一种提高水中人源隐孢子虫特异性的方法以及评价水中人源隐孢子虫活性的方法

摘要

本发明涉及一种提高水中人源隐孢子虫特异性的方法以及评价水中人源隐孢子虫（Cryptosporidium hominis）活性的方法，该方法利用荧光定量PCR（quantitative PCR，qPCR）技术并结合叠氮类染色剂叠氮溴化丙锭（propidium monoazide，PMA）评价水中人源隐孢子虫的活性，对添加PMA染料的样品进行强光照射，构建目的基因以及引物，并进行qPCR反应，检测具有活性的人源隐孢子虫。该方法提高了检测的灵敏度和特异性，简化了操作步骤，缩短了检测时间，降低了检测成本。

说明书

技术领域

本发明涉及提高人源隐孢子虫(Cryptosporidium hominis)特异性的方法以及评价水中人源隐孢子虫活性的方法。 

背景技术

人源隐孢子虫(Cryptosporidium hominis)是人类卫生学上重要的一类致病性原生动物，其可以寄生于人肠道上皮组织细胞，能引起胃肠炎、腹泻等症状，特别是免疫功能缺陷者如婴儿，老人以及艾滋病患者等，被感染后会引起腹泻,甚至危及生命。人源隐孢子虫对饮用水的污染已对公民的健康构成了严重的威胁，且隐孢子虫卵囊已成为备受关注的介水传播生物危险因素之一。在我国新颁布的《生活饮用水卫生标准》中，已经将隐孢子虫和贾第虫作为非常规指标且规定了其限值，但根据目前我国的饮用水处理工艺及水源水质和供水水质现状来看，存在隐孢子虫疾病爆发的潜在风险，为保障饮用水安全，研发出一种高效、低廉的水中隐孢子虫活性评价方法具有重要和迫切的现实意义。 

目前常用的水中隐孢子虫活性评价方法有体外细胞感染、荧光活体染色、动物感染、RT-PCR和体外诱导脱囊等，其中尤以荧光活体染色（DAPI/PI）较为常用。DAPI/PI检测法已广泛应用于水体中隐孢子虫的选择性检测，但DAPI和PI毒性极强，且不能够特异性地检测隐孢子虫或贾第虫，需要与特异性免疫蛋白结合使用；RT-PCR的步骤包括：mRNA反转录成cDNA、PCR扩增特定的基因片段、丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳染色观察DNA产物等，步骤繁琐、操作人员需要极高的专业水准，扩增经热应激的隐孢子虫卵囊hsp mRNA的特异性差，特别容易受到外界干扰，检测实际样品的结果偏差较大；此外，细胞感染、体外诱导脱囊等技术，细胞培养需要严格的无菌操作环境、持续不断的营养配给，不适于应急检测，且相对常规检测而言花费颇大。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提高水中人源隐孢子虫的特异性，提升活 性评价的精密度。 

本发明进一步所要解决的技术问题是：提供一种评价水中人源隐孢子虫活性的方法，该方法简便有效，灵敏度高，解决隐孢子虫评价，成本高，效率低，造成二次污染等问题。 

为解决上述技术问题，本发明提供一种提高水中人源隐孢子虫特异性的方法，包括以下步骤： 

步骤1：提供含有一定浓度的人源隐孢子虫待测水样品； 

步骤2：向样品中加入PMA染料溶液； 

步骤3：对添加PMA染料的样品进行强光照射，从而提高水中人源隐孢子虫的特异性，提升活性评价的精密度。 

优选地，所述步骤1待测样品中人源隐孢子虫的浓度范围为1～5×10⁵个/L。 

优选地，步骤2中所述的PMA染料溶液的溶质为二甲基亚砜DMSO；最终检测样品中PMA染料浓度为50μmol/L；PMA染料溶液置于-20℃下避光保存，使用时滴加入样品中再进行步骤3所述的强光照射处理。 

优选地，所述步骤3中的强光照射是指卤素灯照射，操作条件为低温操作。 

优选地，所述卤素灯照射使用的设备为大功率卤素灯，其功率范围在500～800W，照射时间2～5分钟；所述的低温操作是将样品置于冰浴环境中，以减少强光照射所产生的温度升高对隐孢子虫的活性影响。 

为解决上述技术问题，本发明还提供一种评价水中人源隐孢子虫活性的方法，包括上述提高水中人源隐孢子虫特异性的方法所述步骤1～步骤3，还进一步包括以下步骤： 

步骤4：提取经PMA和强光处理后样品中的DNA； 

步骤5：构建目的基因以及引物，并进行qPCR反应，检测具有活性的人源隐孢子虫。 

优选地，所述步骤5是采用SYBR Green qPCR，所述目的基因的序列为隐孢子虫18S rDNA基因为序列表中SEQ ID NO.1；所述引物为： 

上游引物：5’-CAGAAACTTGAATGATATGT-3’； 

下游引物：5’-GGTTGTATTTATTAGATAAA-3’。 

优选地，所述qPCR反应体系的配方为下表1： 

表1：qPCR反应体系的配方 

组成 96孔(20μL/孔) 备注 PCR预混液（SYBR） 10微升 预混液终浓度1X 前引物 可变 大多数情况都是1微升 反向引物 可变 大多数情况都是1微升 去RNA酶水 可变 用水补齐20微升 cDNA模板 可变 大多数情况都是1微升或者2微升 总容量 20微升  

优选地，所述qPCR反应，还包括qPCR反应程序：94℃一个循环，10min；95℃，30s，60℃，25s,72℃,30s，共35个循环，并收集荧光；所述qPCR反应熔解曲线的过程为：95℃，60s，之后从55℃开始，每20s温度升高0.5℃，共进行80个循环，结束温度为95℃，反应结束后4℃保持；所述qPCR反应，每次定量PCR反应都设以相同体积的双蒸水取代DNA的空白对照，每次测定设2个平行样。 

优选地，所述步骤4中，提取经PMA和强光处理后样品中的DNA，其过程为：样品经15min，10000rpm离心后，去上清液，取沉淀部分于1.5mL灭菌离心管内，加入1mL灭菌蒸馏水并震荡混匀，10000rpm离心10min，弃上清液，重复两次以完成预处理；所得预处理后样品用DNA提取试剂盒提取DNA，最终得到80μL的DNA溶液置于-20℃冷冻保存。 

本发明的有益效果如下：建立一种准确、快速、简便、廉价的高通量分子生物学检测技术，用于评价水中人源隐孢子虫活性。本方法是基于荧光定量PCR技术结合叠氮类染色剂的隐孢子虫活性评价方法，具有较明显的优势：评价水中人源隐孢子虫活性具有特异性强、灵敏度高、简便高效、专业操作要求不高、成本低廉且毒性微弱等优良特征，完善了两虫活性评价方法体系，可广泛应用于水源水、长距离输水系统及管网中“两虫”污染状况监测和预警、疾控防疫等领域，具有广阔的应用前景。本发明通过PMA-qPCR技术，将其应用于水中人源隐孢子虫活性评价，构建人源隐孢子虫特异性引物，优化qPCR方法体系，提高水中人源隐孢子虫活性的检测效率，降低荧光染料所产生的有毒有害性，克服物理性灭活水中“两虫”时产生的假阳性等问题。对于进一步完善两虫灭活效果评价方法体系，提高水中人源隐孢子虫活性评价的灵敏度和 特异性，简化操作步骤，缩短检测时间，降低检测成本与毒性风险，促进健康饮水保障系统建设均有较强的现实意义。 

附图说明

图1是本发明的PMA-qPCR检测水中人源隐孢子虫活性数据图。 

图2是发明的PMA-qPCR检测水中大肠杆菌活性数据图。 

图3是发明的PMA-qPCR和qPCR分别检测水中人源隐孢子虫活性对比。 

具体实施方式

人源隐孢子虫（Cryptosporidium hominis）较难获得，目前研究较少，而且其对人类的危害较大。目前，qPCR的研究主要集中在细菌、真菌等简单微生物的检测方面，而没有用于隐孢子虫或贾第虫的检测。本发明评价水中人源隐孢子虫活性的方法，该方法利用荧光定量PCR（quantitative PCR，qPCR）技术并结合叠氮类染色剂叠氮溴化丙锭（propidium monoazide，PMA）评价水中人源隐孢子虫的活性。本发明利用PMA能够穿过非活性人源隐孢子虫受损的细胞进入其细胞内，进而嵌入非活性隐孢子虫的DNA中，在强光诱导下通过叠氮基团与DNA形成牢固的共价结合，但并不被PCR反应扩增，消除了非活性隐孢子虫DNA对检测结果的影响，进而达到了鉴别人源隐孢子虫死活的要求。该方法提高了检测的灵敏度和特异性，简化了操作步骤，缩短了检测时间，降低了检测成本，其检测时间短、灵敏度高、特异性强。 

本发明实施例提供一种提高水中人源隐孢子虫特异性的方法主要包括以下步骤： 

（1）提供含有一定浓度的人源隐孢子虫待测水样品：其中隐孢子虫的浓度控制在1～5×10⁵个/L范围内； 

（2）对待测水样进行PMA染料处理：将PMA染料溶解于20%的DMSO中制备成50mmol/L的储备液，置于-20℃下避光保存，检测时向样品中滴加PMA染料，在检测样品中最终浓度为50μmol/L；上下晃动3～4次，避光反应5～10min，反应过程中不时振荡离心管，使样品与PMA染料充分接触反应； 

（3）对待测样品进行光催化法灭活处理：将经过PMA染色的样品反应管放在冰上或低温环境中，在功率为500～800W的卤素灯照射2～5min，减少强光照射所产生的温度升高对隐孢子虫的活性影响；反应结束后将离心管在 10000rpm下离心10min，收集沉淀用于后续的DNA提取；从而提高水中人源隐孢子虫的特异性，提升活性评价的精密度。 

本发明实施例PMA-qPCR法评价水中人源隐孢子虫活性的方法，包括上述步骤（1）～（3），还进一步包括以下步骤： 

（4）提取经PMA染色和强光处理后样品中的DNA，其过程为：样品经15min，10000rpm离心后，去上清液，取沉淀部分于1.5mL灭菌离心管内，加入1mL灭菌蒸馏水并震荡混匀，10000rpm离心10min，弃上清液，重复两次；所得预处理后样品用DNA提取试剂盒(上海华舜生物技术有限公司DNA抽提试剂盒)提取DNA，最终得到80μL的DNA溶液置于-20℃冷冻保存； 

（5）进行qPCR反应，检测具有活性的隐孢子虫：采用SYBR Green qPCR，进行目的基因以及引物的构建，并进行qPCR反应，其中： 

qPCR反应体系的配方如表1： 

表1qPCR反应体系的配方 

组成 96孔(20μL/孔) 备注 PCR预混液（SYBR） 10微升 预混液终浓度1X 前引物 可变 大多数情况都是1微升 反向引物 可变 大多数情况都是1微升 去RNA酶水 可变 用水补齐20微升 cDNA模板 可变 大多数情况都是1微升或者2微升 总容量 20微升  

目的基因的序列为隐孢子虫18S rDNA基因PCR扩增产物测序结果如序列表中SEQ ID NO.1。 

引物为： 

上游引物：5’-CAGAAACTTGAATGATATGT-3’； 

下游引物：5’-GGTTGTATTTATTAGATAAA-3’； 

qPCR反应程序为： 

94℃一个循环，10min；95℃，30s，60℃，25s,72℃,30s，共35个循环，并收集荧光，熔解曲线的过程为：95℃，60s，之后从55℃开始，每20s温度升高0.5℃，共进行80个循环，结束温度为95℃，反应结束后4℃保持；每次定量PCR反应都设空白对照（以相同体积的双蒸水取代DNA），每次测 定设2个平行样。实验结果分析包括：标样与目的基因扩增结果分析、表达结果分析及表达量差异分析。 

例一 

本实施例中，应用上述方法检测水中人源隐孢子虫活性，具体按步骤如下： 

（1）提供含有一定浓度的活性隐孢子虫待测水样，隐孢子虫的浓度控制在1～5×10⁵个/L范围内； 

（2）将PMA染料溶解于20%的DMSO中制备成50mmol/L的储备溶液，置于-20℃下避光保存。检测时向样品中滴加PMA染料，检测样品中最终浓度为50μmol/L。上下晃动3～4次，避光反应5～10min，反应过程中不时振荡离心管，使样品与PMA染料充分接触反应； 

（3）将经过PMA染色的样品反应管放在冰上或低温环境中，在功率为500～800W的卤素灯照射2～5min，减少强光照射所产生的温度升高对隐孢子虫的活性影响；反应结束后将离心管在10000rpm下离心10min，收集沉淀用于后续的DNA提取； 

（4）提取PMA和强光处理后样品中的DNA；其过程为：样品经15min，10000rpm离心后，去上清液，取沉淀部分于1.5mL灭菌离心管内，加入1mL灭菌蒸馏水并震荡混匀，10000rpm离心10min，弃上清液，重复两次。所得预处理后样品用DNA提取试剂盒(上海华舜生物技术有限公司DNA抽提试剂盒)提取DNA，最终得到80μL的DNA溶液置于-20℃冷冻保存； 

（5）进行qPCR反应，检测具有活性的人源隐孢子虫。采用SYBR Green qPCR，进行目的基因以及引物的构建，并进行qPCR反应。其目的基因序列如序列表中SEQ ID NO.1，引物如下： 

上游引物：5’-CAGAAACTTGAATGATATGT-3’； 

下游引物：5’-GGTTGTATTTATTAGATAAA-3’； 

qPCR反应程序为：94℃一个循环，10min；95℃，30s，60℃，25s,72℃,30s，共35个循环，并收集荧光，熔解曲线的过程为：95℃，60s，之后从55℃开始，每20s温度升高0.5℃，共进行80个循环，结束温度为95℃，反应结束后4℃保持；每次定量PCR反应都设空白对照（以相同体积的双蒸水取代DNA），每次测定设2个平行样及一个对照样（活性标准样品）。目的基因与标样扩增、表达结果见图1，从图中可以发现待测样品与活性标准样品荧光强度基本一致，通过线性拟合和数据分析，待测样品与标样差异性不显著（P>0.05），PMA-qPCR 法可以作为定量检测水中人源隐孢子虫活性的一种方法。 

例二 

按例一所述的方法，为评价PMA-qPCR法的检测灵敏性，以将大肠杆菌标准品添加入含有一定浓度的活性隐孢子虫的待测水样与不添加大肠杆菌标准品的活性隐孢子虫的待测水样进行对比试验，进行相同的实验步骤，PMA染色，强光照射处理，其结果见图2，从图中可以看出PMA-qPCR法在含有其他杂菌的情况下，仍然能够准确定量检测水中人源隐孢子虫的活性。 

例三 

按例一的方法，对比不同样品浓度下，PMA-qPCR和qPCR检测水中人源隐孢子虫活性的对比试验，（1）提供含有一定浓度的人源活性隐孢子虫待测水样，隐孢子虫的浓度控制在1～5×10³、1～5×10⁴个/L和1～5×10⁵个/L三个数量级范围内；（2）提取样品中的DNA；其过程为：样品经15min，10000rpm离心后，去上清液，取沉淀部分于1.5mL灭菌离心管内，加入1mL灭菌蒸馏水并震荡混匀，10000rpm离心10min，弃上清液，重复两次。所得预处理后样品用DNA提取试剂盒(上海华舜生物技术有限公司DNA抽提试剂盒)提取DNA，最终得到80μL的DNA溶液置于-20℃冷冻保存。（3）进行qPCR反应，检测具有活性的隐孢子虫。采用SYBR Green qPCR，并进行目的基因以及引物的构建，并进行qPCR反应。其目的基因的序列如序列表SEQ ID NO.1；引物如下： 

上游引物：5’-CAGAAACTTGAATGATATGT-3’； 

下游引物：5’-GGTTGTATTTATTAGATAAA-3’； 

qPCR反应程序为：94℃一个循环，10min；95℃，30s，60℃，25s,72℃,30s，共35个循环，并收集荧光，熔解曲线的过程为：95℃，60s，之后从55℃开始，每20s温度升高0.5℃，共进行80个循环，结束温度为95℃，反应结束后4℃保持；每次定量PCR反应都设空白对照（以相同体积的双蒸水取代DNA），每次测定设2个平行样。实验结果见图3，从图中可以发现：PMA-qPCR法的相对荧光强度不仅高于PMA对照组，而且也高于qPCR法；同时，样品浓度也是影响检测精密度的一个重要因素，从图中可以发现：样品浓度越高，相对荧光强度的差异性越大，越容易定量检测水样中隐孢子虫活性。 

例四 

采用例一的方法对水中人源隐孢子虫活性进行评价，实验结果与与其他检测方法进行比较，其效率、成本等指标见下表2： 

表2各种方法对水中人源隐孢子虫活性进行评价的比较 

  PMA-qPCR DAPI/PI 活体感染 体外诱导脱囊 检测时间（h） 2.0 3.0 240h 12h 特异性 强 较强 较强 一般 专业技术要求 较高 较高 高 高 毒害 微弱 强 微弱 微弱 成本 低 一般 高 一般 程序步骤 较简单 较简单 复杂 较复杂

从上表的比较可以得出，本发明的方法和设备简便有效、微毒、操作简便，是一种高效高安全、低成本的水中人源隐孢子虫活性评价方法，并有利于实践推广应用。 

对于隐孢子虫这种原生动物，其目的基因序列及引物的设计是一个技术难点；而隐孢子虫（原生动物）检测较为复杂。本发明的检测方法与qPCR反应体系的配方、引物和目的基因序列不同；PMA染色过程、样品处理和qPCR步骤均有优化之处；具体还产生以下突出效果: 

（1）PMA-qPCR法能够定量检测水中人源隐孢子虫活性； 

（2）PMA-qPCR法在含有其他杂菌的情况下，仍然能够准确定量检测水中人源隐孢子虫的活性； 

（3）PMA-qPCR法优于单独使用PMA和qPCR法； 

（4）本发明的方法和设备简便有效、微毒、操作简便，是一种高效高安全、低成本的水中人源隐孢子虫活性评价方法。 

以上所述是本发明的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。