快速检测水稻直链淀粉Wx基因型的分子标记Wx-YMZC及应用方法

摘要

本发明提出了一种快速检测水稻直链淀粉Wx基因型的分子标记Wx-YMZC及应用方法，分子标记的正向引物序列：Wx-YMZCF：TCACCATTCCTTCAGTTCTT，反向引物序列：Wx-YMZCR：TCTGAATAAGAGGGGAAACA。应用方法为：1）提取待查水稻基因的DNA；2）对待查水稻基因组DNA进行PCR扩增；3）反应产物用10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测比对Wx基因中(CT)n类型；4）反应产物经过AccⅠ酶切后用2%琼脂糖凝胶电泳检测比对Wx基因中G/T的碱基类型。利用本发明的新型分子标记Wx-YMZC只需要一次PCR扩增反应以及一次酶切反应就可检测检测出Wx基因中(CT)n类型和G/T的碱基类型，不仅使实验更加简单，而且降低了实验成本，同时准确率较高。

说明书

技术领域：

本发明涉及水稻直链淀粉基因Wx的相关分子标记方法，特别是快速检测水稻直链淀粉Wx基因型的分子标记Wx-YMZC及应用方法，属于分子遗传学领域，可用于水稻直链淀粉分子标记辅助选择育种和种质的分型鉴定。 

背景技术：

水稻是全球人类赖以生存的最重要粮食作物之一，世界上近半人口以水稻为食。随着人们对水稻产量要求的不断提高，越来越多的消费者开始逐渐追求优质稻米。直链淀粉含量是影响稻米品质最重要的因素，直链淀粉主要由Wx基因编码的颗粒性结合淀粉合成酶(GBSS)催化合成，不同Wx基因类型的材料其直链淀粉含量存在差异。 

Wx基因(Waxy gene，Wx)也称为蜡质基因，位于第6号染色体的短臂上(Lwata et al.，1971)，是控制直链淀粉含量的最主要基因，由14个外显子和13个内含子构成，包括编码区以及3’端和5’端旁侧在内的序列，全长5499bp(Wang et a1.，1990)。水稻Wx基因前导序列的第一内含子5’端剪切位点的上游55bp处存在一段(CT)n的重复序列，研究表明该(CT)n的重复序列与直链淀粉含量存在显著关系(舒庆尧等，1998)。此外，在水稻Wx基因第一内含子5’端+1的+713bp位置处存在一个G置换为T的碱基突变，该位点的突变明显改变了Wx基因的剪接效率，大量研究表明，该位点的剪接效率与直链淀粉含量是直接相关的(王宗阳等，1993)。同时对这两个基因位点进行检测和选择，可为后期稻米品质的直链淀粉含量改良提供更好的基础。 

传统的常用检测方法是使用484/485分子标记检测Wx基因中(CT)n的重复数(下标n为重复次数)，使用PCR-Acc I分子标记检测Wx基因中G/T的碱基类型。使用的引物不同，且需要进行两次独立的不同PCR扩增反应以及一次酶切 反应，实验程序较繁琐。 

参考文献 

[1]Lwata N，Omura T.Linkage analysis by re-ciprocal translocation method in rice plant(Oryza sativa L.)II：Linkage groups corresponding to the chromosome5，6，7，8，9，10and11[J].Sci.Bull.Fac.Agr.，Kyushu Univ.，1971，25：802-804. 

[2]Macdonald F D，Preiss J.Partial purification and characterization of granule-bound starch synthases from normal and waxy maize[J].Plant physiology，1985，78(4)：849-852. 

[3]Wang Z Y，Wu Z L，Xing Y Y，et al.Nucleotide sequence of rice waxy gene[J].NuclAcicls Res，1990，18(19)：5898. 

[4]舒庆尧，徐光华，夏英武，等.稻米表观直链淀粉含量研究进展(综述)[J].浙江农业学报，1998，10(1)：47-54. 

[5]王宗阳，郑霏琴，高继平.水稻蜡质基因中两种类似转座因子的顺序[J].中国科学(B辑)，1993，23(6)：598-603. 

[6]Murray M G，Thompson W F.Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J].Nucleic Acids Research，1980，8(19). 

发明内容：

本发明的目的是提出一种新型分子标记Wx-YMZC及其相应的检测方法，对水稻直链淀粉种质进行分型鉴定，可以达到较高的准确率，提高检测效率。 

本发明是这样实现的。设计一对引物：其正向引物序列：Wx-YMZCF：TCACCATTCCTTCAGTTCTT，反向引物序列：Wx-YMZCR：TCTGAATAAGAGGGGAAACA，命名为Wx-YMZC分子标记。该分子标记用于鉴定水稻直链淀粉Wx基因的种质和分型。 

利用上述Wx-YMZC分子标记鉴定水稻直链淀粉Wx基因的种质和分型的方法，其步骤为： 

1.提取待查水稻基因的DNA； 

2.对待查水稻基因组DNA进行PCR扩增； 

PCR扩增总体系为10μL，具体成分如下： 

PCR扩增程序见表1： 

表1引物Wx-YMZC的PCR扩增程序 

3.检测Wx基因中(CT)n类型。反应产物在10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，用硝酸银染色，统计电泳带型，不同带型对应于不同的(CT)n重复数类型。 

4.检测Wx基因中G/T的碱基类型。反应产物经过AccI酶切后在2％琼脂糖凝胶电泳。电泳结果如果有约186bp的单带，则表明该水稻材料没有被AccI酶切，该水稻材料的基因型为TT型；如果被酶切后有两条带，即为约137bp和49bp，则表明该水稻材料的基因型为GG型；若三种分子量的DNA条带等量存在，则表明该水稻材料的基因型为GT杂合型。 

利用本发明的新型分子标记Wx-YMZC只需要一次PCR扩增反应以及一次酶切反应就可检测检测出Wx基因中(CT)n类型和G/T的碱基类型，不仅使实验更加简单，而且降低了实验成本，同时准确率较高。 

附图说明

图1引物Wx-YMZC扩增15份优质材料的电泳结果，其中M为DNA marker  DL500， 

图2引物Wx-YMZC扩增15种优质材料经Acc I酶切后的2％琼脂糖凝胶电泳结果，其中M为DNA marker DL500， 

图3-图10为日本晴(来源NCBI数据库)与15个优质材料的序列比对图。 

图中：“——”代表新引物Wx-YMZC正向引物序列和反向引物互补序列； 

代表Wx基因第一内含子5’端+1的+713bp位置处的SNP(G/T)； 

“□，，代表Wx基因中(CT)的重复和(AATT)的重复。 

具体实施方式：

(1)供试材料 

试验材料包括15份材料，其中4份高直链淀粉含量的材料，10份中低等直链淀粉含量的材料和1份糯稻材料，具体见表2。 

表215份不同直链淀粉含量的材料 

(2)水稻Wx基因型序列的检测 

在NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中搜索日本晴水稻的Wx基因全序列，用primer3.0设计一对便于测序的引物Wx-YMZF和Wx-YMZR。该引物扩增序列包含Wx基因前导序列第一内含子5’端剪切位点上游55bp处的一段(CT)n的重复序列和第一内含子5’端SNP的G/T位点，扩增片段大小约为848bp，随后将15份材料的扩增产物送北京擎科测序公司测序，序列测定以引物Wx-YMZ为测序引物，通过正反两次测序反应来完成序列的测序，测序的片段使用DNAMAN进行拼接以及手工的校正(具体序列见附图1)，统计15份材料的基因序列，共统计出5种不同的(CT)n类型(下标为重复次数)，其中1号的(CT)n类型为(CT)₂₀；2-8号为(CT)₁₈；9-12号为(CT)₁₇；13号为(CT)₁₃；14和15号为(CT)₁₁；以及在Wx基因中第一内含子5’端+1的+713bp位置处G/T的序列显示：2-12号材料为TT型，1、13、14和15为GG型；同时通过比对15个优质资源的保守序列为后续设计新的引物作准备。 

测定水稻直链淀粉Wx基因型序列的分子标记Wx-YMZ： 

Wx-YMZF正向引物序列：GCGTCGTCATAGACAAAAGT 

Wx-YMZR反向引物序列：TGACCAACTCGGCTACTAAA 

该引物的PCR扩增总体系为25μL，具体成分如下： 

PCR扩增程序见表3： 

表3引物Wx-YMZ的PCR扩增程序 

表4 15份材料的Wx基因型 

(3)Wx-YMZC标记的获得 

将引物Wx-YMZ在15份材料的扩增产物中的测序结果与日本晴水稻Wx基因序列相同区段使用DNAMAN软件进行比对分析，选取高度同源的保守区段重新设计三对新的引物Wx-YMZA，Wx-YMZB和Wx-YMZC，这三对引物只包含Wx基因前导序列的第一内含子5’端剪切位点的上游55bp处存在一段(CT)n的重复序列以及Wx基因第一内含子5’端+1的+713bp位置处的G/T的碱基突变，该引物扩增的片段差异只与(CT)的重复数有关，且该片段只含一个PCR-AccI酶切位点，该酶切位点的特异性只与G/T的碱基位点有关，三对引物的目的旨在通过 10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳区分扩增产物中(CT)n中n值的变化，不需要引物PCR-Acc I的重新扩增，可直接通过Acc I酶切该引物扩增的产物检测其G/T型的变化(见附图3)。 

根据实验结果筛选出扩增产物以及酶切后产物片段大小合适、电泳结果清晰、多态性较好的引物Wx-YMZC，该引物扩增片段大小约为186bp。 

其正向引物(5＇-3＇)序列：TCACCATTCCTTCAGTTCTT， 

反向引物(5＇-3＇)序列：TCTGAATAAGAGGGGAAACA。 

(4)待查水稻DNA的提取 

参照Murray(1980)的CTAB法提取水稻DNA，并做适当的修改。 

1)在水稻幼叶期，剪取2cm-3cm水稻叶片置于装有钢珠的2mL离心管中，加入700μL2×CTAB提取液。 

2)将离心管装入打样机中，打样研磨5min，至管内叶片呈粉末状，即可停止。若管内叶片仍为较大片状，则可适当延长打样时间，直至叶片破碎为粉末状为止。 

3)将已打好样的离心管置于65℃的水浴锅中水浴1h，期间不断摇动。 

4)取出水浴完全的离心管，并冷却至室温，随后加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)，上下轻柔倒置混匀至管内液体成乳化状(分为三层)，放入离心机中，12000rpm转速离心5min。 

5)轻柔取出离心管，吸取约450μL的上清液，移至对应编号且已灭菌的新1.5mL离心管中，并加入2/3体积已预冷(-20℃)的异丙醇(约300μL)，将离心管上下颠倒数次摇匀后(动作要轻柔)，置于-20℃冰箱30min左右。 

6)将离心管以12000rpm转速离心5min，弃去上清液，加入500μL70％乙醇溶液洗涤沉淀，轻轻摇动使沉淀悬浮。 

7)将离心管以12000rpm转速离心5min，弃去上清液，小心地将离心后带有沉淀的离心管倒扣于吸水纸上，过夜干燥沉淀。 

8)加入经烘箱预先预热的200μL TE缓冲液中，并置于振荡器中震荡溶解沉淀，储藏于4℃备用。 

(5)Wx-YMZC标记的PCR反应及电泳检测 

PCR扩增总体系为10μL，具体成分如下： 

PCR扩增程序见表5： 

表5引物Wx-YMZC的PCR扩增程序 

(6)电泳结果分析 

1.Wx基因中(CT)n类型 

利用分子标记Wx-YMZC对15个供试材料进行基因型分析。共检测出5种不同的(CT)n类型，该结果与测序结果完全一致。具体见图1，图中编号与表2编号一致。 

从电泳结果与测序结果中可以看出，1号为一种带型，其(CT)n类型为(CT)₂₀；2-8为一种带型，其(CT)n类型为(CT)₁₈；9-12为一种带型，其(CT)n类型为(CT)₁₇；13号单独为一种带型，其(CT)n类型为(CT)₁₃；14和15号为一种带型，其(CT)n类型为(CT)₁₁，利用标记Wx-YMZC可使用已知材料的(CT)n类型检测未知材料的(CT)n类型，且条带清晰。 

2.检测Wx基因中G/T的碱基类型 

利用分子标记Wx-YMZC对15份供试材料进行G/T基因型分析。在Wx基因第一内含子5’端+1的+713bp位置处的碱基若为T，则不能被AccI酶酶切， 因而电泳结果为约186bp的单带，即为TT型材料，2-12号即为TT型材料，若+713bp位置处的碱基为G，则被AccI酶酶切为两条带，约137bp和49bp，即为GG型材料，1，13-15即为GG型材料(具体见图2)。