植生链霉菌及其产生新抗生素诺沃巢霉素的方法与应用

摘要

本发明涉及植生链霉菌及其产生新抗生素诺沃巢霉素的方法与应用，植生链霉菌（Streptomyces phytohabitans）HBERC-20821，由其产生新抗生素的方法，植生链霉菌HBERC-20821在严格无菌条件下接入种子培养基中，在28℃，130～160转/分的摇床上培养3～4天，再扩大到同样的种子培养基上，在相同条件下培养1-2天，然后转入发酵培养基中，经4-6天发酵，即可获得含有目标产物的发酵液，经提取，得到两种具有广谱抗真菌活性的物质，经波谱解析，这些活性物质为两个未见报道的新抗生素，分别命名为诺沃巢霉素A、诺沃巢霉素B。两种新抗生素诺沃巢霉素制成不同的剂型即可用于农作物真菌病害的防治，也可能用于畜禽及人类真菌病的治疗。

说明书

技术领域

本发明涉及一种植生链霉菌及其产生新抗生素诺沃巢霉素的方法与应用。 

背景技术

抗生素（或称微生物药物）是由微生物在代谢过程中产生的具有生物活性和特定化学结构的化合物。这里的生物活性指的是抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗肿瘤等活性。自1929年弗莱明发现青霉素以来，作为人类对付疾病的有力武器，抗生素发挥了巨大作用，挽救了无数的生命。如今，以青霉素、头孢霉素、红霉素为代表的抗生素在人类疾病治疗中发挥着无可替代的作用。 

在抗生素发明之初，主要用来防治人类的各类微生物感染。后来，植物病理学家、动物学家等将抗生素用于植物病害、畜禽病害的防治，也取得了巨大的成功，由此而产生了抗生素的新分支----农用抗生素和畜用抗生素。农用抗生素是生物农药中的一类，是由微生物通过液体或固体发酵过程产生的次级代谢产物，它们具有明确的化学结构与确实可靠的杀虫杀菌活性，是一类最有开发前景的农用生物药物。其原因有三：第一，微生物容易大规模培养，且原料为农副产品，易于获取；第二，其使用效果明显，易为市场所接受；第三，其活性谱广，成本低廉。目前我国农用抗生素的市场份额占生物农药的90%以上。 

自第一个抗生素----青霉素发现以来，全世界在八十多年间进行了大量的筛选工作，发现了约3万种抗生素，只有极少部分投入了生产。新抗生素的发现是新药物开发的基础，然而，自然资源是有限的，发现新抗生素的难度越来越大。 

发明内容

本发明的目的是针对上述现状，旨在提供一种植生链霉菌，由其产生的新抗生素诺沃巢霉素的方法与新抗生素在植物病害、畜禽病害的防治中的应用。 

本发明目的的实现方式为，植生链霉菌（Streptomyces phytohabitans），菌种代号为HBERC-20821，保存在中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2013379。 

由植生链霉菌产生两种新抗生素产生两种新抗生素，分别命名为诺沃巢霉素A(Novonestmycin A)、诺沃巢霉素B(Novonestmycin B)， 

诺沃巢霉素A（Novonestmycin A）的化学结构式 

诺沃巢霉素B（Novonestmycin B）的化学结构式 

由植生链霉菌产生新抗生素诺沃巢霉素的方法，具体步骤如下： 

（1）甘油冻存管的制作：取该菌种的斜面菌苔（10×10mm），在严格无菌操作条件下接入种子培养基中，在28℃，130-160转/分的旋转式摇床上培养3-4天，待菌丝长到合适浓度后，按1：1加入事先准备好的40%(W/W)无菌甘油，混合均匀，分装至2毫升冻存管中，置-80℃保存； 

种子培养基配方：甘露醇1-3%、大豆蛋白胨1-3%、酵母浸粉0.3-0.5%、碳酸 钙0.3-0.5%、氯化钠0.3-0.8%。pH值6.5-7.5，每瓶装100mL； 

（2）摇瓶种子准备：取甘油冻存管1支，在严格无菌条件下，接种至装有100毫升种子培养基的容积为500毫升带挡板三角瓶中，在28℃，130—160转/分的摇床上培养3-4天，取样，镜检，得合格菌种；采用发酵罐发酵时，需将种子培养基按接种需要量扩大，由摇瓶种子按10%（V/V）接种，培养条件及方法同摇瓶种子相同，培养时间为1～2天，取样，镜检，得合格菌种； 

（3）发酵：待种子瓶长好以后，按3—10%（V/V）的接种量转入发酵培养基中。摇床转速为130～160转/分，温度为28℃。发酵罐的搅拌速度200—500转/分，培养基的装量为罐体容积的60%—80%；发酵需4-6天，用HPLC检测，待诺沃霉素达到最高产量时即可放罐； 

发酵培养基配方同步骤（2）的种子培养基； 

（4）菌丝体与上清分离：采用高速管式离心机及其它分离设备，将发酵液离心分离为菌丝体和上清液，菌丝体采用乙酸乙酯萃取后浓缩，上清液采用树脂吸附后用溶剂洗脱； 

（5）样品合并：将步骤(4)之菌丝提取物与上清洗脱液合并，蒸去溶剂后，用甲醇溶解； 

（6）产生两种新抗生素：用C18制备色谱柱，粒径5μm，色谱柱直径19mm，长250mm，采用自动进样，每次进样量1000-5000μL，用乙腈和纯水为流动相，梯度洗脱，用Waters2767自动收集系统，收集在16±1分钟流出的组份即为诺沃巢霉素A、20±1分钟流出的组份即为诺沃巢霉素B； 

（7）干燥：收集到的流出液经氮吹仪吹干得到白色诺沃巢霉素A及诺沃巢霉素B粉末。 

制备得到的抗生素含量可达90%左右。需要含量在95%以上的样品时可采用二次制备。 

由植生链霉菌产生的新抗生素的应用，用作制备农用杀菌喷雾剂、种衣剂或拌种剂，医用抗真菌或兽用抗真菌药物。 

附图说明

图1为植生链霉菌的表面特征和孢子丝电镜照片， 

图2为植生链霉菌系统进化树， 

图3为Novonestmycin A的核磁共振碳谱， 

图4为Novonestmycin A的核磁共振氢谱， 

图5为Novonestmycin B的核磁共振碳谱， 

图6为Novonestmycin B的核磁共振氢谱， 

图7为Novonestmycin A的高分辩质谱图， 

图8为Novonestmycin B的高分辩质谱图。 

具体实施方式

本发明由四川瓦屋山采集，编号为S1179的土样，采用通用的放线菌稀释分离法分离出一株放线菌植生链霉菌（Streptomyces phytohabitans），菌种代号为HBERC-20821，保存在中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2013379。保藏日期2013年8月20日，存活证明日期2013年9月6日。 

植生链霉菌HBERC-20821的形态特征如下，菌落直径2-3mm，分散状。基丝无色，后转棕色，直径约0.6-0.8μm；气丝近白色，直径0.8-1.0μm，菌苔表面粉状；孢子丝直形，每链含20-30个杆状孢子，孢子大小1.0×1.5μm。不产生水溶性色素。菌种表面特征见附图1。 

植生链霉菌HBERC-20821的在不同培养基上的培养特征如下： 

表1HBERC-20821的培养特征 

植生链霉菌HBERC-20821的生理生化特征试验结果如下表： 

表2HBERC-20821的生理生化试验结果 

经16S rRNA分析（在Gene bank登录号为KF765441），结合生理生化特征、培养特征，该菌种被鉴定为植生链霉菌（Streptomyces phytohabitans） 

HBERC-20821。图2为根据基因信息构建的系统进化树。 

植生链霉菌产生具有很强抗真菌活性的新抗生素，通过发酵产生诺沃巢霉素的方法，具体步骤如下： 

（1）甘油冻存管的制作：取该菌种的斜面菌苔（10×10mm），在严格无菌操作条件下接入种子培养基中，在28℃，130-160转/分的旋转式摇床上培养3-4天，待菌丝长到合适浓度后，按1：1加入事先准备好的40%(W/W)无菌甘油，混合均匀，分装至2毫升冻存管中，置-80℃保存； 

种子培养基配方：甘露醇1-3%、大豆蛋白胨1-3%、酵母浸粉0.3-0.5%、碳酸钙0.3-0.5%、氯化钠0.3-0.8%。pH值6.5-7.5，每瓶装100mL； 

（2）摇瓶种子准备：取甘油冻存管1支，在严格无菌条件下，接种至装有100毫升种子培养基的容积为500毫升带挡板三角瓶中，在28℃，130—160转/分的摇床上培养3-4天，取样，镜检，得合格菌种；采用发酵罐发酵时，需将种子培养基按接种需要量扩大，由摇瓶种子按10%（V/V）接种，培养条件及方法同摇瓶种子相同，培养时间为1～2天，取样，镜检，得合格菌种； 

（3）发酵：待种子瓶长好以后，按3—10%（V/V）的接种量转入发酵培养基中。摇床转速为130～160转/分，温度为28℃。发酵罐的搅拌速度200—500转/分，培养基的装量为罐体容积的60%—80%；发酵需4-6天，用HPLC检测，待诺沃霉素达到最高产量时即可放罐； 

发酵培养基配方同步骤（1）的种子培养基； 

（4）菌丝体与上清分离：采用高速管式离心机及其它分离设备，将发酵液离心分离为菌丝体和上清液，菌丝体采用乙酸乙酯萃取后浓缩，上清液采用树脂吸附后用溶剂洗脱； 

（5）样品合并：将步骤(4)之菌丝提取物与上清洗脱液合并，蒸去溶剂后，用甲醇溶解； 

（6）产生两种新抗生素：用C18制备色谱柱，粒径5μm，色谱柱直径19mm，长250mm，采用自动进样，每次进样量1000-5000μL，用乙腈和纯水为流动相，梯度洗脱，用Waters2767自动收集系统，收集在16±1分钟流出的组份即为诺沃巢霉素A、20±1分钟流出的组份即为诺沃巢霉素B； 

（7）干燥：收集到的流出液经氮吹仪吹干得到白色诺沃巢霉素A及诺沃巢 霉素B粉末。经紫外和质谱、核磁共振解析，分别命名为诺沃巢霉素A(Novonestmycin A)、诺沃巢霉素B(Novonestmycin B)。Novonestmycin A核磁共振碳谱见图3，核磁共振氢谱见图4，高分辩质谱图见图7；Novonestmycin B的核磁共振碳谱见图5，核磁共振氢谱见图6，高分辩质谱图见图8。 

诺沃巢霉素A（Novonestmycin A）的化学结构式 

诺沃巢霉素B（Novonestmycin B）的化学结构式 

诺沃巢霉素A及诺沃巢霉素B用高效液相色谱仪（HPLC）检测，检测条件是：采用Sunfire C18反相柱，进样量2μL，流速0.3ml/分，流动相采用乙腈和纯水，其中分别加入0.2%的乙酸（V/V），梯度洗脱，检测器为二极管阵列检测器（PAD），扫描波长200-500nm，运行时间40分钟。洗脱条件见表3： 

表3色谱柱洗脱条件 

制备得到的抗生素含量可达90%左右。需要含量在95%以上的样品时可采用二次制备。 

含量在90%及以上的抗生素样品可作为标准品，用于发酵效价及产品含量分析。 

当需要分离的产物量达10克以上时，可采用硅胶柱柱层析，具体步骤是： 

（1）采用直径10-50mm的玻璃柱，径高比为1：10-30。将硅胶用足量乙酸乙酯湿润，搅拌均匀，装入玻璃柱中，用乙酸乙酯洗下壁上的硅胶，静置30分钟以上，放出多余的溶剂备用。 

（2）样品准备：将待分离样品用甲醇溶解，加入4-5倍量（V/W）硅胶，搅匀，挥去溶剂。 

（3）上样：将硅胶与样品的混合物小心加入柱中，正好在液面上。 

（4）梯度洗脱：依次用100%石油醚、石油醚：乙酸乙酯=80：20、60：40、50：50、40：60进行洗脱，每种洗脱液体积为硅胶柱体积的3-5倍，按硅胶柱体积收集洗脱液。第17～19管为诺沃巢霉素B、第23～25管为诺沃巢霉素A。 

诺沃巢霉素具有强烈的抗真菌活性，实验室活性测定结果，其对水稻纹枯病、小麦赤霉病、棉花枯黄萎病等具有很强抑制作用。活性测定结果见表4： 

表4诺沃巢霉素的抗真菌活性 

由此可见，由植生链霉菌产生的新抗生素可用作制备农用杀菌喷雾剂、种衣剂或拌种剂，医用抗真菌或兽用抗真菌药物。 

在农业上大规模应用两种新抗生素时，可采用简单浓缩工艺。 

（1）发酵。采用通用三级至四级工业发酵法，最大发酵体积可达上百吨； 

（2）发酵液预处理：在发酵完成后，用稀酸将发酵液pH调整到4-5，然后进行板框过滤，得到上清液和菌丝体两部分。本抗生素主要存在于上清液中，其含量占总量的60%左右，菌丝中的产物量为总量的40%； 

（3）上清液的处理：采用膜浓缩设备将上清液浓缩5-10倍后，加入防腐剂、稳定剂、表面活性剂，即可制成液剂产品。 

可用的防腐剂有：苯甲酸钠、山梨酸钾等。 

稳定剂有：黄原胶、琼脂等。 

表面活性剂有：吐温80、1231等。 

上述提取物经剂型化处理后，通过含量测定，即可投入实际使用。植生链霉菌通过发酵产生的诺沃巢霉素，用作制备农用杀菌剂，医用抗真菌或兽用抗真菌药物。 

下面用具体实施例详述本发明。 

实例1：由四川瓦屋山采集，编号为S1179的土样，采用放线菌稀释分离法分离出一株放线菌植生链霉菌（Streptomyces phytohabitans），菌种代号为HBERC-20821。 

分离步骤： 

（1）称取土样1克，放入带有玻璃珠的150ml三角瓶中，加入无菌水（内含1%酵母浸出液），置摇床上180转/分振荡1小时。 

（2）取上述土样溶液1ml，加入无菌水9ml，振荡均匀。此为10倍稀释，记为10^-1。 

（3）将土样按（2）的方法进行10倍系列稀释，直至10^-4。 

（4）取系列稀释样品，10^-2、10^-3、10^-4各0.1ml，分别滴入不同的分离培养基平板，涂匀。培养基为ISP-2（酵母浸粉4克，麦芽浸粉10克，葡萄糖4克）等配方。 

（5）将上述平板在28℃条件下培养20～30天，挑取单个菌落，转入ISP-2斜面，继续培养7天，得到15株放线菌，其中1株编号为HBERC-20821，经发酵，产生具有良好抗真菌活性的物质。 

由植生链霉菌产生两种新抗生素的发酵采用摇瓶发酵方式， 

（1）甘油冻存管的制作：取该菌种的斜面菌苔（10×10mm），在严格无菌操作条件下接入种子培养基中，在28℃，130-160转/分的旋转式摇床上培养3-4天，待菌丝长到合适浓度后，按1：1加入事先准备好的40%(W/W)无菌甘油，混合均匀，分装至2毫升冻存管中，置-80℃保存； 

种子培养基配方：甘露醇1%、大豆蛋白胨1%、酵母浸粉0.3%、碳酸钙0.3%、氯化钠0.3%。pH值6.5-7.5，每瓶装100mL； 

（2）摇瓶种子准备：取甘油冻存管1支，在严格无菌条件下，接种至装有100毫升种子培养基的容积为500毫升带挡板三角瓶中，在28℃，130转/分的摇床上培养3-4天，取样，镜检，得合格菌种； 

（3）发酵：待种子瓶长好以后，按10%（V/V）的接种量转入摇瓶发酵培养基中（即每个摇瓶接种10ml种子）。摇床转速为130转/分，温度为28℃。经4天发酵，诺沃巢霉素达到最高产量，结束发酵。 

发酵培养基配方同步骤（1）的种子培养基； 

（4）菌丝体与上清分离：采用冷冻离心机，将发酵液离心分离为菌丝体和上清液，菌丝体采用乙酸乙酯萃取后浓缩，上清液采用树脂吸附后用溶剂洗脱； 

（5）样品合并：将步骤(4)之菌丝提取物与上清洗脱液合并，蒸去溶剂后，用甲醇溶解，得样品20ml； 

（6）诺沃霉素制备：用C18制备色谱柱，粒径5μm，色谱柱直径19mm，长250mm，每次进样量3000μL，用乙腈和纯水为流动相，梯度洗脱，用Waters2767自动收集系统，收集在16±1分钟流出的组份即为诺沃巢霉素A、20±1分钟流出的组份即为诺沃巢霉素B； 

（7）干燥：收集到的流出液经氮吹仪吹干得到白色诺沃巢霉素A及诺沃巢霉素B粉末。 

实例2：同实施例1，不同之处 

由植生链霉菌产生两种新抗生素的发酵采用20升发酵罐， 

（1）甘油冻存管的制作：在种子培养基配方。 

种子培养基配方：甘露醇2%、大豆蛋白胨2%、酵母浸粉0.4%、碳酸钙0.4%、氯化钠0.5%。pH值6.5-7.5，每瓶装100mL； 

（2）摇瓶种子准备：由于发酵体积较大，需将种子扩大，以满足接种量需求。由摇瓶种子按10%（V/V）接种，培养条件及方法同摇瓶种子相同，但培养时间为1～2天，取样，镜检，得合格菌种； 

（3）发酵：待种子瓶长好以后，按5%（V/V）的接种量转入发酵罐中，培养基的装量为12升。发酵罐的搅拌速度500转/分，温度28℃，发酵5天时，用HPLC检测，诺沃霉素达到最高产量，放罐； 

发酵培养基配方同步骤（1）的种子培养基； 

（4）菌丝体与上清分离：采用高速管式离心机，将发酵液离心分离为菌丝体和上清液，菌丝体采用乙酸乙酯萃取后浓缩，上清液采用树脂吸附后用溶剂洗脱； 

（5）样品合并：将步骤(4)之菌丝提取物与上清洗脱液合并，蒸去溶剂后，用甲醇溶解； 

（6）诺沃霉素制备：用C18制备色谱柱，粒径5μm，色谱柱直径19mm，长250mm，每次进样量4000μL，用乙腈和纯水为流动相，梯度洗脱，用Waters2767自动收集系统，收集在16±1分钟流出的组份即为诺沃巢霉素A、20±1分钟流出的组份即为诺沃巢霉素B； 

（7）干燥：收集到的流出液经氮吹仪吹干得到白色诺沃巢霉素A及诺沃巢霉素B粉末。 

实例3：同实例2，不同之处在于 

由植生链霉菌产生两种新抗生素的发酵采用50升发酵罐 

（1）发酵培养基配方为：甘露醇3%，大豆蛋白胨3%，酵母提取物0.5%，碳酸钙0.5%，氯化钠0.8%。pH值6.5～7.5； 

（2）摇床转速为160转/分，发酵罐转速为200转/分； 

（3）发酵罐装量为30升； 

（4）发酵结束后，用高速管式离心机离心，得上清液和菌丝体。最后得诺沃霉素粗提取物400克，其中含有两种抗生素。