乳酸链球菌素抗性乳酸杆菌突变株减少食物产品中后酸化的用途

摘要

本发明涉及乳酸链球菌素抗性乳酸杆菌和它们用于制备后酸化减少的食物产品的用途。

说明书

本发明涉及减少食物产品中的后酸化(post-acidification)。 

在保藏、尤其贮存和转运含有活微生物的食物产品期间，微生物代谢活性主要表现为产酸，产酸导致产品质量劣化，尤其导致在货架期结束时味道过酸。这种酸化机制称作后酸化并且为人所熟知。在其中未添加额外糖或香料的产品中，这尤其是个问题。 

为减少这种现象，产品不得不贮存在低温，例如在10℃。在新兴国家中，它不可能总是贮存在低温并且确保完整的冷链，这具有食物产品货架期大幅度缩减的缺点。 

另外，防止后酸化也是食品工业的一项重要事务。 

截至目前，已经报道了通过减少起始物(starter)培养物中活性细胞的数目或通过巴斯德消毒消除成品中的活细胞，来减少产酸的许多尝试。在这些研究的某些中，已经显示，由培养基中乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)分泌的抗菌物质-乳酸链球菌素(nisin)阻抑细菌起始物的生长，控制酸的形成。在EP0505164中，可以通过向生乳添加属于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的产生乳酸链球菌素的乳酸细菌连同待用于发酵生乳的其他乳酸细菌，制造发酵乳。发酵乳中产生和积累的乳酸链球菌素阻抑造成酸形成的细菌生长，从而控制贮存和转运期间的酸度增加。Kalra等人(Indian Journal of Dairy Science28:71-72(1975))在发酵之前掺入产生乳酸链球菌素的乳酸链球菌(Streptococcus lactis)(现在称作乳酸乳球菌乳酸亚种)培养物连同酸奶培养物。其他人在发酵之前(ayoumi,Chem.mikrobiol.technol.lebensm.13:65-69(1991))或发酵之后(Gupta等人,Cultured Dairy Products Journal23:17-18(1988)；Gupta等人,Cultured Dairy Products Journal23:9-10(1989))在乳中加入乳酸链球菌素。在所述全部情况下，通过这些处理仅部分地抑制后酸化的速率，但发酵乳继续在其整个货架期变得更酸。曾尝试通过酸奶培养物、通过在乳发酵之前或之后添加乳酸链球菌素或产生乳酸链球菌素的培养物阻止酸产生，当仍未成功。如上文提到，这种使用影响了对食物工业具有巨大 意义的活细菌。具体而言，已经报道干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)群的菌株具有促进健康的特性，并且在不同的食物产品中用作益生菌。另外，在生产酸奶的情况下，为了保存正宗(denomination)“酸奶”，不可能添加产生乳酸链球菌素的培养物(乳酸乳球菌)。 

第二，现有技术中描述过几个低酸化菌株，用以控制新鲜发酵产品的酸化和后酸化。 

后酸化基本上因细菌利用产品中剩余的乳糖产生。为了防止后酸化，已经提出使用不发酵或很少发酵乳糖的乳酸细菌菌株。专利EP1078074和EP1893032公开了在贮存期间不再能够发酵乳糖或发酵能力低的乳酸细菌。分别地，专利EP1078074涉及β-半乳糖苷酶活性缺陷的保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)突变体，该突变体包含在乳糖操纵子的至少一个基因中的无义突变，专利EP1893032涉及因乳糖通透酶上的突变而在其乳糖转运活性方面被修饰的突变体。然而，这些解决方案都不能用于发酵植物或水果产品，或用于含除乳糖之外的其他糖的乳产品。 

EP1802652公开了通过操控氨基酸浓度而在发酵过程结束时减少乳酸细菌菌群的方案。但是，这种方案的代价是必须添加氨基酸或特定肽以显示乳酸细菌的良好生长。这种方案仅显示用于嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)，这限制了应用。 

在JP7236416中，形成一种方案，该方案使用具有改变的H⁺-ATP酶活性的乳酸细菌新霉素抗性突变体。当细菌不再能够在培养基和细胞胞质之间产生pH梯度时，认为它们停止了酸化。然而，就安全性而言，使用抗生素抗性细菌总是遭到质疑。通常，抗生素抗性是菌株选择过程期间放弃菌株的一项标准。 

目前的所有解决方案根据应用类型而存在不同的优点和缺点。因此，避免过多后酸化的解决方案仍受欢迎，以便对不同的物种使用不同的方案减少后酸化。 

本发明人令人惊讶地发现，在食物产品中添加来自乳酸细菌，尤其来自瑞士乳杆菌(L.helveticus)和保加利亚乳杆菌的乳酸链球菌素抗性突变体时，后酸化减少。 

本发明的一个目的是在食物产品中使用至少一个乳酸链球菌素抗性突变 体减少后酸化。 

本发明的另一个目的是提供一种用于减少食物产品中后酸化的方法和通过这种方法可获得的食物产品。 

本发明涉及乳酸链球菌素抗性乳酸杆菌的至少一种菌株用于减少食物产品中后酸化的用途。 

术语“乳酸杆菌”指乳杆菌属(Lactobacillus subsp.)的全部物种。它们代表乳酸细菌中在工业水平上的重要部分并且特别与嗜热链球菌组合用于乳产品的发酵。它们也作为益生菌用于几种食物产品中，以便产生促进健康的特性(Lebeer等人,2008)[参考文件：Lebeer S.,Vanderleyden J.,and De Keersmaecker S.C.J.Genes and molecules of lactobacilli supporting probiotic action(支持益生作用的乳酸杆菌基因和分子).Microbiology And Molecular Biology Reviews,Dec.2008,72(4),第728-764页]。 

乳酸杆菌一般选自由以下组成的组：瑞士乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种(L.delbrueckii subsp.bulgaricus)、德氏乳杆菌德氏亚种(L.delbrueckii subsp.delbrueckii)、德氏乳杆菌乳酸亚种(L.delbrueckii subsp.lactis)、干酪乳杆菌(L.casei)、类干酪乳杆菌(L.paracasei)、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、植物乳杆菌(L.plantarum)、路氏乳杆菌(L.reuteri)、短乳杆菌(L.brevis)和发酵乳杆菌(L.fermentum)。 

优选地，乳酸杆菌属于瑞士乳杆菌种、德氏乳杆菌种和它们的亚种，尤其德氏乳杆菌保加利亚亚种。 

特别优选的乳酸杆菌选自CNCM I-4452、CNCM I-4453和CNCM I-4454。 

本发明中所用的乳酸杆菌优选地从选自保加利亚乳杆菌CNCM I-2836和瑞士乳杆菌CNCM I-3435的母菌株获得。 

在本发明中，所用的乳酸杆菌优选地是活细菌。在本发明中，术语“活的”指这样的乳酸杆菌，其在使用时和在产品中活着直至产品货架期结束，尤其直至10℃温度保持28日时。这是重要的，尤其在酸奶中，对于酸奶，官方指导原则(国际食物产品法典(由FAO和ODM主持下的国际食物产品法典委员会准备，并由FAO的国际分委员会公布，网址 http://www.codexalimentarius.net)要求，如果某产品以活形式按至少1* 10⁷cfu/g乳酸部分的量含有至少一种嗜热链球菌菌株和至少一种保加利亚乳杆菌菌株，将它命名为酸奶。 

更特别适用于本发明中的乳酸杆菌菌株具有至少6.25μg/ml M.I.C、尤其至少12.5μg/ml M.I.C的乳酸链球菌素抗性。术语“MIC”限定最小抑制浓度并且在本文中表示在过夜孵育后抑制乳酸杆菌生长的乳酸链球菌素最低浓度。MIC可以通过几种熟知方法如在液体或固体培养基中的微量稀释方法确定(Klare等人,2005)。参考文献：Ingo Klare,Carola Konstabel,Sibylle Müller-Bertling,Rolf Reissbrodt,Geert Huys,Marc Vancanneyt,Jean Swings,Herman Goossens和Wolfgang Witte,Evaluation of New Broth Media for Microdilution Antibiotic Susceptibility Testing of Lactobacilli,Pediococci,Lactococci,and Bifidobacteria,Applied and Eenvironmental Microbiology,2005,8982-8986,71(12)。 

如本领域熟知，乳酸链球菌素是由一些乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)菌株产生的食品级抗微生物肽---毛硫抗生素(lantibiotic)，并且针对宽范围的革兰氏阳性细菌有活性。乳酸链球菌素已经在食物工业中占据重要地位，其中将它用来控制腌制食品中孢子形成者的生长和乳产品中不需要的微生物菌群的的生长。 

在本发明中，乳酸链球菌素不是如上文提到那样使用，而是作为选择性试剂用于选择具有低后酸化特性的菌株。如本文所用，术语“乳酸链球菌素抗性乳酸杆菌”表示针对乳酸链球菌素存在下的生长所选择的菌株。换而言之，从野生型乳酸杆菌的培养物分离的能够在乳酸链球菌素存在下生长的菌株。 

在本发明中，术语“食物产品”表示选自乳产品(dairy products)、果汁(fruit juices)、植物产品(vegetable products)、婴儿配方食品(infant formulas)、奶粉(milk powders)的产品。 

根据一个具体实施方案，将食物产品发酵。“发酵的食物产品”是已经经历至少一个发酵步骤的产品。 

根据一个具体实施方案，发酵产品选自发酵乳产品、发酵果汁、发酵植物产品。 

术语“发酵果汁”指通过发酵从果汁，尤其橘汁、苹果汁、柠檬汁、梨汁获得的产品。 

术语“发酵植物产品”指通过发酵从包括大豆汁、燕麦汁和米汁在内的植物汁或通过发酵植物乳源或植物固态发酵所获得的产品。 

根据一个更具体的实施方案，发酵乳产品选自酸奶、发酵乳、发酵婴儿乳、发酵饮料。术语“发酵乳”和“酸奶”具有乳品工业中赋予它们的一般含义，即意在用于动物消费，更具体地用于人类消耗并且源自乳品物质(动物乳、尤其牛乳)的酸化乳酸发酵的产品。所述产品可以含有次要成分，如果实、植物、糖、香料、淀粉、增稠剂等，条件是这些成分适合于人或动物消费。更具体地，正宗“发酵乳”(1988年12月30日法令第88-1203号)是指用脱脂乳或不用脱脂乳或用炼乳或某些粉末所制备的乳产品，其已经接受至少等同于巴斯德消毒的热处理并且用产生乳酸的微生物(如乳酸杆菌(嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、路氏乳杆菌、约氏乳杆菌(L.johnsonii))，某些链球菌(嗜热链球菌)，双歧杆菌(两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、长双歧杆菌(B.longum)、短双歧杆菌(B.short)、动物双歧杆菌(B.animalis))和乳球菌)接种。另外，术语“酸奶”(yoghourt)是指使用标准方法，通过开发命名为保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)(又命名为德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus))和嗜热链球菌的特定嗜热乳酸细菌所获得的发酵乳，其中所述特定嗜热乳酸细菌必须在成品中以每克产品(表示为产品的乳酸部分)至少1.107cfu嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的量是活的。 

优选地，根据本发明，发酵食物产品用乳酸链球菌素抗性乳酸杆菌的至少一种菌株发酵。 

根据一个更具体的实施方案，食物产品包含选自链球菌属(Streptococcus spp.)；乳杆菌属(Lactobacillus spp.)，尤其保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌；瑞士乳杆菌，乳球菌属(Lactococcus spp.)和双歧杆菌属(Bifidobacterium spp.)的其他活细菌。 

根据一个具体实施方案，食物产品在至少20日、尤其至少28日的贮存期间在室温，或在从0℃至25℃的温度，更具体地在从4℃至10℃的温度，更具体地在从6℃至8℃的温度。食物产品可能在0℃和25℃之间的温度和在室温交替贮存或按相反方式贮存。在后一种情况下，冷链受到破坏。 

根据本发明，与不使用乳酸链球菌素抗性乳酸杆菌的食物产品相比，食物产品具有减少的后酸化。表述“减少后酸化(或后酸化减少)”表示乳酸链球菌素抗性乳酸杆菌在食物产品贮存期间产生较少酸的能力。在本发明中，乳酸链球菌素抗性乳酸杆菌具有比衍生它的母菌株更低的后酸化作用。在相同贮存条件(在4℃贮存28日)下，ΔpH(第0日(D0)pH和第28日(D28)pH之间的差异)在母菌株的情况下处于0.3级别，ΔpH在突变株的情况下处于0.1至0.2级别。 

根据本发明，后酸化减少是ΔpH减少至少0.1pH单位(upH)、尤其0.2upH。 

本发明还涉及一种用于减少食物产品中后酸化的方法，其中所述方法包括在食物基质中添加乳酸链球菌素抗性乳酸杆菌的至少一种菌株的步骤。 

表述“食物基质(food matrix)”表示添加乳酸链球菌素抗性乳酸杆菌之前的食物产品，尤其表示选自乳产品、果汁、植物产品、婴儿配方食品、奶粉的产品。 

在一个有利的实施方案中，在本发明的方法中，乳酸杆菌选自由以下组成的组：瑞士乳杆菌、干酪乳杆菌、类干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、路氏乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、德氏乳杆菌乳酸亚种、德氏乳杆菌德氏亚种、短乳杆菌和发酵乳杆菌。 

在一个更有利的实施方案中，在本发明的方法中，乳酸杆菌选自CNCM I-4452、CNCM I-4453和CNCM I-4454。 

在一个具体实施方案中，在本发明的方法中，菌株具有至少6.25μg/ml M.I.C、尤其至少12.5μg/ml M.I.C的乳酸链球菌素抗性。 

根据优选实施方案，在本发明的方法中，在发酵食物产品的发酵步骤期间、之前或之后进行乳酸链球菌素抗性乳酸杆菌的添加。在非发酵产品的情况下，在贮存之前添加乳酸链球菌素抗性乳酸杆菌。 

根据一个具体实施方案，发酵产品选自发酵乳产品、发酵果汁和发酵植物产品。 

根据一个更优选的实施方案，在本发明的方法中，发酵在至少一种其他活细菌存在的情况下实施。 

所述活细菌选自由以下组成的组：链球菌属；乳杆菌属，尤其保加利亚 乳杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌；瑞士乳杆菌，乳球菌属和双歧杆菌属。 

根据一个优选实施方案，本发明的方法包括以下步骤： 

a)产生乳酸链球菌素抗性乳酸杆菌的菌株， 

b)用步骤a)中获得的菌株接种食物基质， 

c)在从4℃至50℃的温度发酵接种的食物，直至达到所需的目标pH， 

d)在从4℃至40℃的温度在至少28日期间回收和贮存步骤c)中获得的产品。 

根据一个具体实施方案，目标pH值在3.6至5.0之间。 

本发明还涉及通过本发明方法可获得的食物产品。 

本发明的产品优选地是发酵乳产品。 

本发明还涉及根据布达佩斯条约在2011年3月10日以编号I-4452保藏于巴斯德研究所的CNCM(National Collection of Microorganism Cultures，法国国家微生物保藏中心，地址为：巴斯德研究所，25RUE DU DOCTEURROUK，75724，巴黎，CEDEX15))的保加利亚乳杆菌突变株。 

本发明还涉及在2011年3月10日以保藏号I-4453保藏于CNCM的保加利亚乳杆菌突变株和在2011年3月10日以保藏号I-4454保藏于CNCM的瑞士乳杆菌突变株。这些菌株分别源自保加利亚乳杆菌CNCMI-2836(2002年4月4日保藏于CNCM)和瑞士乳杆菌CNCM I-3435(2005年5月25日保藏于CNCM)。突变株CNCM I-4452、4453和4454具有至少6.25μg/ml M.I.C、尤其至少12.5μg/ml M.I.C的乳酸链球菌素抗性。 

本发明还涉及保加利亚乳杆菌和瑞士乳杆菌的突变株，其特征在于所述突变株具有至少6.25μg/ml M.I.C、尤其至少12.5μg/ml M.I.C的乳酸链球菌素抗性。 

本发明因此涉及包含如上文所述的至少一种突变株的乳酸发酵物(起始物)。根据一个具体实施方案，本发明的乳酸发酵物包含保加利亚乳杆菌和/或瑞士乳杆菌的至少一种突变株，其与至少一个其他乳酸细菌菌株(例如链球菌属物种；乳杆菌属物种，尤其保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌；瑞士乳杆菌，乳球菌属物种和双歧杆菌属物种)组合。 

附图 

通过以下附图说明本发明。 

图1：图1代表菌株CNCM I-2836和克隆I-4452和I-4453的酸化作用的动力学。纵坐标对应于pH，横坐标对应于时间(以小时为单位)。黑色线对应于菌株保加利亚乳杆菌CNCM I-4452。灰色线对应于菌株保加利亚乳杆菌CNCM I-4453。圆点灰线(其因大量数字或实验点而产生刻度灰线)对应于菌株保加利亚乳杆菌CNCM I-2836。 

图2：图2代表贮存28日后3种新鲜乳产品(具有I-2836、I-4453或I-4452)的pH和酸度的量值。直方图代表在第28日测量的酸度(以°D为单位)，曲线代表在第28日测量的pH。 

实施例

以下参考实施例解释本发明，所述实施例仅起到说明作用并不旨在限制本发明。 

实施例1：获得乳酸链球菌素抗性乳酸杆菌

本申请中选择的母菌株，I-2836和I-3435，是在贮存期间显示显著后酸化的用于制造发酵乳的工业菌株。 

1)评价保加利亚乳杆菌和瑞士乳杆菌对乳酸链球菌素的灵敏度

为评价菌株保加利亚乳杆菌I-2836和瑞士乳杆菌I-3435的乳酸链球菌素敏感度，将所述菌株在一系列含有渐增量乳酸链球菌素的MRS管中培育。在37℃培养16小时后，测量每种培养物的光密度。 

2)获得乳酸链球菌素抗性乳酸杆菌

在含有抑制浓度的乳酸链球菌素的MRS培养基中培育菌株保加利亚乳杆菌I-2836和瑞士乳杆菌I-3435。在37℃培养16小时后，将10ml培养物离心。将沉淀物悬浮于100μL蛋白胨-盐水溶液中并喷涂在陪替氏培养皿中的琼脂MRS培养基上。将一条吸墨纸置于平板的中部并随后用2.5mg/ml的15μl乳酸链球菌素溶液浸透。在37℃孵育72小时后，在吸墨纸盘周围的抑菌圈内出现抗性克隆。回收最靠近纸盘的克隆用于分析。注意，在液体培养基中使用渐增量的乳酸链球菌素浓度测试它们对乳酸链球菌素的敏感度。 

获得的全部克隆，尤其I-4452和I-4453和I-4454具有至少6.25μg/mlμM的最小抑制浓度。这种MIC证实克隆对乳酸链球菌素的抗性。 

随后通过在乳中发酵测试获得的克隆I-4452和I-4453。酸化动力学提供有关这些克隆的乳酸化能力的信息。 

3)源自菌株I-2836的克隆在乳中的酸化动力学

a)制备新鲜乳产品 

起始培养接种物由以下组成： 

-菌株I-4452 

-菌株I-4453 

-菌株I-2836 

菌株在含有6.25μg乳酸链球菌素/ml的MRS培养基中培育2次。 

在100ml灭菌乳(135g/L奶粉和2g/l酵母提取物)中制备起始物。接种率是2%并且将乳在44℃温育直至多恩酸度达到70。将发酵乳在4℃贮存一夜。 

由用以上混合培养物接种的100ml灭菌乳制备乳产品。将培养物在44℃培育直至它们达到pH值约4.75。随后将它们冷却至4℃并且在28日期间在4℃贮存。 

b)酸化动力学的跟踪 

酸化动力学用允许连续测量pH值的CINAC系统(Ysebaert，法国)连续跟踪。 

可以从图1看出，克隆的酸化动力学比母菌株I-2836慢； 

4)新鲜乳产品贮存28日后pH和酸度的量值

对含有源自菌株I-2836的2种克隆(I-4452和I-4453)的3种新鲜乳产品和含有菌株I-2836的1种种新鲜乳产品进行测量。 

在4℃贮存28日后测量的酸度 

在2图中显示这些结果。 

具有乳酸链球菌素抗性乳酸杆菌的产品在28日后仅显示弱的后酸化。