系统性红斑狼疮外周血单个核细胞超保守区域转录表达基因模型的构建方法与应用

摘要

本发明涉及系统性红斑狼疮外周血单个核细胞超保守区域转录表达基因模型的构建方法与应用，构建方法包括以下步骤：设置SLE组与正常对照组，每组包括若干份全血标本，分离得到外周血单个核细胞；测定标本RNA的含量、质量与完整性，确定可用则执行下一步骤；采用T-UCR芯片分析人体T-UCRs表达水平，检测基因特异性探针标记的UCRs；进行RNA标记和芯片杂交；采用特征提取方法，分析芯片扫描结果；采用FC过滤鉴定差异表达的潜在T-UCRs及与其重叠UCRs的RNA转录子，采用GO分析测定与UCRs相关联的差异性mRNA在生物进程中的作用；比较两组中各标本间的倍数变化，筛选出表达差异的RNA。

说明书

【技术领域】

本发明涉及系统性红斑狼疮领域，尤其涉及一种系统性红斑狼疮外周血单 个核细胞超保守区域转录表达基因模型的构建方法与应用。

【背景技术】

系统性红斑狼疮（Systemic lupus erythematosus，SLE）是一种与弥漫 性结缔组织相关的典型的全身性自身免疫病，其具有重要的特征是发生免疫炎 症。SLE的发病机制复杂，涉及家族遗传，免疫和环境因素等，可能会导致组 织和器官的损害，其中最复杂的是肾功能损害。

最近研究发现，在人、小鼠和大鼠基因中极度保守的长段非编码基因区域， 命名为超保守区域(ultra-conserved regions，UCRs)。UCR为长约200～779bp 的序列，最初于2004年由Bejerano发现。UCR常位于肿瘤相关的基因区域或 脆性位点。UCR编码的一群特殊的非编码核糖核酸（ncRNA），称为超保守区域 转录子（transcribed ultraconserved regions,T-UCRs），在人肿瘤中其表 达发生变化。T-UCR是长链非编码核糖核酸（Long-noncoding RNA，lncRNA） 重要组成部分，转录自人类基因组中481个极度保守区域（Ultraconserved  regions），在白血病、肝癌、结肠癌、神经母细胞瘤等多种癌症中会改变表达 模式。这表明，T-UCRs参与癌症生物学和肿瘤发生，并有可能作为疾病诊断， 预后和预测的指标，以及一类新的治疗靶点。

但是，T-UCRs尚未有应用于SLE的研究。

【发明内容】

有鉴于此，有必要提出系统性红斑狼疮外周血单个核细胞超保守区域转录 表达基因模型的构建方法与应用。

本发明的一个技术方案是系统性红斑狼疮外周血单个核细胞超保守区域 转录表达基因模型的构建方法，其包括以下步骤：S1，设置系统性红斑狼疮组 与正常对照组，每组包括若干份相异人体的已经脱离人体的全血标本，分别分 离得到外周血单个核细胞；S2，测定标本核糖核酸的含量、质量与完整性，确 定可用，则执行下一步骤；S3，采用超保守区域转录子芯片分析人体超保守区 域转录子表达水平，检测基因特异性探针标记的超保守区域基因；S4，进行核 糖核酸标记和芯片杂交；S5，采用特征提取方法，分析获得的芯片扫描结果， 过滤低强度表达的探针，将原始信号探针的强度进行归一化；S6，采用倍数变 化方法过滤鉴定差异表达的潜在的超保守区域转录子及与其重叠超保守区域 的核糖核酸转录子，并采用基因本体论方法分析测定与超保守区域相关联的差 异性的信使核糖核酸在生物进程中的作用；S7，比较所述系统性红斑狼疮组与 所述正常对照组中各标本间的倍数变化，筛选出表达差异的核糖核酸。

优选的，所述构建方法中，步骤S2中，采用全波长超微量分光光度计测 定标本核糖核酸的含量与质量，用琼脂凝胶电泳评估标本核糖核酸的完整性。

优选的，所述构建方法中，步骤S3中，在各超保守区域基因的两端分别 添加1kb的片段，然后用40bp的特异性探针标记。

优选的，所述构建方法中，步骤S4中，采用单色芯片基底基因表达分析 方案进行核糖核酸标记和芯片杂交，把信使核糖核酸和长链非编码核糖核酸在 去除核糖体核糖核酸后从总核糖核酸中纯化出来。

优选的，所述构建方法中，步骤S5中，筛选出至少1/3样本的信使核糖 核酸和长链非编码核糖核酸。

优选的，所述构建方法中，步骤S7中，设置所述倍数变化的阈值≥2.0。

优选的，所述构建方法中，所述基因模型中，包括表达上调的8个超保守 区域转录子，以及表达下调的29个超保守区域转录子，并且，各所述超保守 区域转录子均为外显子。

优选的，所述构建方法中，表达上调的8个超保守区域转录子包括 uc.285+、uc.234+、uc.102+、uc.341+、uc.267+、uc.221-、uc.290-以及uc.90+， 表达下调的32个超保守区域转录子包括uc.101-、uc.138-、uc.141-、uc.144-、 uc.151-、uc.166-、uc.173+、uc.185-、uc.186-、uc.208-、uc.209-、uc.266+、 uc.267+、uc.268-、uc.276+、uc.280+、uc.28+、uc.324-、uc.36+、uc.418-、 uc.419-、uc.420-、uc.45-、uc.455-、uc.457-、uc.46-、uc.475+、uc.50-、 uc.61-、uc.63-、uc.77-以及uc.97+。

本发明的又一个技术方案是采用任一上述构建方法所得到的系统性红斑 狼疮外周血单个核细胞超保守区域转录表达基因模型在获取系统性红斑狼疮 标志物的应用。

优选的，所述应用中，所述基因模型包括基因HNRNPH1。

上述方案获得了外周血单个核细胞的T-UCRs的差异表达情况相关联的关 键基因，可能作为SLE的潜在的生物标志物或是治疗靶点，并且由于标本量小 而且结果的稳定性和准确性，对于临床方面的转录表达调控研究具有特别重要 的意义。

【附图说明】

图1是本发明一个实施例的示意图。

【具体实施方式】

为了便于理解本发明，下面结合附图和具体实施例，对本发明进行更详细 的说明。附图中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以采用许多不 同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例。相反地，提供这些实施 例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的 技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本说明书中在本发明的说明书中所 使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是用于限制本发明。本说明 书所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的 组合。

本发明旨在通过对系统性红斑狼疮的单个核细胞的T-UCRs的表达水平研 究，发现其临床病理特征，以及新的可能的诊断或预后生物标志物。如图1所 示，本发明的一个实施例是，系统性红斑狼疮外周血单个核细胞超保守区域转 录表达基因模型的构建方法，其包括以下步骤：S1，设置系统性红斑狼疮组与 正常对照组，每组包括若干份相异人体的已经脱离人体的全血标本，分别分离 得到外周血单个核细胞；S2，测定标本核糖核酸的含量、质量与完整性，确定 可用，则执行下一步骤；S3，采用超保守区域转录子芯片分析人体超保守区域 转录子表达水平，检测基因特异性探针标记的超保守区域基因；S4，进行核糖 核酸标记和芯片杂交；S5，采用特征提取方法，分析获得的芯片扫描结果，过 滤低强度表达的探针，将原始信号探针的强度进行归一化；S6，采用倍数变化 方法过滤鉴定差异表达的潜在的超保守区域转录子及与其重叠超保守区域的 核糖核酸转录子，并采用基因本体论方法分析测定与超保守区域相关联的差异 性的信使核糖核酸在生物进程中的作用；S7，比较所述系统性红斑狼疮组与所 述正常对照组中各标本间的倍数变化，筛选出表达差异的核糖核酸。

又一个实施例是，系统性红斑狼疮外周血单个核细胞超保守区域转录表达 基因模型的构建方法，其包括以下步骤。

S1，设置系统性红斑狼疮组与正常对照组，每组包括若干份相异人体的已 经脱离人体的全血标本，分别分离得到外周血单个核细胞；优选的，分离后置 于-80℃保存。

例如，本发明各实施例采用两组全血标本，采集时间为2011年1月-9月， 分别来自15名系统性红斑狼疮患者和15名健康正常对照组，对应作为系统性 红斑狼疮组与正常对照组。如表1所示，这两组全血标本均来自中国广西桂林 第一八一医院，标本分离得到所需外周血单个核细胞后放置于-80℃保存。需 要说明的是，标本收集的方案与执行，均获得广西代谢性疾病重点实验室和第 一八一医院伦理委员会的批准。

表1系统性红斑狼疮标本特征（n=15）

S2，测定标本核糖核酸的含量、质量与完整性，确定可用，则执行下一步 骤；例如，若不可用，则放弃该标本，或者重取该标本。优选的，步骤S2中， 采用全波长超微量分光光度计测定标本核糖核酸的含量与质量，用琼脂凝胶电 泳评估标本核糖核酸的完整性。例如，标本的测定采用NanoDrop ND-1000测 定标本RNA的含量与质量，用琼脂凝胶电泳评估标本RNA的完整性。

S3，采用超保守区域转录子芯片分析人体超保守区域转录子表达水平，检 测基因特异性探针标记的超保守区域基因；优选的，步骤S3中，在各超保守 区域基因的两端分别添加1kb的片段，然后用40bp的特异性探针标记。

例如，采用Arraystar公司的人T-UCR芯片分析人体T-UCRs表达水平。 在481个UCRs超保守区域的两端分别添加1kb的片段，然后用40bp的特异性 探针标记，从而可以准确的检测T-UCR和发现新的T-UCR。

接着，在芯片中加入特定的外显子或剪接连接的探针，从而可靠和精确地 检测到153个潜在的T-UCRs，这些T-UCRs可以与数据库，例如以RefSeq，UCSC  knowngenes和Ensembl进行比对。

基因特异性探针标记的UCRs共1809个基因被检测到，从而可发现T-UCRs 和它们的近端蛋白质编码基因之间的关系。

S4，进行核糖核酸标记和芯片杂交；优选的，步骤S4中，采用单色芯片 基底基因表达分析方案进行核糖核酸标记和芯片杂交，把信使核糖核酸和长链 非编码核糖核酸在去除核糖体核糖核酸后从总核糖核酸中纯化出来。

例如，做RNA标记和芯片杂交，均按照安捷伦单色芯片基底基因表达分析 方案执行。例如，把mRNA和长链非编码在去除rRNA后从总RNA中纯化出来， 例如，使用mRNA-ONLYTM真核生物mRNA提取试剂盒，然后用随机引物法对样 本进行扩增并转录成荧光cRNA，将标记的cRNA用RNAeasy试剂盒提取纯化， 例如采用Qiagen公司的RNAeasy试剂盒提取纯化，采用NanoDrop ND-1000 测定纯化并标记后的cRNA（pmol Cy3/μg cRNA）的浓度以及比活性，每1μg 的经标记的cRNA用5μL10倍的阻断剂和1μL25倍的裂解缓冲液进行裂解， 然后混匀放置60℃加热30分钟，最后加入25μL2倍的GE杂交缓冲液。吸取 50μL的杂交混合液于芯片中，置于安捷伦杂交仪中65℃孵育17个小时，接 着将芯片洗涤，固定，然后用双激光DNA微阵列扫描仪，例如安捷伦G2505C 扫描仪，扫描芯片结果。

S5，采用特征提取方法，分析获得的芯片扫描结果，过滤低强度表达的探 针，将原始信号探针的强度进行归一化；优选的，步骤S5中，筛选出至少1/3 样本的信使核糖核酸和长链非编码核糖核酸。

数据分析中，例如使用安捷伦特征提取软件（版本11.0.1.1）分析获得的 芯片扫描结果，而分位点的归一化强度和数据处理使用GeneSpring GX v12.1 分析。使用GeneSpring GX v12.1将低强度表达的探针过滤，然后将原始信号 探针的强度进行归一化。筛选出至少1/3的样本的mRNA和长链非编码RNA用 于下一步的分析，而一些离散的转录区域则用Otsu（图像阈值化分割法中的经 典算法之一）的信号处理方法来确定。

S6，采用倍数变化方法过滤鉴定差异表达的潜在的超保守区域转录子及与 其重叠超保守区域的核糖核酸转录子，并采用基因本体论方法分析测定与超保 守区域相关联的差异性的信使核糖核酸在生物进程中的作用。

通过倍数变化（Fold change，FC）过滤鉴定差异表达的潜在的T-UCRs和 TUs重叠UCRs的RNA转录子；GO（Gene Ontology，基因本体论）分析用于测 定与UCR相关联的差异性的mRNAs在生物进程中的作用。

GO是一种整合性、统一化、动态开放实时更新的分类系统。它包括三大 独立的本体（Ontology）：基因参与的生命过程（biological process，BP）， 所处的细胞组份和元件(cellular component，CC）及发挥的分子生物学功能 （molecular function，MF）。这三个ontology下面又可以独立出不同的亚层 次，层层向下构成一个ontologies的树型分支结构。P值可以用来确定差异性 的mRNA在GO本体中的富集程度，P值越小，表明越显著（P<=0.05）。

S7，比较所述系统性红斑狼疮组与所述正常对照组中各标本间的倍数变 化，筛选出表达差异的核糖核酸。优选的，步骤S7中，设置所述倍数变化的 阈值≥2.0。

优选的，在步骤S7之后，获得所述基因模型；优选的，所述基因模型中， 包括表达上调的8个超保守区域转录子，以及表达下调的29个超保守区域转 录子，并且，各所述超保守区域转录子均为外显子。例如，其中，表达上调的 8个超保守区域转录子包括uc.285+、uc.234+、uc.102+、uc.341+、uc.267+、 uc.221-、uc.290-以及uc.90+，对应8个基因；32个超保守区域转录子包括 uc.101-、uc.138-、uc.141-、uc.144-、uc.151-、uc.166-、uc.173+、uc.185-、 uc.186-、uc.208-、uc.209-、uc.266+、uc.267+、uc.268-、uc.276+、uc.280+、 uc.28+、uc.324-、uc.36+、uc.418-、uc.419-、uc.420-、uc.45-、uc.455-、 uc.457-、uc.46-、uc.475+、uc.50-、uc.61-、uc.63-、uc.77-以及uc.97+， 对应28个基因，具体如表2所示。优选的，在步骤S7之后，还执行步骤S8、 选取表达差异超过预设差异阈值的核糖核酸构建基因模型。其中，预设差异阈 值根据实验或者先验数据确定。

与上述各实施例结合应用，本发明的又一实施例是采用任一上述构建方法 所得到的系统性红斑狼疮外周血单个核细胞超保守区域转录表达基因模型在 获取系统性红斑狼疮标志物的应用。

优选的，所述基因模型包括基因HNRNPH1。

对于潜在的T-UCRs，Arraystar公司人T-UCR芯片包含了来自RefSeq， UCSC knowngenes和Ensembl数据库的153个潜在的T-UCRs。每个转录子使用 一个特定的外显子或剪接点探针进行准确检测。通过比较两个标本间的倍数变 化来筛选出表达差异的潜在的T-UCRs，倍数变化的阈值是≥2.0。从表2中可 以发现系统性红斑狼疮与正常对照组之间有8个T-UCRs表达上调，29个T-UCRs 表达下调，而且这些T-UCRs都是外显子。

表2系统性红斑狼疮患者与正常对照组的潜在T-UCR的表达水平差异

对于TUs重叠UCRs的RNA转录子，一些T-UCRs与mRNA或LncRNAs相关 联，并在转录后调控中发挥着重要角色，如选择性剪接和mRNA加工。例如， 与人类RNA集合蛋白基因相关的29个T-UCRs中，15个T-UCRs与无义介导mRNA 降解（nonsense-mediated mRNA decay，NMD）的选择性剪切（alternative  splicing coupled with nonsense-mediated decay，AS-NMD）相关，包括8 个终止密码子的外显子和7个与选择性剪切导致的NMD途径相关的T-UCRs。也 有的T-UCRs会发生反转录，如癌症和正常对照的组织中，有9个T-UCRs发生 了显著的差异性表达。因此，Arraystar人T-UCR芯片分析了1518个LncRNAs 和2261个mRNAs的正反转录情况，测定T-UCRs与TUs重叠UCRs的RNA转录 子之间的相关性。

通过比较两个标本间的倍数变化来筛选出表达差异的RNA，倍数变化的阈 值是≥2.0。从表3中可以发现系统性红斑狼疮与正常对照组之间有141个 T-UCRs表达上调，251个T-UCRs表达下调（其中有省略）。

表3系统性红斑狼疮患者与正常对照组的转录范围与UCR重叠的所有转录 本的表达水平差异

通过对TUs重叠UCRs的RNA转录子的GO分析，发现274个T-UCRs参与 GO本体，其中64个T-UCRs参与生命进程（BP），101个T-UCRs参与细胞组份 和元件（CC），109个T-UCRs发挥分子生物学功能（MF），如表4所示。而且表 明超保守区域uc.186-表达水平最显著，其p=3.29E-16，FC=-38.64861，其 相关基因为HNRNPH1。

表4GO分析

在人类组织中，很大一部分的UCRs都会发生转录（T-UCRs），并且它们的 表达水平与组织特异性相关联。T-UCRs只有一条主链会发生转录，而且只有 9%的T-UCRs会发生正反转录。准确测定人类所有的481T-UCRs方法有芯片测 定、Northern印迹法、反转录实时定量PCR和线性恒温Ribo-SPIA^TM RNA扩增 法。因为标本量小而且结果的稳定性和准确性，所以这对于临床方面的转录表 达调控研究具有特别意义。

进一步地，本发明的实施例还包括，上述各实施例的各技术特征，相互组 合形成的系统性红斑狼疮外周血单个核细胞超保守区域转录表达基因模型的 构建方法与应用，应用即采用任一所述构建方法所得到的系统性红斑狼疮外周 血单个核细胞超保守区域转录表达基因模型在获取系统性红斑狼疮标志物的 应用方法。

本发明各实施例主要涉及系统性红斑狼疮与正常对照组之间的潜在的 T-UCRs和TUs重叠UCRs的RNA转录子，发现基因HNRNPH1（heterogeneous  nuclear ribonucleoprotein H1）在SLE与正常对照组之间表达显著最明显。 该基因编码异质核核糖核蛋白（hnRNPs），hnRNPs是RNA结合蛋白与异构核RNA 相结合的产物，此蛋白在细胞核中与前mRNA前相关联，并且影响着前-mRNA 加工和mRNA代谢和运输的其它方面。所有的hnRNPs都存在于细胞核中，一些 hnRNPs会在细胞核与细胞质之间运动。此核蛋白的蛋白质具有不同的核酸结合 特性。由HNRNPH1编码的蛋白质具有结合于RNA的三个重复的RRM结构域并且 非常类似于家族成员HNRPF，并且该基因可能与遗传性淋巴水肿1型相关。

综上所述，本发明系统地评估了SLE患者与正常对照组的外周血单个核细 胞的T-UCRs的差异表达情况，并获得了相关联的关键基因。本发明研究结果 表明，T-UCRs与系统性红斑狼疮具有相关性，并且相关的关键基因可能作为 SLE的潜在的生物标志物或是治疗靶点。然而，本文的研究数据只是初步阶段， 需要更多的标本数以及更深入的研究。

SLE是一种由多种基因调控的慢性的可能致命的全身性自身免疫性疾病。 T-UCR是长链非编码RNA重要组成部分，转录自人类基因组中481个极度保守 区域，在白血病、肝癌、结肠癌、神经母细胞瘤等多种癌症中会改变表达模式。 本发明采用T-UCR芯片技术分析了15名系统性红斑狼疮患者和15名健康正常 对照组的外周血单个核细胞的超保守区域转录表达水平。对比患者与正常对照 组，通过芯片筛选出T-UCRs，发现8个T-UCRs，包括uc.285+,uc.234+,uc.102+, uc.341+,uc.267+,uc.221-,uc.290-与uc.90+；其表达水平上调，即表达上 调；29个T-UCRs表达水平下调，即表达下调。在表达上调和下调的T-UCRs 中，对应的超保守区域uc.186-表达水平最显著，p=3.29E-16,FC=-38.64861， 其相关基因为HNRNPH1。通过GO分析后，发现uc.186-可能是系统性红斑狼疮 潜在的诊断和预后的生物标志物，HNRNPH1可能是系统性红斑狼疮潜在的关键 基因。

从上述各实施例的结果可见，应用系统性红斑狼疮外周血单个核细胞超保 守区域转录表达基因模型的构建方法构建的基因模型有助于提供一种区分SLE 患者和正常对照组的可能途径，但是由于SLE存在缓解期及活动期，且多伴有 其他系统并发症，因此根据现有技术中的医学知识和本发明申请公开的内容， 从所获得的信息本身不能够直接得出该SLE疾病的诊断结果。但是随着后续研 究工作的开展，采用上述各例及其组合的构建方法，其所构建的系统性红斑狼 疮外周血单个核细胞超保守区域转录表达基因模型，将作为中间结果的有效信 息，为下一步的分析工作提供良好的信息支持和辅助数据。

综上所述，本发明的应用是以超保守区域转录表达为基础的基因技术对 SLE患者已经脱离人体的全血标本进行分析，发现SLE患者的超保守区域转录 子的表达与正常人存在一定差异，虽然这类差异是广泛存在的，但是在深入进 行后续研究之后，很有可能确定其中可能存在作为中间结果的信息，从而发现 系统性红斑狼疮的诊断和预后的生物标志物。

需要补充的是，本发明的直接目的不是获得诊断结果或健康状况，而只是 对已经脱离人体的体液，即全血标本，进行处理或检测以获取作为中间结果的 信息的方法，或处理该信息的方法，根据目前的医学知识和本发明所公开的内 容，从所获得的信息本身不能够直接得出疾病的诊断结果。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详 细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制；并且，上面列出的各个 技术特征，其相互组合所能够形成各个实施方案，应被视为属于本发明说明书 记载的范围。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下， 还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专 利的保护范围应以所附权利要求为准。