一种测定水稻植株对苯达松的敏感性的方法和筛选水稻植株的方法

摘要

本发明公开了一种测定水稻植株对苯达松的敏感性的方法，该方法包括如下步骤：（1）对待测水稻植株的秧苗施用苄嘧磺隆，并在施用苄嘧磺隆后继续栽培；（2）测量苄嘧磺隆处理后的秧苗的株高；（3）将所述苄嘧磺隆处理后的秧苗的株高与同秧龄的未施用苄嘧磺隆的秧苗进行比较，如果所述苄嘧磺隆处理后的秧苗的株高小于所述同日龄的未施用苄嘧磺隆的秧苗的株高，则判定所述待测水稻植株的秧苗对苯达松敏感。本发明还提供了一种筛选苯达松敏感的水稻植株的方法。本发明能够较为简单快捷地测定水稻植株对苯达松的敏感性，并且本发明的方法不会导致待测的水稻植株的死亡，经过本发明的方法进行测定后的水稻植株仍具有繁殖传代能力。

说明书

技术领域

本发明涉及农业育种领域，具体地，涉及一种测定水稻植株对苯达松的 敏感性的方法和一种筛选苯达松敏感的水稻植株的方法。

背景技术

两系法杂交水稻利用的是不育性受光温调控的光温敏核不育系，高温不 育型不育系一般在日平均气温24℃以上保持不育、在日平均气温23℃以下 恢复为可育，低温不育型不育系一般在日平均气温29℃以下保持不育、在日 平均气温30℃以上恢复为可育。但气温的变化常常超出人们预期，在预期不 育期内出现的气温异常变化可以导致制种田的不育系产生可育花粉而自交 结实，导致所生产杂交种的纯度下降而报废，给种子生产者带来严重的经济 损失，成为了制约两系法杂交水稻发展的瓶颈。此外，一些水稻细胞质雄性 不育系（如龙特浦A、II-32A和粤泰A等）也存在异常高温条件下自交结实 的情况。

杂交水稻制种是利用可育的恢复系（父本）给不育的不育系（母本）授 粉，从而达到在不育系植株上生产杂交种的目的。达到这个目的要求不育系 和恢复系按一定的行比分开种植、分开收割，需要人工多次操作，劳动力成 本高且容易产生恢复系混杂，急需机械化制种技术替代人工操作。

为了解决上述水稻不育系育性不稳定导致的杂交种不纯和实现杂交稻 机械化制种的问题，主要提出了如下2种方法。

1）利用除草剂抗性基因。本发明的发明人于1996年提出把抗除草剂基 因导入水稻恢复系，制种后由于基因显性效应而赋予水稻杂交种除草剂抗 性，而制种过程中由于异常气温等影响产生的不育系自交结实种子不具备除 草剂抗性，通过秧田或大田喷施除草剂可以方便的杀死混杂在水稻杂交种中 的自交不育系，从而提高杂种纯度；如果把抗除草剂基因导入水稻不育系， 在制种田中待恢复系授粉之后，就可以喷施除草剂把恢复系杀死，而具有抗 性的不育系及其所结杂交种得以存活，从而实现父母本混播和杂交种的机械 化收获，详细描述可以参考文献（作物对除草剂的抗性及其在杂种优势中应 用策略的探讨，杂交水稻,1997,12(5):1-3）。常用的抗性基因有Bar（抗草铵 磷除草剂），Epsps（抗草甘膦除草剂），Als（抗磺酰脲类除草剂）等。

2）利用除草剂敏感基因。与除草剂抗性基因相反，把除草剂敏感基因 导入不育系，由于恢复系为野生型（不敏感，具有抗性），制种后由于基因 显性效应而水稻杂交种仍具有抗性，而制种过程中由于异常气温等影响产生 的不育系自交结实种子对除草剂敏感，通过秧田或大田喷施除草剂可以方便 的杀死混杂在水稻杂交种中的自交不育系，从而提高杂种纯度；如果把除草 剂敏感基因导入水稻恢复系，在制种田中待恢复系授粉之后，就可以喷施除 草剂把混播的恢复系杀死，而野生型（具有抗性）不育系及其所结杂交种得 以存活，从而实现父母本混播和杂交种的机械化收获，详细描述可以参考文 献（水稻农林8号m苯达松敏感致死性的遗传及其应用前景，杂交水稻,1999, 14(2):39-40；水稻光-温敏雄性不育系化学致死突变体的诱变筛选与初步研 究，中国水稻科学，1999，13(2):65-68；水稻光温敏核不育系育性波动的解 决途径和方法，杂交水稻,2000,15(4):4-5；水稻除草剂敏感基因的研究与利 用，安徽农业科学，2000，28(2):141-142）。常用的敏感基因有bel，携带bel 基因的植株对苯达松敏感。苯达松，又名灭草松，即3-异丙基(1H)-苯并-2,1,3- 噻二嗪-4-(3H)-酮2,2二氧化物，CAS NO：25057-89-0，是一种光合作用抑 制剂，可阻碍敏感植物的光合作用，它进入水稻体内能代谢为活性弱的糖轭 合物而解毒，对水稻安全，常用于水稻田防除莎草科及阔叶杂草。苯达松敏 感突变体携带隐性基因bel，它对除草剂苯达松敏感，能被田间正常使用剂 量的苯达松杀死。

抗除草剂的水稻在大田中筛选简单，喷施除草剂后存活的植株为抗除草 剂单株。但是，除草剂敏感的水稻在田间直接选择技术难度大，因为喷施除 草剂会杀死需要的敏感株，不喷施除草剂又不能确定它是否对除草剂敏感。

常用的选择苯达松敏感的水稻植株的方法有：1）两代选择。当代分单 株收集后代种子，每个单株一分为二，一份播种用于验证除草剂敏感性，一 份用于传代。这种方法可靠性强，但费时较多，增大了育种工作量。2）剂 量选择。苯达松对敏感水稻的伤害有一个过程，随着剂量的提高伤害会加重， 到一定剂量导致死亡。因此，可以在选择敏感单株时使用会造成伤害、但又 不会致死的剂量处理要筛选的群体，根据伤害症状选择敏感单株。这种方法 节约时间，当代可以选择，减小了单株的保存和选择数量，减小了育种工作 量；但缺点也很明显，就是剂量难于掌握，伤害症状判断需要较熟练的技术， 且伤害症状易受到栽培条件影响而出现判断偏差。

因此，现有的测定水稻植株对苯达松的敏感性的方法均存在操作复杂、 耗时耗力的缺陷。

发明内容

本发明的目的是克服现有的测定水稻植株对苯达松的敏感性的方法均 存在操作复杂、耗时耗力的缺陷，提供一种简单快捷的测定水稻植株对苯达 松的敏感性的方法。

本发明的发明人出乎意料地发现，水稻植株对苄嘧磺隆的敏感性与对苯 达松的敏感性之间存在关联，但苄嘧磺隆只影响水稻植株的株高而不会致死 水稻植株，并且施用了苄嘧磺隆的水稻植株还能正常结种传代，从而将苄嘧 磺隆用于测定水稻植株对苯达松的敏感性，由此得到本发明。

苄嘧磺隆，又名农得时，即3-(4,6-二甲氧基嘧啶-2-基)-1-(2-甲氧基甲酰 基苄基)磺酰脲，CAS NO：83055-99-6，是一种磺酰脲类除草剂，可阻碍敏 感植物亮氨酸、异亮氨酸、颉氨酸的生物合成，它进入水稻体内能迅速代谢 为无害物质，对水稻安全，常用于水稻田防除莎草科及阔叶杂草。

本发明提供了一种测定水稻植株对苯达松的敏感性的方法，其特征在 于，该方法包括如下步骤：（1）对待测水稻植株的秧苗施用苄嘧磺隆，并在 施用苄嘧磺隆后继续栽培，得到苄嘧磺隆处理后的秧苗；其中，继续栽培的 时间为3-15天；（2）测量所述苄嘧磺隆处理后的秧苗的株高；（3）将所述 苄嘧磺隆处理后的秧苗的株高与同秧龄的未施用苄嘧磺隆的秧苗进行比较， 如果所述苄嘧磺隆处理后的秧苗的株高小于所述同日龄的未施用苄嘧磺隆 的秧苗的株高，则判定所述待测水稻植株的秧苗对苯达松敏感。

本发明还提供了一种筛选苯达松敏感的水稻植株的方法，其特征在于， 该方法包括：根据如上所述的方法测定水稻植株对苯达松的敏感性，然后筛 选出对苯达松的敏感性相对较高的水稻植株，其中，对苯达松的敏感性相对 较高的水稻植株是指：苄嘧磺隆处理后的秧苗的株高小于同秧龄的未施用苄 嘧磺隆的秧苗的株高的75%的水稻植株。

通过上述技术方案，本发明能够较为简单快捷地测定水稻植株对苯达松 的敏感性，并且本发明的方法不会导致待测的水稻植株的死亡，经过本发明 的方法进行测定后的水稻植株仍具有繁殖传代能力。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与 下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在 附图中：

图1是苯达松敏感水稻的秧苗和野生型水稻的秧苗在苄嘧磺隆处理后的 株高对比图。左边矮株为苯达松敏感植株，右边高株为野生型植株。

图2是通过苄嘧磺隆处理后获得矮株（苯达松敏感型）后代能被苯达松 杀死，而高株（野生型）后代不能被杀死的对比图。左边存活株系为鄂早18 号（野生型对照）；死亡株系为矮株（苯达松敏感型）繁殖后代，能被苯达 松杀死；右边存活株系为分离群体中的高株（野生型）繁殖后代。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描 述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

本发明提供了一种测定水稻植株对苯达松的敏感性的方法，其特征在 于，该方法包括如下步骤：（1）对待测水稻植株的秧苗施用苄嘧磺隆，并在 施用苄嘧磺隆后继续栽培，得到苄嘧磺隆处理后的秧苗；其中，继续栽培的 时间为3-15天；（2）测量所述苄嘧磺隆处理后的秧苗的株高；（3）将所述 苄嘧磺隆处理后的秧苗的株高与同秧龄的未施用苄嘧磺隆的秧苗进行比较， 如果所述苄嘧磺隆处理后的秧苗的株高小于所述同日龄的未施用苄嘧磺隆 的秧苗的株高，则判定所述待测水稻植株的秧苗对苯达松敏感。

其中，秧龄是指从播种日期计算的秧苗的日龄。

其中，所述苄嘧磺隆处理后的秧苗的株高越小，则指示该株高对应的水 稻植株对苯达松的敏感性越高。

其中，株高是指茎基部至最长叶片的长度。与同秧龄的、且同时施用苄 嘧磺隆的野生型秧苗相比，苯达松敏感水稻植株在所述苄嘧磺隆处理后的秧 苗的株高较矮，苯达松敏感型水稻秧苗高度不到野生型秧苗高度的75%。

其中，苄嘧磺隆的施用量没有特别的要求，可以为将苄嘧磺隆用作除草 剂的常规剂量，如1.3-1.7克/亩，或者如0.62-1.85g/亩，优选情况下，苄嘧 磺隆的施用量为0.9-1.8g/亩，进一步优选为0.9-1.0g/亩。

其中，待测水稻植株的秧苗的种植密度没有特别的要求，可以为常规的 水稻种植密度，例如可以为2000-12000株/平方米（即133万-800万株/亩）， 优选地，待测水稻秧苗种植密度为7000-8000株/平方米，更优选地为7500 株/平方米。

其中，施用苄嘧磺隆的时机为水稻秧苗期的1叶1心期至5叶1心期， 如1叶1心期、2叶1心期、3叶1心期、4叶1心或5叶1心期，优选地， 待测水稻植株的秧苗处于3叶1心期至4叶1心期。

其中，继续栽培的时间优选为5-9天。

其中，所述水稻植株为苯达松敏感水稻突变体和该类突变体的杂交后代 或衍生品系，所述水稻植株的其它特性没有特别的限定，如各亚种（籼稻、 粳稻、爪哇稻）、各生态型（早稻、中稻、晚稻）的水稻植株。优选地，本 发明采用科244BS、鄂早18号以及由科244BS和鄂早18号杂交后产生的 F₂代分离群体，其中，科244BS为苯达松敏感突变体的衍生品系，能被苯达 松杀死，鄂早18号为对苯达松不敏感的野生型水稻，不会被田间正常使用 剂量的苯达松杀死，由科244BS和鄂早18号杂交后产生的F₂代分离群体中 含有野生型和敏感型2种水稻植株。

根据实验数据，苯达松敏感的水稻植株在苄嘧磺隆处理后，苄嘧磺隆处 理后的秧苗的株高小于同秧龄的未施用苄嘧磺隆的秧苗的株高的75%，更优 选地小于70%；因此，本发明还提供了一种筛选苯达松敏感的水稻植株的方 法，其特征在于，该方法包括：根据如上所述的方法测定水稻植株对苯达松 的敏感性，然后筛选出对苯达松的敏感性相对较高的水稻植株，其中，对苯 达松的敏感性相对较高的水稻植株是指：苄嘧磺隆处理后的秧苗的株高小于 同秧龄的未施用苄嘧磺隆的秧苗的株高的75%的水稻植株；优选情况下，对 苯达松的敏感性相对较高的水稻植株是指：苄嘧磺隆处理后的秧苗的株高小 于同秧龄的未施用苄嘧磺隆的秧苗的株高的70%的水稻植株。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，水稻植株为 科244BS、鄂早18号以及科244BS/鄂早18号的F₂代分离群体，盆栽的种 植密度均为200粒/盆（盆栽所用的盆子规格为18cm×12cm，发芽率约81%， 折合秧苗密度约7500株/平方米，即500万株/亩），随机取20株作为样本考 察结果，苯达松为江苏建农农药化工有限公司的市售品、苄嘧磺隆和二氯喹 啉酸为常州汇凯生物科技有限公司市售品。

实施例1：

科244BS为发明人利用8077S/SE21S杂交选育而成的对苯达松敏感的 稳定品系，即已知科244BS的水稻植株为苯达松敏感水稻水稻植株。使用苄 嘧磺隆，按照表1所示的剂量处理苯达松敏感水稻科244BS。处理时期为3 叶1心期，药物施用7天后测定平均株高，并以清水作为对照，以二氯喹啉 酸作为参照，结果如表1所示。

表1

  处理（3叶1心期）   处理剂量   折合每亩剂量   平均株高/cm   相对株高   对照组（清水）   0   0   23.42   100%   苄嘧磺隆处理组   35μg/盆   1.08g/亩   11.26   47.82%   二氯喹啉酸参照组   450μg/盆   13.89g/亩   23.54   100.51%

表1的结果表明，苯达松敏感的水稻植株在受到苄嘧磺隆处理后，株高 明显下降，株高只有对照组的47.82%。

实施例2：

用苄嘧磺隆不同剂量（0-60μg/盆）处理3叶1心期盆栽（盆栽所用的 盆内部长18cm，宽12cm，高6cm）的上述苯达松敏感水稻科244BS的秧 苗，7天后考察株高（茎基部至最长叶片的长度，为20株平均数，单位：cm）， 结果如表2所示。

表2

  处理剂量(μg/盆)   折合每亩剂量(g/亩)   株高(cm)   相对株高   0(CK)   0   23.11   100%   5   0.15   23.40   101.25%   10   0.31   22.63   97.92%   15   0.46   21.81   94.37%   20   0.62   17.35   75.07%   25   0.77   14.12   61.09%   30   0.93   11.67   50.49%   35   1.08   11.52   49.84%   40   1.24   10.49   45.39%   45   1.39   9.81   42.44%   50   1.54   9.93   42.96%   55   1.70   9.17   39.67%   60   1.85   9.39   40.63%

表2显示，苄嘧磺隆从剂量20μg/盆开始具有较明显的降低株高效果， 剂量20-25μg/盆处于过渡阶段，剂量30μg/盆及以后增加剂量的降低株高效 果不再明显增加。确定具有稳定效果的苄嘧磺隆用量为30-60μg/盆，折合每 亩用量为0.9-1.8克。考虑到节约资源，减少可能对环境的影响，一般苄嘧 磺隆用量为每亩0.9-1.0克即可。

实施例3：

用苄嘧磺隆（30μg/盆）处理1叶1心至5叶1心期盆栽（盆栽所用的 盆内部长18cm，宽12cm，高6cm）的上述苯达松敏感水稻科244BS的秧 苗，7天后考察株高（茎基部至最长叶片的长度），结果如表3所示。

表3

如表3所示，1叶1心至5叶1心期进行处理，处理和对照相对株高均 有明显差别；但秧苗太小（1叶1心至2叶1心）处理后株高相差值不大， 不利于田间选择，太小也不利于秧苗移栽；秧苗5叶1心处理、7天后观察 结果时秧龄期超过一般要求，不适时栽插对后续大田生长不利。因此，田间 选择3叶1心至4叶1心期秧苗处理，处理与对照高度相差较明显（绝对高 度差和相对高度差均较大），有利于观察效果、区分敏感型与野生型，且能 保证适时移栽。

实施例4：

用苄嘧磺隆（30μg/盆）处理3叶1心期盆栽（盆栽所用的盆内部长18cm， 宽12cm，高6cm）的上述苯达松敏感水稻科244BS的秧苗，处理后第1、3、 5、7、9、11、13、15天后观察株高，结果如表4所示。

表4

发现处理后第5天开始即可达到8厘米以上的明显差异，处理后第15 天观察也有9厘米以上的明显差异。但推迟观察造成的后果是秧苗生长较长、 较细，不利于移栽，并且秧龄期太长也不利于大田生长，特别是早稻材料会 出现早穗。因此，较适宜的观察期为处理后第5-9天；一般选处理后7天观 察结果，获得敏感水稻植株后直接移栽大田。

实施例5：

已知科244BS/鄂早18号的F₂代分离群体中会同时出现苯达松敏感的水 稻植株，也会出现苯达松不敏感的水稻植株。

用苄嘧磺隆（30μg/盆）处理3叶1心期盆栽（盆栽所用的盆内部长18cm， 宽12cm，高6cm）的科244BS/鄂早18号F₂群体，7天后取样照相，结果如 图1所示，其中有矮株和高株的明显分离，矮株为苯达松敏感植株，高株为 野生型植株。分别取矮株20株（4盆）、高株5株（1盆）盆栽栽培直到成 熟；成熟时12个矮株收到足量种子，3个高株收到足量种子；这些共计15 个株系种子烘干后，连同鄂早18号（野生型对照）一起播种于秧田，用苯 达松（0.1g/平方米喷雾）处理3叶1心期秧苗，10天后照相，结果如图2 所示。

图1表明敏感株与不敏感株在苄嘧磺隆处理后的株高相差明显，完全可 以在田间通过目测判断来确定。图2表明来源于苄嘧磺隆导致的矮株的水稻 能被苯达松杀死，来源于苄嘧磺隆导致的高株的水稻不能被苯达松杀死，因 此证明了用苄嘧磺隆筛选苯达松敏感植株是可靠的。

本发明方法与现有苯达松敏感水稻筛选技术相比，具有以下特点：①不 使用对苯达松敏感水稻致死的除草剂苯达松，杜绝了可能由于剂量、操作技 术把握不准产生的误杀。②使用苄嘧磺隆的安全剂量范围广，在试验使用剂 量范围内没有发现对苯达松敏感水稻致死情况，安全性高。③使用苄嘧磺隆 处理后的苯达松敏感型与野生型水稻株高差异明显，易于田间目测判断。这 将极大的方便水稻育种工作中进行苯达松敏感植株的选择，提高水稻育种效 率。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实 施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方 案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特 征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必 要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其 不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。