一种转录调控肿瘤靶向复制溶瘤腺病毒载体、携带治疗基因腺病毒及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种转录调控肿瘤靶向复制溶瘤腺病毒载体、携带治疗基因的腺病毒及其制备方法和应用。所述腺病毒载体基因序列如SEQ ID NO.1所示；所述腺病毒的基因序列如SEQ ID NO.2所示。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种转录调控肿瘤靶向复制溶瘤腺病毒载体、转 录调控肿瘤靶向复制携带凋亡诱导和抗血管基因的溶瘤腺病毒及其制备方法及应用。

背景技术

自1989年美国批准第一个临床试验至今，基因治疗获得了不断发展与进步。基因治 疗在帕金森症，遗传性眼病上取得好疗效被2009年《科学》杂志评选为全球十大科学进 展之一。截止到2007年，美国已有864个基因治疗和基因转染项目被批准进行临床试 验，其中579项用于癌症治疗，3项已经进入III期临床试验。另外，445项临床试验在 世界其他地方进行，大多数集中在欧洲（数据来源于Gene Therapy Clinical Trials  Worldwide（GTCTW）,http://www.abedia.com/wiley/index.html）。2012年Glybera被欧洲 药监局批准成为西方国家第一个基因药物治疗遗传病脂蛋白脂酶缺乏症（LPLD），被称为 是创新药物领域中的重要突破。

腺病毒是迄今为止研究最透彻，应用最广泛的基因治疗载体，大概占基因治疗临床 试验的23.3%(图1)。与其他载体比较，腺病毒有感染效率高，毒性小等优势。世界上第 一个基因治疗药物今又生（Gendicine）被中国SFDA于2004年批准上市（复制缺陷腺病 毒携带p53基因，国药准字S20040004），用于治疗头颈鳞癌。另一个产品H101（有限复 制溶瘤腺病毒但E1b-55kda基因被敲除，商品名：安柯瑞，国药字S20060027）于2006年 批准为肿瘤治疗药物。类似产品也在美国进行III期临床试验。目前中国申请临床试验的 基因治疗产品26个，用于肿瘤治疗23个，其中4个已经进入III期临床试验(GTCTW)。 虽然腺病毒基因治疗仍然需要克服机体免疫清除和增强效果的严峻考验，但是从目前的 临床结果来看，这些产品安全性非常可靠，而且单纯应用或者联合放化疗应用的临床效 果非常令人鼓舞。

我国已经批准了两种腺病毒基因治疗产品在临床应用，同时还有很多产品正在进行 临床试验。从发表的文献来看，国内大多数基因治疗产品的研发主要集中在治疗基因的 发现与应用上，对靶向可控基因治疗载体研发和基因靶向导入及可调控表达技术研究较 少。目前正在进行的临床试验中腺病毒产品主要以复制缺陷腺病毒为载体，或者应用已 经批准的Ad-p53,或者安柯瑞（ONXY）病毒载体。

美国德那翠丝有限公司2007年申请的用于癌症治疗的溶瘤腺病毒（申请号： 200780009189.9）涉及用于治疗癌症的溶瘤腺病毒,其含有隔开启动子的人DNA序列,所述 启动子赋予腺病毒基因以选择性表达。美国昂尼克斯药物公司1999年申请的用于治疗疾 病的腺病毒载体（申请号：99805402.X），将腺病毒载体E3区域中含有可使该区域部分 或全部缺失的限制位点,或者其中含有的选择基因。上海三维生物技术有限公司申请的用 于原发性肝癌基因治疗的腺病毒载体及使用方法（申请号03150897.9），发明构建了一种 基因重组腺病毒,其中含有甲胎蛋白启动子(AFP)基因和治疗基因。研究表明,该重组病毒 可以特异性的杀伤表达甲胎蛋白的原发性肝癌细胞。郑州大学申请的靶向性溶肿瘤腺病 毒载体Ad-TD-gene的构建方法及应用（200910066130.4），该病毒载体为C亚类的5型 腺病毒Ad5,删除腺病毒的E1A-CR2、E1B19K和E3gp-19K三个内在基因,保留E3B基因,保 留E3gp-19K启动子表达外源治疗基因,该载体可以插入任意一种有助于治疗肿瘤或用于感 染性疾病疫苗的抗原基因。总之，目前我国拥有自主知识产权的用于腺病毒基因治疗的 载体结构仍非常有限。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种转录调控肿瘤靶向复制溶瘤腺病毒载体、 转录调控肿瘤靶向复制携带凋亡诱导和抗血管基因的溶瘤腺病毒及其制备方法及应用。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

所述转录调控肿瘤靶向复制溶瘤腺病毒载体基因序列如SEQ ID NO.1所示。

所述病毒载体是由pAd1020sfidACMV质粒、质粒pAd288和pBR304E1a穿梭质粒同 源重组而成。

所述基于上述载体的转录调控肿瘤靶向复制溶瘤腺病毒的基因序列如SEQ ID NO.2所 示。所述腺病毒的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）从人CEM细胞中提取人全基因组DNA，利用PCR扩增出HER2基因启动子片 段；

所述PCR中的扩增引物为：

5'-GGGGGTCCTGGAAGCCACAAG-3'（SEQ ID NO.3），

5'-CCGGAGAAACCAGGGGAG-3'（SEQ ID NO.4）；

所述HER2基因启动子片段的基因序列如SEQ ID NO.5所示；将HER2基因启动子片 段与TA克隆载体联接后用XhoI和HindIII酶切后插入pGL3-basic载体中；

（2）将CMV启动子插入到pAd1020sfidA穿梭质粒中构建成pAd1020sfidACMV，所述 CMV启动子序列尾端建有多个限制性内切酶的序列，所述限制性内切酶序列如SEQ ID  NO.6；将TRAIL-Endostatin融合基因通过XbaI和KpnI酶切插入pAd1020sfidACMV中形成 pAd1020sfidACMVTRAIL-Endostatin质粒；所述TRAIL-Endostatin融合基因序列如SEQ ID  NO.7所示；

（3）将腺病毒5基因组中从E1b到E4的基因片段导入质粒pAd288中；所述E1b到 E4的基因片段中E3gp-19kda基因和E4的1-4orf元件被敲除；所述E3gp-19kda基因序列 如SEQ ID NO.8所示，E4的1-4orf元件基因序列如SEQ ID NO.9所示；

（4）将Her2基因启动子片段从pGL3-basic载体中切出来，并插入到pBR304E1a穿 梭质粒中构建成p304-Her2E1a；

（5）将步骤（2）至（4）构建的质粒用限制性内切酶sfiI切开后进行同源性重组，即 得到转录调控肿瘤靶向复制携带凋亡诱导和抗血管基因的溶瘤腺病毒。

其中，步骤（3）中所述的从E1b到E4的基因片段依次包括E1b-19K，E1b-55k,IX,IVa2, Pol,pTP,52K,pIIIa,III,pVII,PX,PVI,hexon,protease,DBP,100K,33K,22K,pVIII, E3-12.5K,E3gp-19k,ADP:E3CR1beta0,10.5kda protein,E3RID-alpha,E3RID-beta,E3-14.7k, U exon,Fiber,E4orf6/7,E434k基因；步骤（3）是先将E1b-19k基因（包括TATA box和 1672-3503）插入到pAd288载体构建成pAd288E1b；然后以pAd288E1b为模板，克隆腺 病毒基因组从E1b-19k基因到E3-12.5k的基因片段，以及从ADP：E3CR1beta0基因到E4 的34k基因的片段，这两个片段联接后构成敲除了E3-gp19k基因和E4的1-4orf元件的 基因片段；再在敲除了E3-gp19k基因和E4的1-4orf元件的基因片段两端接上sfiI限制性 内切酶切位点，经sfiI限制性内切酶酶切后，得到含有从E1b-19k基因到E4的34k基因的 基因片段的质粒。

上述腺病毒载体可应用于制备治疗乳腺癌药物，所述乳腺癌是指AR+Her2+的乳腺癌。

上述腺病毒克应用于制备治疗乳腺癌药物，所述乳腺癌是指AR+Her2+的乳腺癌。

本发明的腺病毒与原有腺病毒，以及溶瘤腺病毒比较，抗肿瘤的效果通过诱导凋亡 以及抗血管等多种途径得到进一步加强。

本发明将腺病毒基因进行重排，敲除病毒结构中的非功能基因和诱导免疫系统识别 的基因，重排基因后，腺病毒E1a基因和E4基因的表达被人的肿瘤特异性基因启动子控 制，从而病毒的复制被人的肿瘤特异性的启动子的控制，从而达到对调控腺病毒基因治 疗靶向复制的目的。重组的基因组结构经过基因测序确认病毒基因结构正确。

在免疫缺陷小鼠中的肿瘤移植瘤模型中药效学评价。在经过实体肿瘤的局部注射以 后，病毒在肿瘤局部开始感染肿瘤细胞，病毒在靶向的肿瘤细胞内复制产生更多的病 毒，细胞被病毒杀死裂解后，复制的病毒释放出来，感染周围的肿瘤细胞，在被人体免 疫系统排出以前不断地复制与感染肿瘤细胞。携带治疗病毒的溶瘤腺病毒在病毒复制的 同时，每个被感染的细胞成为了治疗蛋白的”生产工厂”，不断产生治疗蛋白，可溶性 的凋亡诱导蛋白TRAIL和抗血管治疗蛋白Endostatin在肿瘤组织间隙中流动，能够诱导 更多的肿瘤细胞凋亡，同时破坏肿瘤的血管结构。

本发明的腺病毒除了直接杀死肿瘤细胞以外，还能够使残余的肿瘤细胞增强对于放 疗和化疗的敏感性。在实体肿瘤中注射病毒后3-5天，病毒感染肿瘤细胞后杀死了部分肿 瘤细胞，以及凋亡及抗血管蛋白改变了肿瘤的微环境，在这个时间点进行化疗（铂类或者 紫杉醇）或者放疗，能够促进残余的肿瘤细胞对化疗和放疗的敏感性。在实体肿瘤病毒治 疗前进行放疗和化疗，能够杀死部分肿瘤细胞，改变了肿瘤的局部微环境，此时局部注 射腺病毒，能够促进病毒在实体肿瘤内的扩散和肿瘤感染的能力。从而促进抗肿瘤的治 疗效果。

总之，本发明提供了能有效靶向杀死人体肿瘤细胞的复制活跃的溶瘤腺病毒。在这个 病毒构建中，腺病毒5的E1a基因被移动到病毒尾端E4基因后，排除病毒包装信号序列 对于基因表达的干扰；用人的肿瘤特异性启动子取代E1a基因和E4基因启动子同时控制 这两个基因的表达，从而病毒复制被人的肿瘤特异性启动子控制；在E1b基因前插入一个 基因表达元件（基因过表达或者基因敲除）携带治疗基因，E3gp-19kda基因敲除防止病毒 感染后被人体免疫系统过早识别与清除；E4的1-4orf元件被敲除以腾出更多的基因组 空间给外源基因。病毒载体携带凋亡诱导和抗血管的联合治疗基因TRAIL-Endostatin融合 基因。凋亡诱导和抗血管是两种有效的抗肿瘤方法，但是药物的联合应用很难在肿瘤局 部发挥协同作用。用病毒携带两种不同机理的抗肿瘤分子能够达到这一目标。通过腺病 毒在肿瘤细胞中的靶向特异性复制，不断在肿瘤局部产生治疗蛋白，从而发挥诱导肿瘤 细胞凋亡和抗肿瘤血管的功能。这类溶瘤病毒不仅能够直接杀死肿瘤细胞，而且能够通 过治疗蛋白的作用诱导更多的细胞凋亡，破坏肿瘤的血液供应和改变肿瘤微环境，从而 最大限度地扩大抗肿瘤的作用。临床前研究证明，该腺病毒不仅有很强的抗肿瘤效果， 而且能够帮助肿瘤细胞增强对于放化疗的敏感性。凋亡诱导和抗血管的联合治疗基因 TRAIL-Endostatin用于肿瘤的基因治疗。肿瘤靶向复制的腺病毒结构携带凋亡诱导和抗血 管的联合治疗基因TRAIL-Endostatin能够增强肿瘤细胞对于放疗或者化疗的敏感性。

附图说明

图1是肿瘤特异性的病毒杀伤能力结果图；

图2是本发明腺病毒感染AR+Her2+的乳腺癌细胞MD-MBA-453细胞结果图；

图3是TSAd5E4(△1-4)-TRAIL-Endo的动物实验结果图；

图4是实施例4的结果图；

图5是本发明腺病毒构建原理图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

1、新型腺病毒TSAd5E4(△1-4)-TRAIL-Endo的说明。

乳腺癌的发病与雌激素受体（ER），孕激素受体（PR）以及络氨酸激酶受体HER2 的水平密切相关。在乳腺癌类型中，大约60-80%是Luminal/ER(+)肿瘤，患者对于内分泌 激素治疗有效，但25-30%的ER(-)乳腺癌患者对于内分泌激素治疗无效。其中“三阴” （ER，PR和HER2阴性）乳腺癌是一类非常恶性的肿瘤类型，具有侵袭力强、远处转移 风险大和预后差等特点，对于靶向上述基因的分子药物都产生耐药。非常迫切需要在这 一肿瘤类型中寻找出新的分子靶向基因，以提高治疗效果。但是ER(-)乳腺癌的组成非常 复杂，人们对于疾病的认识还非常有限。虽然雌激素和雌激素受体在乳腺癌的发生发展 上起着主导作用，但是在60-70%的乳腺癌组织中可以检测到雄激素受体（AR）表达，包 括在88%ER（+），50%HER2(+)和25%“三阴”乳腺癌组织中。AR尤其在组织学上具有 顶浆分泌特征的ER（-）HER2（+）乳腺癌组织中表达增高。AR与HER2的异常高表达 呈现出显著的相关性。因此通过腺病毒基因治疗靶向AR+Her2+的乳腺癌细胞将为这类肿 瘤病人带来革命性的方法。我们通过研究Her2基因的结构，构建了一个Her2基因启动子 片段（大约522bp）。

我们首先应用全基因组DNA提取试剂盒（Qiagen，Valencia,CA,USA）从人CEM细 胞(ATCC,编号:CCL-119)提取的人全基因组DNA，具体的步骤参照试剂盒的标准程序。人 全基因组DNA经过稀释后以此为模板，应用PCR方法得到了一条大概530bp长度的 HER2基因启动子片段。所应用的PCR引物序列如下:

5'-GGGGGTCCTGGAAGCCACAAG-3'（SEQ ID NO.3），

5'-CCGGAGAAACCAGGGGAG-3'（SEQ ID NO.4）；

PCR条件为94℃4分钟，94℃1分钟，56℃30秒，72℃30秒，72℃7分钟，4℃∞。共 24个循环。

HER2基因启动子片段的基因序列如SEQ ID NO.5所示；将HER2基因启动子片段与 TA克隆载体联接后用XhoI和HindIII酶切后插入pGL3-basic载体中；

2、TSAd5E4(△1-4)-TRAIL-Endo的构建。

首先将整个腺病毒5的基因组分别装载在三个不同的穿梭质粒中。

pAd1020sfidA穿梭质粒（O.D.260Inc.Boise,ID，USA）包含腺病毒5基因组的的起始 重复序列（ITR）（SEQ ID NO.10）和腺病毒5的包装信号序列（SEQ ID NO.11），此外还 包含一个庆大霉素的抗药基因（此基因是pAd1020sfidA质粒自带的基因）。

（1）将CMV启动子插入到pAd1020sfidA穿梭质粒中构建成pAd1020sfidACMV，所述 CMV启动子序列尾端建有多个限制性内切酶的序列，

所述限制性内切酶序列如SEQ ID NO.6（KpnI-NheI-XhoI-XbaI-sfiI: GGTACCGCTAGCCTCGAGTCTAGAGGCCAGAGAGGCC）所示；将TRAIL-Endostatin 融合基因通过XbaI和KpnI酶切插入pAd1020sfidACMV中形成 pAd1020sfidACMVTRAIL-Endostatin质粒，所以TRAIL-Endostatin融合基因在CMV启动子 的控制之下；所述TRAIL-Endostatin融合基因序列如SEQ ID NO.7所示；应用sfiI限制性内切 酶酶切后，一条DNA长链被打开，两侧包含有sfiI限制性内切酶的结合序列。包括表达元 件CMV-TRAIL-Endostatin，腺病毒基因组的起始重复序列（ITR）和腺病毒5的包装信号序 列，还有一个庆大霉素的抗药基因。

（2）将腺病毒5基因组中从E1b到E4的基因片段导入质粒pAd288（O.D.260 Inc.,Boise,ID,USA）中；所述的从E1b到E4的基因片段依次包括E1b-19K，E1b-55k,IX,IVa2, Pol,pTP,52K,pIIIa,III,pVII,PX,PVI,hexon,protease,DBP,100K,33K,22K,pVIII, E3-12.5K,E3gp-19k,ADP:E3CR1beta0,10.5kda protein,E3RID-alpha,E3RID-beta,E3-14.7k, U exon,Fiber,E4orf6/7,E434k基因；先将E1b-19k基因（包括TATA box和1672-3503） 插入到pAd288载体构建成pAd288E1b；然后以pAd288E1b为模板，克隆腺病毒基因组从 E1b-19k基因到E3-12.5k的基因片段，以及从ADP：E3CR1beta0基因到E4的34k基因的 片段，这两个片段联接后构成敲除了E3-gp19k基因和E4的1-4orf元件的基因片段；再 在敲除了E3-gp19k基因和E4的1-4orf元件的基因片段两端接上sfiI限制性内切酶切位点， 经sfiI限制性内切酶酶切后，得到含有从E1b-19k基因到E4的34k基因的基因片段的质粒。 所述E3gp-19kda基因序列如SEQ ID NO.8所示，E4的1-4orf元件基因序列如SEQ ID NO.9 所示；

（3）将Her2基因启动子片段从pGL3-basic载体中切出来，并插入到pBR304E1a穿 梭质粒中构建成p304-Her2E1a；

具体来说，首先运用PCR方法将腺病毒基因组尾端序列（35464bp-35938bp，这是E4 基因促进子序列，包括尾端重复序列ITR，35836bp-35938bp，尾端重复序列如SEQ ID NO.12 所示）克隆到pBR300载体(O.D.260Inc.,Boise,ID,USA)上，两侧带有sfiI限制性内切酶。

E4基因的促进子区域（35641bp-35822bp）被多克隆位点（AvrII-XhoI-KpnI-XbaI-PacI） 取代，并且将E1a基因插入到KpnI/XbaI之间构建成pBR304E1a载体。pBR304E1a载体 为商业化克隆载体，其中包含庆大霉素的抗药基因。

将Her2基因启动子从pGL3-basic载体中切出来（XhoI/AvrII）插入到pBR304E1a载体的 多克隆位点（XhoI/AvrII）构成p304-Her2E1a。该质粒带有氨苄青霉素的耐药基因（氨苄青 霉素耐药基因是在pBR300商业载体（O.D.260Inc.,Boise,ID,USA）上的基因）。

用sfiI限制性内切酶将Her2基因启动子控制E1a基因的表达元件以及尾端腺病毒重复序 列，连同氨苄青霉素的耐药基因从pBKS II质粒中切出。

（4）将步骤（1）至（3）构建的质粒用限制性内切酶sfiI切开后进行同源性重组，即 得转录调控肿瘤靶向复制溶瘤腺病毒。由于三个质粒被限制性内切酶sfiI切开后形成三段 DNA长链，每个长链的两端都挂有sfiI酶的残端，他们会互相连接，由于我们在sfiI酶序列 的自由位点区特异性地设计了定向序列，能够保证三段长链的连接严格按照我们设计的序 列连接，所以大大提高了同源重组的序列。重组后的DNA粘粒转化到大肠杆菌中，通过氨 苄青霉素和庆大霉素的双重筛选，我们高效率地得到了正确结构的重组构建。应用PCR的 方法检测重组连接部位的序列以验证序列的正确。

重组后的DNA粘粒在确认结构正确后进行纯化和扩增。DNA粘粒被PacI限制性内切酶 酶切后将环状变成线型，采用Lipofectamin2000kit(Invitrogen,CA,USA)将线型的DNA粘 粒转染到病毒的包装细胞HER911E4中(包含有腺病毒E1a与E4基因，被Dr.Bert Vogelstein, 美国约翰霍普金斯大学细胞与分子医学系）。细胞经过7-10天培养后病毒包装激活，病毒被 收获，再次感染细胞，经过扩增后病毒用CscL梯度离心法纯化，最后获得高滴度的病毒。 本发明所得的腺病毒命名为TSAd5E4(△1-4)-TRAIL-Endo。

实施例2

TSAd5E4(△1-4)-TRAIL-Endo的体外研究。

（1）该病毒在AR+Her2+的乳腺癌细胞MD-MBA-453和HCC-1954细胞中能有效复制， 复制能力与野生型的腺病毒5的能力相当，但是在Her2-的细胞中复制能力较低。结果见 表1：

TSAd5E4(△1-4)-TRAIL-Endo肿瘤特异性的复制能力＊

＊细胞被野生型的腺病毒和TSAd5E4(△1-4)-TRAIL-Endo病毒感染后72小时，收集细胞培养液上清， 产生病毒的浓度用病毒滴度实验进行检测。

#用于细胞感染的病毒就是细胞接受感染的病毒量。

&生产出的病毒就是在病毒的滴度实验中检测到的病毒量。病毒产量用LD50作为指标。

（2）该病毒能有效杀死AR+Her2+的乳腺癌细胞MD-MBA-453和HCC-1954细胞，肿瘤 细胞的杀伤能力与野生型的腺病毒5的能力相当，但是在Her2-的细胞MCF10A和 MD-MBA-231中杀伤能力较低。

结果分析见图1，图解：肿瘤特异性的病毒杀伤能力。TSAd5E4(△1-4)-TRAIL-Endo 和野生型的腺病毒经过连续系列稀释后感染AR+Her2+的乳腺癌细胞MD-MBA-453和 HCC-1954细胞和AR-Her2-的细胞MCF-7和MD-MBA-231细胞，病毒的杀伤能力用LD50 来进行评价。病毒杀伤的指标首先用TSAd5E4(△1-4)-TRAIL-Endo病毒的LD50除以野生 型腺病毒的LD50。然后对于比值取Log10。

（3）该病毒感染AR+Her2+的乳腺癌细胞MD-MBA-453细胞后，TRAIL和Endostatin蛋 白的表达水平随时间逐渐增加，但是在Her2-的细胞MD-MBA-231细胞中表达较低。结果 见图2，图解：AR+Her2+的乳腺癌细胞MD-MBA-453和AR-Her2-的乳腺癌细胞 MD-MBA-231细胞经过病毒感染后48小时，60微克的全细胞蛋白质以及浓缩培养液的蛋 白质用于检测TRAIL和Endostatin结合蛋白的表达。

实施例3

TSAd5E4(△1-4)-TRAIL-Endo的动物实验研究。

MDA-MB-453细胞（1×10⁶在100μL PBS液中）按照1:1的比例与Matrigel混合后将 用30号注射针注射到胸部乳腺的脂肪垫下。在细胞接种后3-4周待肿瘤长出后，动物被 单独或者联合应用PBS,控制质粒TSAd5E4(△1-4)以及TSAd5E4(△1-4)-TRAIL-Endo(剂量 5x10⁷VP/tumor肿瘤内注射一次，每组12只老鼠。病毒注射后每周测量肿瘤的体积，观察 肿瘤的生长连续5周。结果显示TSAd5E4(△1-4)-TRAIL-Endo与不复制的腺病毒载体 AdCMV-GFP以及TSAd5E4(△1-4)相比具有很强的肿瘤抑制效果，肿瘤的生长被显著抑 制。结果见图3，图解：注射AR+Her2+乳腺癌细胞MD-MBA-453到免疫缺陷小鼠的皮下 诱导肿瘤移植瘤模型。待肿瘤形成后在肿瘤内一次性注射腺病毒，连续5周观察肿瘤的生 长情况。肿瘤的生长倍数是肿瘤的体积与病毒注射前的体积的比值。

实施例4

TSAd5E4(△1-4)-TRAIL-Endo与紫杉醇结合应用显著地增强了 TSAd5E4(△1-4)-TRAIL-Endo或者紫杉醇的肿瘤抑制效果。结果见图4，图解：注射 AR+Her2+乳腺癌细胞MD-MBA-453到免疫缺陷小鼠的皮下诱导肿瘤移植瘤模型。待肿瘤 形成后在肿瘤内一次性单独或者联合注射腺病毒和紫杉醇，连续5周观察肿瘤的生长情 况。肿瘤的生长倍数是肿瘤的体积与病毒注射前的体积的比值。TSAd-TE代指 TSAd5E4(△1-4)-TRAIL-Endo。