5ml范围其对应的总联二酮含量（单位：mg/L)。

10：蒸馏器

20：容量瓶

30：长颈平底烧瓶

40：电炉

具体实施方式

一、工作原理

本发明以国标GB/T4928啤酒分析方法为基础，采用一定浓度的过氧化物（如过氧 化氢，过氧乙酸）使联二酮前驱物完成氧化脱羧反应，生成联二酮，通过蒸馏将联二酮 蒸馏出来，在PH约为1.2的酸性条件下与邻苯二胺反应，生成2,3-二甲基喹喔啉，在 波长335nm下测其吸光度，其测定结果为总联二酮，包括游离的联二酮、前驱体a-乙 酰乳酸和a-乙酰-a-羟基丁酸转化生成的联二酮的总和（以总双乙酰表示）。本方法具有 快速、准确、灵敏度高等优点。

二、实验所需仪器

1、带有防溅球的弯头11、球形冷凝管12和接液弯头13的蒸馏器10；

2、容量瓶20：25ml；

3、长颈平底烧瓶30：500ml；

4、1500W可调电炉40；

5、紫外分光光度计：备有10mm石英比色皿。

三、试剂

1、4mol/L盐酸溶液：按GB/T601配制（此溶液需用重蒸水配制）；

2、10g/L邻苯二胺溶液：称取邻苯二胺0.100g，溶于4mol/L盐酸溶液中，并定容 至10ml,摇匀，放于暗处。此溶液当天配制与使用；若配制出来的溶液呈红色，应重新 更换试剂；

3、5%双氧水：用20ml的刻度吸管准确吸取16.7ml市售的30%（m/m)过氧化氢至 100ml棕色容量瓶，用蒸馏水定容至刻度，可放冰箱低温保存一周；

4、0.2%过氧乙酸：用量程1000ul-5000ul的移液枪准确吸取1.33ml市售的15%（m/m) 过氧乙酸至100ml棕色容量瓶，用蒸馏水定容至刻度，可放冰箱低温保存一周；

以下通过具体较佳实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明并不仅限于以下的 实施例。

实施例1

1、样品

1）待测样品来源：发酵液-啤酒大生产的发酵液或实验室发酵瓶/管的发酵液；

2）样品前处理

如有酵母等混浊样品用滤纸或离心处理。

2、检测分析方法

1）5%的过氧化氢溶液的配制：用20ml的刻度吸管准确吸取16.7ml市售的30% （m/m)过氧化氢至100ml棕色容量瓶，用蒸馏水定容至刻度；溶液均需低温放冰箱保存， 可存放一周。

2）用量筒取100ml发酵液的上清液于500ml长颈平底烧瓶30，如果发酵液明显混 浊，需用离心或过滤方法使之澄清，用量程10ul-100ul的移液枪准确添加5%的过氧化 氢溶液100ul于其中；或用量程1000ul-5000ul的移液枪准确添加0.2%的过氧乙酸溶液 5ml于其中，摇匀,盖塞，待蒸馏用。

3）请参阅图1所示，蒸馏装置是由500ml长颈平底烧瓶30、带防溅球的弯头11、 球形冷凝管12、接液弯头13组成；可调电炉40的功率为1500w，采取电直接加热蒸馏 的方式，开始蒸馏的速度稍慢，以免泡沫溢出，整个蒸馏过程控制在6分钟，蒸馏过程 不添加消泡油。

4）馏液接于25ml收集容量瓶20中，蒸馏前收集容量瓶20需添加1ml4M盐酸， 馏液定容至满刻度时PH约为1.2。分别吸取馏出液10.0ml于两支干燥的比色管中，并 于第一支管中加入10g/L邻苯二胺溶液0.50ml，第二支不加作空白，摇匀，置于暗处放 置20分钟，然后加入4M盐酸溶液2ml，于第二支管中加入4M盐酸溶液2.5ml，混匀， 待测。

5）用10mm的石英比色皿，于波长335nm下，以空白作参比，采用紫外分光光度 计测定其吸光度。计算联二酮的总和（以总双乙酰表示）。

试样的总双乙酰含量按式计算：X=A₃₃₅*2.4；

式中：X—试样的总双乙酰含量，mg/L；

A₃₃₅—试样在335nm波长下，用10mm的石英比色皿，测得的吸光度；

2.4-吸光度与双乙酰含量的换算系数。

3、测试结果分析

检测后的验证程序：方法评价指标包括加标回收率、重现性、重复性等达到样品的 分析要求。

样品的重复性、再现性的变异系数均少于5%；在发酵液中加入不同浓度的双乙酰， 回收率达80%以上。

对5罐不同发酵液分析总联二酮含量，结果如下表1所示：

表15罐不同发酵液总联二酮含量

4、灵敏度与线性关系和回收率

由A、B、C三位不同分析人员在同一天重复检测某一发酵液总联二酮含量6次， 根据标准偏差和平均值计算重复性变异系数（RSD）；根据总标准偏差、总平均值计算 再现性变异系数（RSD）。重复性、再现性RSD<5%，较为理想。具体见下表2所示：

表2FT0713°啤酒满罐第7天总联二酮含量

同时以一定浓度双乙酰标液添加至以上发酵液样品中，添加双乙酰标液浓度是样品 总联二酮含量的50%、100%，各六份，分别测定其含量，将平均实测值与理论值比较， 计算回收率，回收率为80%以上，较为理想，具体见下表3所示：

表3FT0713°啤酒满罐第7天总联二酮含量回收率试验

实施例2

1、样品

1）待测样品来源：发酵液-啤酒大生产的发酵液或实验室发酵瓶/管的发酵液；

2）样品前处理

如有酵母等混浊样品用滤纸或离心处理。

2、检测分析方法

1）0.2%的过氧乙酸溶液的配制：用量程1000ul-5000ul的移液枪准确吸取1.33ml 市售的15%（m/m）过氧乙酸至100ml棕色容量瓶，用蒸馏水定容至刻度。两种溶液均 需低温放冰箱保存，可存放一周。

2）用量筒取100ml发酵液的上清液于500ml长颈平底烧瓶30中，如果发酵液明显 混浊，需用离心或过滤方法使之澄清，用量程10ul-100ul的移液枪准确添加5%的过氧 化氢溶液100ul于其中；或用量程1000ul-5000ul的移液枪准确添加0.2%的过氧乙酸溶 液5ml于其中，摇匀,盖塞，待蒸馏用。

3）请参阅图1所示，蒸馏装置由500ml长颈平底烧瓶30、带防溅球的弯头11、球 形冷凝管12、接液弯头13组成；可调电炉40的功率为1500w,采取电炉直接加热蒸馏 的方式，开始蒸馏的速度稍慢，以免泡沫溢出，整个蒸馏过程控制在6分钟，蒸馏过程 不添加消泡油。

4）馏液接于25ml收集容量瓶中，蒸馏前收集容量瓶需添加1ml4M盐酸，馏液定 容至满刻度时PH约为1.2。分别吸取馏出液10.0ml于两支干燥的比色管中，并于第一 支管中加入10g/L邻苯二胺溶液0.50ml，第二支不加作空白，摇匀，置于暗处放置20 分钟，然后加入4M盐酸溶液2ml，于第二支管中加入4M盐酸溶液2.5ml，混匀，待测。

5）用10mm的石英比色皿，于波长335nm下，以空白作参比，测定其吸光度。计 算联二酮的总和（以总双乙酰表示）。

试样的总双乙酰含量按式计算：X=A335*2.4；

式中：X—试样的总双乙酰含量，mg/L；

A335—试样在335nm波长下，用10mm的石英比色皿，测得的吸光度；

2.4—吸光度与双乙酰含量的换算系数。

3、测试结果分析

对5罐不同发酵液分析总联二酮含量，结果如下表4所示：

表45罐不同发酵液的总联二酮含量

4、灵敏度与线性关系和回收率

由A、B、C三位不同分析人员在同一天重复检测某一发酵液总联二酮含量6次， 根据标准偏差和平均值计算重复性变异系数（RSD）；根据总标准偏差、总平均值计算 再现性变异系数（RSD）。重复性、再现性RSD<5%，较为理想。具体见表5：

表5FT1918°啤酒满罐第9天的总联二酮含量

同时以一定浓度双乙酰标液添加至以上发酵液样品中，添加标液浓度是样品总联二 酮含量的50%、100%，各六份，分别测定其含量，将平均实测值与理论值比较，计算 回收率，回收率为80%以上，较为理想，具体见表6：

表6FT1918°啤酒第9天总联二酮含量回收率试验

5.过氧化物添加量的确定

过氧化物的添加量则是该方法的技术关键点。在蒸馏过程中加入一定量的过氧化 物，联二酮的前驱物a-乙酰乳酸和a–乙酰羟基丁酸则被过氧化物氧化生成联二酮。但当 过氧化剂添加量不足，a-乙酰乳酸和a–乙酰羟基丁酸未能完全转化为联二酮，导致总联 二酮检测值偏低；同时，蒸馏过程中也可能会发生副反应，即过量的过氧化物会与蒸馏 液中游离的双乙酰反应生成乙酸，使检测结果偏低。可见，选择合适的过氧化物添加量 尤为重要。

过氧化物以双氧水为例，通过对双氧水不同添加量的研究，双氧水添加量在 0-0.025ml,总联二酮是明显升高；0.025-0.1ml,总联二酮是缓慢升高；超过0.1ml，总联二 酮呈下降趋势。

最终发现：双氧水添加量为0.1ml时，总联二酮结果为最大值，表明此时前驱物转 化完全而又不会出现副反应消耗游离双乙酰。因此，双氧水最佳添加量确定为：每100ml 半成品样品添加5%双氧水为0.1ml，具体见图2所示。

6、蒸馏收集物的酸碱度对联二酮与邻苯二胺反应的影响

1）在下列一组收集蒸馏液的添加4M HCL酸度递增的样品中，检测到的总联二酮 含量见下表7所示。

表7添加不同量的4M HCL于接收容量瓶中检测相应的总联二酮含量试验

从上表7可以看出，蒸馏收集物的酸碱度对联二酮和邻苯二胺反应存在较大的影响。 当4M HCL的添加量为1ml,PH值约为1.2时，测得的发酵液总联二酮含量为最大；当 4M HCL的添加量>1ml，测得的发酵液总联二酮含量并无递增。究其原因，在蒸馏液 PH值下，啤酒挥发物中的络合物与联二酮部分络合，从而使联二酮不能完全与邻苯二 胺反应；而在PH值<1.2，啤酒挥发物中的络合物不与联二酮进行络合反应，联二酮则 直接冷却与邻苯二胺结合。

2）下面对馏液接收瓶添加1ml4M HCL与否对联二酮和邻苯二胺反应回收率的影 响作一试验，具体见表8所示。

表8馏液接收瓶添加4M HCL与否对联二酮与邻苯二胺反应回收率的影响试验

从表8可以看出，接收馏液不进行盐酸酸化，随着添加双乙酰的量递增，发酵液联 二酮的加标回收率反而减少；如果馏液接收瓶进行盐酸酸化，不同水平的双乙酰添加量， 回收率均达80%以上，较为理想。

7、快速分析法与国标法GB/T4928的对比（过氧化物以双氧水为例）

取四罐不同品种的发酵液，分别用GC法、快速法检测满罐1至8天其联二酮含量， 结果具体见表9所示。

表9快速分析法与国标法检测发酵液联二酮含量结果对比（单位：mg/L）

从上表9可以看出，国标法检测的仅是半成品游离联二酮和部分前驱体转化成联二 酮的总和，其检测值比快速分析法检测的总联二酮明显偏低，从而会导致成品酒双乙酰 反弹超标。

8、快速分析法与气相色谱法的对比（过氧化物以双氧水为例）

取39个品种不同、总联二酮浓度不同的发酵液样品，分别用GC法、快速法检测， 对其检测结果做成对t检验。

表10快速分析法与气相色谱法检测发酵液总联二酮含量结果对比（单位：mg/L）

表11t-检验:成对双样本均值分析

  变量1 变量2 平均 0.641225641 0.648092308 方差 0.344675217 0.381785595 观测值 39 39 泊松相关系数 0.993396807   假设平均差 0   df 38   t Stat -0.566047792   P(T<=t)单尾 0.287344555   t单尾临界 1.685954461   P(T<=t)双尾 0.57468911   t双尾临界 2.024394147  

判定：设α=0.05，因为P(T<=t)双尾＝0.57468911>0.05，所以气相色谱法、快速 法的检测结果在95%的置信区间内没有显著性差异。

综上所述，快速分析半成品总联二酮的方法解决了国标法双乙酰前驱物不完全转化, 检验结果易受蒸馏过程电压波动、蒸馏时间、以及样品摄入的氧气量的影响而重现性较 差，前驱物在啤酒中随时间的延长而转化为双乙酰，可能造成成品酒的双乙酰超标的问 题。

而欧洲啤酒协会(EBC)法中，需对啤酒半成品作前处理，联二酮前驱体转化为联二 酮需90分钟，而快速法通过蒸馏前添加过氧化物使联二酮前驱体氧化生成联二酮，无 需转化时间。快速法具有快速，操作简单、方便，准确，灵敏度高等优点，重复性、再 现性的变异系数均少于5%，回收率达80%以上，与气相色谱法的检测结果对比在95% 的置信区间内没有显著性差异，分析时间从120分钟缩短至30分钟，检测效率比原来 提高了3倍，该方法适合任何啤酒企业，无需设备投入，在啤酒行业中具有较好的推广 应用前景。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，故 凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单 修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。