链霉菌产生的苯安莎类抗生素新组分及其他新次级代谢产物的发现与探索

摘要

微生物次级代谢产物具有多种多样的化学结构与生物活性，且类药性强，为创新药物的重要来源。迄今，已知大多数微生物药物来自放线菌，其中又以链霉菌为主。因此，对链霉菌产生的次级代谢产物进行挖掘是发现创新药物研究的一个重要途径。 本论文分为两部分，第一部分为链霉菌产生的苯安莎类抗生素（GDM与除草霉素A）新组分的发现与鉴定，第二部分为链霉菌产生的新抗生素或新组分发现探索。 GDM是由吸水链霉菌产生的苯安莎类抗生素，它具有显著的抗肿瘤活性，但是由于其严重的肝毒性及较差的水溶性，使其在抗癌药物研发中只能作为先导化合物;寻找高水溶性、低肝毒性的GDM衍生物成为开发此类药物的研究热点。在通过化学半合成得到的数百个GDM衍生物中，17-AAG和17-DMAG已进入临床试验，用于多种肿瘤治疗。 微生物次级代谢产物结构的复杂性，往往导致次级代谢产物在生物合成过程中产生一组结构相似的类似物，此即抗生素的多组分现象。近年来，从不同的GDM产生菌中，也陆续有一些天然GDM类似物的发现报道，其中有些类似物在水溶性或抗肿瘤细胞活性方面相对于GDM有所改善或提高，显示了较好的抗肿瘤药物开发潜能。 吸水链霉菌17997(Streptomyces hygroscopicus17997)是中国医学科学院医药生物技术研究所分离鉴定的一株GDM产生菌。我们通过TLC和LC-DAD-MS法对该菌株发酵产物进行跟踪分析，发现一个GDM新组分，经分离纯化后，利用NMR、Mosher法及ECD等确定其结构为19-[(1'S,4'R)-4'-羟基-1'-甲氧基-2'-氧代戊基]格尔德霉素（化合物713）。此外，我们还在吸水链霉菌17997的gdmP基因阻断变株中发现并鉴定了化合物713的4，5双氢形式—19-[(1'S,4'R)-4'-羟基-1'-甲氧基-2'-氧代戊基]-4，5双氢格尔德霉素（化合物715）。与GDM相比，化合物713和715的抗肿瘤细胞活性分别降低了约50倍和80倍，但水溶性提高了数千倍。 除草霉素A是一个在化学结构方面与GDM非常类似的苯安莎类抗生素，也是由吸水链霉菌产生。在抗肿瘤药物研究中，除草霉素A及其类似物也受到一定的重视。我们通过在培养基中补充甲硫氨酸，从除草霉素A产生菌—吸水链霉菌N02Z-0421（S.hygroscopicus N02Z-0421）中，分离纯化、NMR鉴定了一个除草霉素A新组分—17，19-二甲硫基除草霉素A。初步的抗肿瘤细胞活性测定显示，该新组分与除草霉素A基本相当。此外，17，19-二甲硫基除草霉素A的获得，也为本实验室阐明19-S-甲基格尔德霉素中的甲硫基化机制以及甲硫基的来源（甲硫氨酸分解代谢产生甲硫醇，甲硫醇与格尔德霉素经迈克尔加成反应生成19-S-甲基格尔德霉素），提供了重要的佐证。 吸水链霉菌17997具有丰富的次级代谢产物合成能力，它不仅产生GDM及其类似物，还产生一些有待鉴定的抗革兰阳性菌化合物。在我们对链霉菌产生的新抗生素或新组分发现探索研究中，我们首先对该菌株产生的抗革兰阳性菌化合物进行了研究:从该菌株的次级代谢产物中，鉴定了洋橄榄叶素。洋橄榄叶素具有抗菌、抗肿瘤和抗原虫等多种生物学活性。在鉴定洋橄榄叶素的过程中，我们建立了一种快速鉴定洋橄榄叶素及其产生菌的方法，主要包括TLC硅胶板分离和NaOH溶液喷雾显色、HPLC和LC-DAD-MS分析，以及洋橄榄叶素生物合成保守基因的PCR检测与序列分析;其中，NaOH溶液喷雾显色为首次报道。在链霉菌新次级代谢产物的发现研究中，洋橄榄叶素是需要早期鉴别或排除的一个假阳性化合物。我们已经成功地将NaOH溶液喷雾显色用于洋橄榄叶素的早期快速鉴别。 利用中国药用微生物菌种保藏中心丰富的菌种资源，我们在对多株从我国土壤中分离的链霉菌菌株进行初步分析的基础上，选出2株具有显著抗菌活性、产生丰富次级代谢产物的链霉菌菌株，进行新抗生素或新组分的挖掘探索。 首先，链霉菌CPCC200002。我们通过TLC及LC-DAD-MS分析法，对该菌株产生的5个具有抗菌活性的次级代谢产物进行了鉴定，分别为硫藤黄菌素、硫藤黄菌素氧化物、金丝菌素及丁酰-pyrrothine或异丁酰-pyrrothine(002-1～002-5)。这5个化合物均属于dithiolopyrrolone类抗生素，该类抗生素最初以其显著的抗微生物活性受到关注，后来研究发现它们还具有较强的抗肿瘤活性。最近，发现新结构的该类化合物受到关注，以及阐明了该类抗生素生物合成与半胱氨酸紧密相关。 硫藤黄菌素类化合物是两个半胱氨酸分子的缩合产物。作为半胱氨酸的类似物，我们在CPCC200002的培养过程中添加高半胱氨酸，希望硫藤黄菌素的生物合成酶系能够识别并利用高半胱氨酸，产生新的硫藤黄菌素类似物。遗憾的是，我们没有检测到新化合物，只是看到金丝菌素等上述5个化合物生物合成水平的提高。 其次，链霉菌CPCC203577。我们通过TLC及LC-DAD-MS等方法对该菌株产生的具有显著抗菌活性的蓝色化合物进行了鉴定，为衣草花青菌素及其类似物(1032-A～F)。衣草花青菌素属于吩嗪类抗生素。氯苯吩嗪是已知的临床应用的抗麻风杆菌药物;天然或化学合成的一些吩嗪类抗生素是抗炎或麻风杆菌的药物开发候选物。 经天然产物化合物库、SciFinder数据库及文献检索排重后，确定衣草花青菌素类似物1032-C、1032-D和1032-F为衣草花青菌素新组分，相关化合物的分离纯化和结构鉴定等正在进行中。

目录

声明

摘要

前言

链霉菌产生多种多样次级代谢产物

苯安莎类抗生素

本课题研究目的及意义

本课题研究内容及方案

参考文献

第一部分 苯安莎类抗生素新组分的发现与鉴定

1 吸水链霉菌17997及其gdmP基因阻断变株产生的天然格尔德霉素新组分研究

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．3 结果与分析

1．4 讨论

2 吸水链霉菌N02Z-0421产生的甲硫基除草霉素A的鉴定

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 结果与分析

2．4 讨论

第二部分 链霉菌新抗生素或新组分发现探索—3株链霉菌次级代谢产物研究

1 快速鉴定吸水链霉菌17997产生的洋橄榄叶素

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．3 结果与分析

1．4 讨论

2 链霉菌CPCC 200002产生的硫藤黄菌素及其类似物的LC-DAD-MS鉴别

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 结果与分析

2．4 讨论

3 链霉菌CPCC 203577产生的衣草花青菌素及其新组分的LC-DAD-MS鉴别

3．1 实验材料

3．2 实验方法

3．3 结果与分析

3．4 讨论

参考文献

全文总结与创新点

链霉菌产生的新次级代谢产物研究综述

英文缩略语(Abbreviation)

附录

致谢

博士在读期间发表的学术论文