铂类配合物、由该铂类化合物制得的蛋白质复合物及其制备方法

摘要

本发明公开了一类含有咪唑基团的四价铂配合物及其与天青蛋白突变体结合形成的蛋白质复合物及其制备方法。具体涉及天青蛋白和一类四价铂类配合物，所述的天青蛋白在其铜结合位点上有一个组氨酸被突变，所用的铂配合物含有一个咪唑基团，二者通过配位结合构建成为蛋白复合物。四价铂类配合物与天青蛋白突变体的结合方式为四价铂类配合物通过咪唑基团取代天青蛋白中被突变的组氨酸的咪唑基团与铜原子配位，将四价铂类配合物配位结合到天青蛋白突变体的铜原子中心上。肿瘤细胞生长抑制实验结果表明，含四价铂配合物的天青蛋白具有较好的肿瘤细胞生长抑制作用，具有作为抗肿瘤药物的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于蛋白药物制剂领域，具体涉及蛋白药物及其制备方法，具体涉及天青蛋白和一类四价铂类配合物，所述的天青蛋白在其铜结合位点上有一个组氨酸被突变，所用的铂配合物含有一个咪唑基团，二者通过配位结合构建成为蛋白复合物。 

背景技术

癌症历来是不治之症的代名词。21世纪以来，随着工业化的发展，人类的生存环境在不断的恶化，而癌症患者的数量也逐年递增。2010年国际抗癌联盟在第21届世界抗癌大会上发布的数据表明，2008年，全世界有1270万人患癌症，而且死亡人数高达760万，占当年全世界死亡人数的13%。在我国，每年约新增220万癌症患者，而有130万人死于癌症。癌症以代替心血管疾病成为我国夺取人民生命的第一杀手。 

铂类化合物是目前临床治疗癌症的主要药物，目前主要用于临床治疗的是二价铂类配合物，如顺铂、卡铂、奥沙利铂等，但其对机体的毒副作用和耐药性等问题仍有待解决。而四价铂类化合物也因为对机体的毒副作用小、脂溶性增加被广泛关注。顺式-二氯-反式-二乙酰基-氨-甲胺合铂（Ⅳ）（JM216），及JP-A61-33192，JP-A-61-7283，JP-A-1-294684中提到的四价铂都具有优秀的水溶性和低肾毒性，然而其抗肿瘤效果并不是很令人满意，所以需要寻找新的途径。 

细菌蛋白作为潜在的抗癌药物如今也渐渐变热，天青蛋白是其中的热点之一。继2002年，美国伊利诺斯大学Yamada等发现其对于肿瘤细胞生长的抑制以来，引起了科学界的广泛关注。目前已经发现了其对于多种肿瘤细胞（MCF-7、J774、U2OS cells等）具有抑制细胞生长的作用，而对于相应的正常细胞没有类似作用。而本专利描述的就是细菌蛋白天青蛋白的一个突变体与 一类配基含有咪唑环的四价铂类配合物通过配位结合形成的一类药物。 

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的是通过细菌蛋白天青蛋白的一类突变体与一类配基含有咪唑环的四价铂类配合物通过配位结合形成的一类复合物，使之具有二者共同的优点，希望该复合物在增加了天青蛋白的肿瘤细胞杀伤能力同时，又减少四价铂类配合物对正常细胞的毒副作用。 

为了实现本发明的目的，首先，本发明提供了一种铂类配合物，其结构式如下： 

其中，两个R₁配体可以相同也可以不同，其通过氮原子与Pt原子配位，所述R₁为氨（NH₃）或者取代胺；两个L配体可以相同也可以不同，其选自卤素、羧酸根或者取代羧酸根；所述R₂为含有咪唑基团的取代基。 

其中，所述取代胺为一乙基胺、二乙基胺、一正丙基胺、二正丙基胺、一异丙基胺、二异丙基胺、一正丁基胺、二正丁基胺、一异丁基胺、二异丁基胺、一正戊基胺、二正戊基胺、一异戊基胺、二异戊基胺或环己二胺；所述卤素选自Cl、Br或I；所述羧酸根为乙酸根、丙酸根、正丁酸根、丁二酸根、苯甲酸根、苯乙酸根或对甲基苯甲酸根；所述取代羧酸根为一氯乙酸根、二氯乙酸根或三氯乙酸根；所述取代基包括C(O)NHCH(COOH)CH₂-Im或(CH₂)_n-Im，其中n=1-6，Im为咪唑基团。 

进一步地，本发明提供了一种蛋白复合物，其用天青蛋白突变体作为药物载体，将含有咪唑环的铂类配合物的配体与该天青蛋白突变体配位结合得到；其中，所述天青蛋白突变体具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或其具有等同生物学活性的片段或其保守性变体或衍生物。 

进一步地，本发明还提供了一种天青蛋白突变体，其具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或其具有等同生物学活性的片段或其保守性变体或衍生物。 

所述天青蛋白突变体是将其铜结合位点的一个组氨酸突变为甘氨酸或丙 氨酸。此处所用的术语“具有等同生物学活性的片段”或其“保守性变体”是指所述片段分别不同于SEQ ID NO：1所述的氨基酸序列，但保留了所述氨基酸的基本特性，如基本的生物特性、结构特性、调节特性或生化特性。通常，所述氨基酸水平上的差异是有限的，以使参考多肽之序列与其保守性变体总体上非常相似，并且在许多区域是相同的。保守性变体与参考多肽氨基酸序列上的差异可以是ー个或多个性质相同或相似的氨基酸的保守性替换、插入和删除。替换或插入的氨基酸残基可由遗传密码编码，也可不由遗传密码编码。多核苷酸或多肽的变体可以自然产生（如等位基因变体），或者它可以是非自然产生的变体。多核苷酸和多肽之非自然产生的变体可通过诱变技术或直接合成而产生。 

结合本发明公开的内容，以及本领域公知的保守性氨基酸替代，本领域普通技术人员知晓，本发明所述的天青蛋白突变体不限于SEQ ID NO：1所述的氨基酸序列，还包括经过上述保守性替换后得到的具有基本上相同的生物学功能的等同生物学活性的片段，或其保守性变体。 

进一步地，本发明还提供了一种编码所述天青蛋白突变体的核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，或其简并性变体。本发明所述“简并性变体”是指由于遗传密码的简并性，编码所述天青蛋白突变体的核苷酸序列可能有多种碱基组成，其多核苷酸可以不同于参考的多核苷酸，但保留了编码所述蛋白质的基本。简并性变体核苷酸序列的变化不改变所述蛋白质的氨基酸序列。所述相应的核苷酸序列变体是指编码所述天青蛋白突变体等同生物学活性的片段或其保守性变体或衍生物的核酸序列。 

进一步地，本发明提供了制备所述蛋白复合物的方法，其用天青蛋白突变体作为药物载体，将含有咪唑环的铂类配合物的配体与该天青蛋白突变体配位结合得到。 

更具体地，所述制备蛋白复合物的方法，具体包括如下步骤： 

第一步：将天青蛋白的cDNA连接到原核表达载体上，得到一个天青蛋白的表达质粒； 

第二步：运用定点突变技术将第一步中得到的表达质粒中的编码天青蛋白铜结合位点上的组氨酸的密码子突变为甘氨酸或丙氨酸的密码子，得到用于表达天青蛋白突变体的表达质粒； 

第三步：将上述表达质粒转化入原核表达体系中，表达得到天青蛋白突变体，并进行纯化分离； 

第四步：制备所述含有咪唑基团的四价铂配合物； 

第五步：将铜离子存在的条件下，向天青蛋白突变体中加入含有咪唑基团的四价铂配合物，混匀后即可得到蛋白复合物。 

优选的，第五步中：所述铜离子的浓度或与天青蛋白突变体物质量的关系为1:1–5:1；所述反应的条件为常温；所述天青蛋白突变体与四价铂配合物的物质量比为1:1–10:1。 

进一步地，本发明提供了一种药物组合物，其含有治疗有效剂量的所述蛋白复合物，还含有其他药学上可接受的辅料。 

进一步地，本发明提供了一种肿瘤治疗剂，其含有治疗有效剂量的所述蛋白复合物，还含有其他药学上可接受的辅料；还任选的包含一种或多种有效剂量的其它已知抗肿瘤药物。 

本发明所述的“治疗有效剂量”是指能够对于待治疗的肿瘤产生积极效果的量。具体的，根据待治疗的肿瘤类型、患者的发病阶段、一般状况（包括年龄、体重）以及给药方式、给药途径等因素的不同，临床医生可根据其经验判断并采用具体的“治疗有效剂量”。一般而言，所述治疗有效剂量是在0.01mg-10mg铂/每千克体重的范围内。 

本发明所述组合物中辅料为制剂领域技术人员知晓，包括但不限于赋形剂、崩解剂、粘合剂、着色剂等均可以使用，只要所述辅剂不影响本发明所述蛋白复合物的作用。 

在本发明所述用于肿瘤治疗的治疗剂中还可以额外地含有其它已知的抗肿瘤药物，从而与本发明所述蛋白复合物一起，产生协同作用，治疗肿瘤。 

本发明的有益效果如下： 

本发明通过细菌蛋白天青蛋白的一类突变体与一类配基含有咪唑环的四价铂类配合物通过配位结合形成的一类复合物，使之具有二者共同的优点，增加了天青蛋白的肿瘤细胞杀伤能力同时，又减少四价铂类配合物对正常细胞的毒副作用。 

本发明提供的四价铂类配合物与天青蛋白突变体的结合方式为四价铂类配合物通过咪唑基团代替天青蛋白中被突变的组氨酸的咪唑基团与铜原子配 位，将四价铂类配合物配位结合到天青蛋白突变体的铜原子中心上。肿瘤细胞生长抑制实验结果表明，含四价铂配合物的天青蛋白具有较好的肿瘤细胞生长抑制作用，具有作为抗肿瘤药物的应用前景。 

附图说明

图1实施例1中所用原核表达载体pST-GB1的图谱； 

图2实施例3中天青蛋白突变体的Tricine-SDS-PAGE电泳图； 

图3实施例4四价铂配合物一维核磁谱图； 

图4实施例9中四价铂配合物与对应蛋白药物复合物的肿瘤细胞生长抑制实验结果。 

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明的具体技术方案进行具体的说明。 

本发明中所述的酶、试剂盒、载体、宿主菌等可由商业途径得到，如大肠杆菌(Escherichia coli)BL21和Top10的菌株购自NEB公司，铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa(Schroeter)Migula(ATCC15692^TM)的菌株购自美国模式培养物集存库（ATCC），SspI和DpnI等酶购自Takara公司，PCR引物、细菌基因组DNA抽提试剂盒和PCR扩增试剂盒购自上海生工生物工程公司等，所述的化学药品和试剂如咪唑、氯化钠、氯化铜等购自国药集团化学试剂有限公司。实施例中未注明具体条件者，按常规或制造商建议的条件进行。 

实施例1：构建天青蛋白的表达载体 

用SspI酶（购自Takara公司）酶切含有一个N端含有(His)₆-标签、C端含有TEV酶切位点的GB1标签的原核表达载体pST-GB1（图谱见附图1），酶切4小时（具体条件见下表1-1）。琼脂糖胶电泳,胶回收得到SspI酶切后的pST-GB1载体。其中，pST-GB1载体是本实验室在商用pET21a的基础上改造的质粒，将pET21a上NdeI和BamHI酶切位点间的序列切除，并连上含有(His)₆-标签、GB1助溶标签及一段含SspI酶酶切位点的LIC序列的一段序列。以SEQ ID NO：3作为正向引物，SEQ ID NO：4作为反向引物(SEQ ID NO： 3和SEQ ID NO：4均购自上海生工生物工程公司)，以含有天青蛋白基因的铜绿假单胞菌(Pseudomonas Aeruginosa）的基因组DNA为模板（基因组DNA通过上海生工生物工程公司的细菌基因组DNA抽提试剂盒从铜绿假单胞菌菌株中提取，菌株购自ATCC），通过生工的PCR扩增试剂盒扩增天青蛋白的cDNA（具体条件见下表1-2、1-3)。琼脂糖胶电泳之后胶回收得到天青蛋白的cDNA。 

用T4 DNA聚合酶（购自Takara公司）37°C处理SspI酶酶切后的pST-GB1载体和PCR扩增得到的天青蛋白cDNA（见表1-4）。并将两者按摩尔比1:5混合,30°C水浴连接30分钟，得到表达天青蛋白蛋白的质粒。 

将质粒转入大肠杆菌Top10感受态菌株中，涂板，37°C孵育24小时后,获得单克隆转化子。将该克隆扩大培养，抽提质粒得到大量质粒，供实施例2使用。 

表1-1：SspI酶酶切pST-GB1质粒 

pST-GB1>16μL>ddH₂O>10μL>10xSspI缓冲液>3μL>SspI酶>1μL>

表1-2：扩增天青蛋白的cDNA的PCR反应体系 

ddH₂O>30.5μL>10xPCR缓冲液>5μL>2mM dNTP(mix)>5μL>25mM MgCl₂3μL>10mM正向引物>2.5μL>10mM反向引物>2.5μL>铜绿假单胞菌的基因组DNA>1μL>Taq DNA聚合酶>0.5μL>

表1-3：扩增天青蛋白的cDNA的PCR热循环参数 

表1-4：T4DNA聚合酶处理SspI酶酶切后的pST-GB1质粒和PCR扩增得到的天青蛋白cDNA 

SspI酶切的pST-GB1质粒>15μL>天青蛋白cDNA>15μL>0.1%BSA>2μL>0.1%BSA>2μL>10mM dCTP>1μL>10mM dGTP>1μL>10xT4 DNA聚合酶缓冲液>2μL>10xT4 DNA聚合酶缓冲液>2μL>T4 DNA聚合酶>0.2μL>T4 DNA聚合酶>0.2μL>

实施例2：定点突变法构建天青蛋白突变体蛋白的分子克隆载体。 

对实施例1中得到的质粒运用定点突变技术将天青蛋白的铜结合位点上的组氨酸突变为疏水氨基酸甘氨酸，得到天青蛋白突变体的质粒，具体步骤如下： 

以SEQ ID NO：5为正向引物，以SEQ ID NO：6为反向引物(SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6均购自上海生工生物工程公司)，以实施例1中得到的质粒为模板，用Takara PrimerSTAR^TM HS DNA Polymerase with GC Buffer试剂盒PCR扩增（具体条件见表2-1和表2-2）；琼脂糖凝胶电泳后胶回收PCR产物；用DpnI酶（购自Takara公司）37℃处理PCR产物1小时（见表2-3）；将酶切后的PCR产物转化入大肠杆菌Top10感受态菌株中，涂板，获得转入该克隆载体的单克隆转化子。将该克隆扩大培养，抽提质粒得到大量质粒，即天青蛋白突变体的分子克隆载体。测序天青蛋白突变体的质粒，所得天青蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO1所示。 

表2-1：定点突变天青蛋白的PCR反应体系 

ddH₂O>31μL>5xPrime STAR buffer>10μL>2mM dNTP>5μL>10mM正向引物>1μL>

[0055] 

10mM反向引物>1μL>实施例1得到的质粒>1μL>Primer STAR>1μL>

表2-2：定点突变天青蛋白的PCR热循环参数 

表2-3：DpnI酶酶切PCR产物 

PCR产物>17μL>10xtango Buffer>2μL>DpnI酶>1μL>

实施例3：天青蛋白突变体的表达和纯化 

将实施例2中得到的质粒转入BL21(DE3)感受态细菌中，涂布平板，挑取一个单克隆转化子，扩大培养至1升的LB培养基（每升培养基含0.1毫克氨苄青霉素）中培养；至OD₆₀₀=0.8时，加入氯化铜(终浓度为20μmol/L)和异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG,终浓度为0.2mmol/L)中，25℃诱导10小时。 

在25℃条件，用4000转每分钟转速收菌20分钟；用Ni-NTA重悬缓冲液重悬细菌（30毫升缓冲液每升细菌）；超声破碎细菌，在4℃条件下16000转每分钟离心细胞破碎液30分钟，抽滤上清，得到细胞破碎液的上清。 

将上清倒入Ni-NTA亲和层析树脂柱（上海生工生物工程公司）中，4℃条件下旋转摇床摇30分钟，使(His)₆-GB1-天青蛋白突变体融合蛋白结合到Ni-NTA亲和层析树脂柱上；放去穿透液，用10毫升洗杂缓冲液洗去杂蛋白；用20毫升洗脱缓冲液洗脱融合蛋白。收集洗脱缓冲液，用烟草蚀斑病毒酶16℃酶切12小时。 

通过透析或超滤，除去缓冲液中的咪唑。将酶切后的酶切液倒入Ni-NTA亲和层析树脂柱中，在旋转摇床中4℃条件下旋转30分钟，使(His)₆-GB1标签、(His)₆-GB1-天青蛋白突变体融合蛋白及烟草蚀斑病毒酶结合到Ni-NTA亲和层析树脂柱上。收集穿透液，用10毫升洗杂缓冲液洗去Ni-NTA亲和层析树脂柱上的天青蛋白突变体，收集洗杂缓冲液。 

将收集的穿透液和洗杂缓冲液中加入过量的二硫苏糖醇和乙二胺四乙酸，超滤浓缩，用Hiload16/60Superdex 75（购自GE Health）分子筛色谱柱进一步纯化，得到天青蛋白突变体。 

得到的天青蛋白突变体的Tricine-SDS-PAGE电泳图见附图2，左边泳道为蛋白标准Marker（购自Thermo Science），从上到下分子量分别为66.2kDa、45.0kDa、35.0kDa、25.0kd、18.4kDa和14.4kDa，右边泳道为天青蛋白突变体。 

注：1.Ni-NTA重悬缓冲液：50mmol/L磷酸缓冲液pH8.0（配方见下表3-1），200mmol/L氯化钠 

2.洗杂缓冲液：50mmol/L磷酸缓冲液pH8.0，200mmol/L氯化钠，20mmol/L咪唑 

3.洗脱缓冲液：50mmol/L磷酸缓冲液pH8.0，200mmol/L氯化钠，250mmol/L咪唑 

表3-1：0.1mol/L磷酸缓冲液pH8.0配方 

实施例4：c,c,t-[Pt(NH₃)₂Cl₂(succinic acid-histidine)(OH)]的制备 

将1mmol的顺铂溶解在5毫升水中，与10mmol的双氧水在50℃搅拌反应2小时，室温过夜搅拌10小时，旋转蒸发除去溶剂得到固体，经冷水、乙醚各反复洗涤3次，真空环境下干燥，得黄色固体。 

将1mmol上述得到的固体溶解在5毫升的二甲基甲酰胺，与1mmol的丁二酸酐在30℃搅拌反应12小时，旋转蒸发除去溶剂得到固体，用丙酮、乙醚各洗涤3次，真空环境中干燥，得到浅黄色固体。 

按每2mmol组氨酸溶于10毫升的二甲基甲酰胺（含1-5%N,N-二异丙基乙胺）中与过量的芴甲氧羰基和三苯甲基在30℃反应5小时，将其主链的氨基和侧链的咪唑基保护起来。 

上述芴甲氧羰基和三苯甲基保护的组氨酸混合液与1mmol的经二甲基甲酰胺活化后的树脂反应3小时，加入20%哌啶切去组氨酸上芴甲氧羰基和三苯甲基保护基，用二甲基甲酰胺洗去切下的芴甲氧羰基、三苯甲基和没有接在树脂上的组氨酸。此时得到结合在树脂上的组氨酸。 

将2mmol的轴向单取代丁二酸的四价铂类配合物与1mmol1-羟基苯并三唑、1mmol苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸盐和1mmol N,N-二异丙基乙胺在二甲基甲酰胺环境中与上述结合在树脂上的组氨酸30℃反应12小时，用1%的TFA切下结合在树脂上的物质，用二甲基甲酰胺、异丙醇、正己烷各洗涤3次将该物质从树脂上分离，旋转蒸发除去溶剂得到固体，用丙酮、乙醚各洗涤3次，真空环境中干燥，得到浅黄色固体，结构式如下图所示： 

制得的浅黄色固体一维核磁谱图见附图3，可以证明产物为c,c,t-[Pt(NH₃)₂Cl₂(succinic acid-histidine)(OH)]。其中化学位移为δ(ppm)=4.69对应D₂O溶剂峰；δ(ppm)=8.56对应咪唑环上的C2上的H；δ(ppm)=7.22对应咪唑环上C4上的H；δ(ppm)=4.44对应组氨酸残基上的主链上C7上的H；δ(ppm)=3.18和δ(ppm)=3.06对应组氨酸残基上的侧链上C6上的两个H；δ(ppm)=2.46和δ(ppm)=2.58分别对应四价铂配位的丁二酸酐上C13和C14上的四个H。 

实施例5：c,c,t-{Pt[(1R,2R)-cyclohexane-1,2-diamine](ethanedioato-O,O’)(succinic acid-histidine)(OH)]的制备 

用奥沙利铂代替实施例4中的原料顺铂，采用相同的条件、方法和步骤，最终可制备得到 

c,c,t-{Pt[(1R,2R)-cyclohexane-1,2-diamine](ethanedioato-O,O’)(succinic acid-histidine)(OH)}，结构式如下： 

实施例6：c,c,t-[Pt(NH₃)₂Cl₂(succinic acid-histidine)(OH)]配位的蛋白药物复合物的制备 

将实施例3中表达的1mmol天青蛋白突变体蛋白与1mmol的CuCl₂混匀后,得到结合二价铜的天青蛋白突变体，加入0.2mmol实施例4合成的c,c,t-[Pt(NH₃)₂Cl₂(succinic acid-histidine)(OH)]，在水溶液中，25℃条件下混合均匀，反应1小时，即可得到c,c,t-[Pt(NH₃)₂Cl₂(succinic acid-histidine)(OH)]配位的结合的天青蛋白突变体的复合物。 

实施例7：c,c,t-{Pt[(1R,2R)-cyclohexane-1,2-diamine](ethanedioato-O,O’)(succinic acid-histidine)(OH)}配位的蛋白药物复合物的制备 

将实施例3中表达的1mmol天青蛋白突变体蛋白与1mmol的CuCl₂混匀后,得到结合二价铜的天青蛋白突变体，加入0.1mmolc,c,t-{Pt[(1R,2R)-cyclohexane-1,2-diamine](ethanedioato-O,O’)(succinic acid-histidine)(OH)}，在水溶液中，25℃条件下混合均匀，反应1小时，即可得到c,c,t-{Pt[(1R,2R)-cyclohexane-1,2-diamine](ethanedioato-O,O’)(succinic acid-histidine)(OH)}配位的天青蛋白突变体的复合物。 

实施例8：c,c,t-{Pt(NH₃)₂(dichloroaceticacid)[OC(O)(CH₂)₃-imidazole](OH)}配位的蛋白药物复合物的制备 

将实施例3中表达的1mmol天青蛋白突变体蛋白与1mmol的CuCl₂混匀后,加入0.5mmol c,c,t-{Pt(NH₃)₂(dichloroaceticacid)[OC(O)(CH₂)₃-imidazole](OH)}，在水溶液中，25℃条件下混合均匀，反应1小时，即可得到 c,c,t-[Pt(NH₃)₂(dichloroaceticacid)(OCH₂(O)(CH₂)₃-imidazole)(OH)]配位的结合天青蛋白突变体的复合物。 

实施例9：本发明制备的铂类配合物的药用效果试验 

一、细胞培养 

将MCF-7乳腺癌细胞和MCF-10A正常细胞在含10％小牛血清的转每分钟I-1640培养基中于37℃、5％CO₂培养箱中培养。实验选用对数生长期细胞。 

二、MTT法测定细胞活性 

细胞毒性实验选用对数生长期细胞20000个每毫升接种在96孔板内，每孔100微升，培养24小时后更换新鲜的培养基，设置实验组、对照组和空白组，实验组加入不同浓度梯度的药物，对照组不加入药物，空白组没有接种细胞且不加药物；继续培养72小时后噻唑蓝（MTT）法测定细胞活性，计算出实验组的细胞存活率，从而得到药物的细胞毒性。 

1、收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100微升,铺板使待测细胞密度为2000个每孔，（边缘孔用无菌PBS缓冲液填充）。 

2、5%CO₂，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物，每个浓度设3复孔。 

3、5%CO₂，37℃孵育72小时，倒置显微镜下观察。 

4、弃去旧的培养基加入新鲜培养基100微升，然后每孔加入25微升MTT溶液（5mg/mL，即0.5%MTT），继续培养2小时。 

6、每孔加入100微升细胞裂解液，5%CO₂，37℃培养过夜，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光度A值。 

存活率（％）=[实验组(S)的A值-空白(B)A值]/[对照组(C)的A值-空白(B)的A值] 

实验结果表明：上述实施例中的四价铂和四价铂蛋白复合物对于MCF-7细胞均具有较好的肿瘤细胞毒性，而四价铂蛋白复合物对于正常的MCF-10A细胞毒性与天青蛋白类似，效果较四价铂弱。 

肿瘤细胞生长抑制实验结果见图4，其中图中的Azurin为实施例3中制备的天青蛋白突变体；图中的His-Pt为实施例4中制备的c,c,t-[Pt(NH₃)₂Cl₂ (succinic acid-histidine)(OH)]；图中的His-Pt2为实施例5中制备的c,c,t-{Pt[(1R,2R)-cyclohexane-1,2-diamine](ethanedioato-O,O’)(succinic acid-histidine)(OH)}；图中的Im-Pt为实施例8中的四价铂类配合物c,c,t-{Pt(NH₃)₂(dichloroaceticacid)[OC(O)(CH₂)₃-imidazole](OH)}；图中的Azurin-His-Pt1为实施例6中得到的蛋白药物复合物；图中的Azurin-His-Pt2为实施例7中制备的蛋白药物复合物；图中的Azurin-Im-Pt为实施例8中得到的蛋白药物复合物。（注：上述蛋白药物复合物的蛋白和铂类药物的混合比例均相同，为蛋白和四价铂类药物摩尔比为5:1，蛋白复合物浓度指复合物中铂的浓度） 

以上所述仅是本发明的优选实施方式，需要指出的是，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，而且，在阅读了本发明的内容之后，本领域相关技术人员可以对本发明做出各种改动或修改，这些等价形式同样落入本申请所附权利要求书所限定的范围。