杨木片造纸制浆用复合酶液的生产方法及应用

摘要

本发明公开了一种杨木片造纸制浆用复合酶液的生产方法，其特征是将各组份酶经称量、复配罐混合配制、防腐、检验、包装后存放于5℃库房中，所述各组份酶为碱性果胶酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶和木质素酶；其在杨木片造纸制浆中的应用为造纸原料经预处理后送入蒸煮锅进行酶处理，即将原料用复合酶液浸泡，酶处理条件为：温度40℃～60℃，绝干原料与复合酶液的质量比为100∶1.2～1.8，浸酶时间30分钟～80分钟；酶处理后在蒸煮锅中蒸煮，本发明各组分酶的活力高，且复合酶液中各组份酶对结晶纤维素、羧甲基纤维素均没有活性；与传统化学制浆法比较，用碱量降低50%左右，废水中COD含量降低30%以上，生产成本降低20%左右，且提高了纸的产品品质。

说明书

技术领域

本发明涉及一种造纸制浆，具体地说是一种杨木片造纸制浆，特别是涉及一种杨木片造纸制浆用复合酶液的生产方法及应用。 

背景技术

随着社会的发展和人民生活水平的提高，我国纸和纸制品的消费在高速增长，已成为世界第二大纸和纸制品的消费市场。国际上造纸原料94﹪为木材，由于我国森林资源匮乏，木浆主要依赖进口。杨木片也是我国重要的造纸原料之一。但是，传统的杨木片化学法制浆工艺污染严重，黑液处理难度大，费用高。致使造纸企业面临较大的环保压力和沉重的经济负担。 

目前，造纸制浆主要有两大类技术路线。1、化学制浆方法，添加助剂、调整工艺对污染污物进行回收处理。2、生物制浆方法，应用生物制浆技术从源头减少污染。对前者来讲：主要借助国际惯用的技术——“碱回收”系统来解决污染问题，但“碱回收”系统仍存投资大，处理费用高，且白泥二次污染等问题。对于后者来讲：生物制浆技术是从源头上减少污染，提高原料的利用率，且经生物处理后的黑液可再次转化为有机肥进行二次利用，是近年来被专家学者和企业大力关注开发的一种新型制浆技术。 

现有的生物制浆方法主要有两类：一类是采用微生物直接处理原料；一类是采用酶处理原料。 

采用微生物直接处理原料的，如公开号为CN1683711A，发明名称为一种造纸生物制浆工艺；公开号为CN1420229A，发明名称为一种造纸草浆制浆工艺；公开号为CN101225614A，发明名称为一种以生物发酵制浆法替代化学制浆工艺的造纸工艺方法；公开号为CN1188830A，发明名称为生物脱木素——机械制浆技术等专利申请都是采用微生物直接处理原料，它们的主要缺点有：⑴生物处理周期长，一般需几天时间；⑵微生物处理前，一般应对原料进行灭菌处理，增加了生产成本，同时有可能降低原料质量；⑶生物处理过程难以有效控制，常常出现处理后的原料质量均匀性差，碳水化合物降解严重等问题，导致制浆得率降低；⑷生物处理后原料质量均匀性差，还直接影响制浆质量，从而影响最终的产品质量；⑸采用上述方法生产出的纸浆与普通化学浆相比，纸浆的物理性能及漂白性能都较差，不能用来生产高白度、高强度的纸张，只能用来生产低档次的纸张。 

采用酶处理原料的，如公开号为CN1616758A，发明名称为生物制浆工艺；公开号为CN1421570A，发明名称为草类原料酶法制浆的方法等专利，该工艺的主要缺点是：酶液的成本高，在工业化生产中不占有成本优势；同时，木质素酶、木聚糖酶、半纤维素酶对相应成分的破坏难以控制，可能过多去除木质素、木聚糖、半纤维素，影响纸浆得率。 

公开号为CN 101914510A，发明名称为一种碱性果胶酶生产方法及在造纸制浆中的应用的专利公开了一种碱性果胶酶及在造纸制浆中的应用，即将造纸原料在浸酸、浸碱处理后，用碱性果胶酶液浸泡，酶处理后再在蒸煮锅中蒸煮。但是，其工艺复杂，原料需浸酸、浸碱后再进行酶处理，存在以下不足：一是酶种单一，浸酶时间长；二是需新增设备，增加成本；三是需新增浸酸、浸碱步骤，新增污染，不利于工业化生产使用。 

发明内容

本发明的目的是提供一种杨木片造纸制浆用复合酶液的生产方法及应用，所述复合酶液的酶活力高，单位生产成本低，发酵周期短，工业化程度高，工艺过程简单易控，且复合酶液中各组份酶对结晶纤维素、羧甲基纤维素均没有活性，应用于造纸制浆，可降低造纸生产成本和环境污染，同时有助提高纸的产品品质。 

本发明是采用如下技术方案实现其发明目的的，一种杨木片造纸制浆用复合酶液的生产方法，将各组份酶经称量、复配罐混合配制、防腐、检验、包装后存放于5℃库房中，所述各组份酶为碱性果胶酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶和木质素酶；所述碱性果胶酶为CCTCC NO：M 2010004菌种经菌种培养、摇瓶发酵，种子罐到发酵罐、过滤、除菌、防腐处理后制备；所述木聚糖酶为CGMCC NO：5466菌种经菌种培养、摇瓶发酵，种子罐到发酵罐、过滤、除菌、防腐处理后制备；所述甘露聚糖酶为CGMCC NO：6226菌种经菌种培养、摇瓶发酵，种子罐到发酵罐、过滤、除菌、防腐处理后制备；所述木质素酶为CGMCC NO：6225菌种经菌种培养、摇瓶发酵，种子罐到发酵罐、过滤、除菌、防腐处理后制备；所述复合酶液中碱性果胶酶的活力为500u/ml～1000u/ml，木聚糖酶的活力为2500u/ml～3500u/ml，甘露聚糖酶的活力为1500u/ml～2000u/ml，木质素酶的活力为1000u/ml～2000u/ml。 

上述复合酶液在杨木片造纸制浆中的应用，造纸原料经预处理后送入蒸煮锅进行酶处理，即将原料用复合酶液浸泡，酶处理条件为：pH值7.0～9.5，温度40℃～60℃，绝干原料与复合酶液的质量比为100:1.2～1.8，绝干原料与水的质量比为1:4～8，浸酶时间30分钟～80分钟；酶处理后在蒸煮锅中蒸煮，蒸煮条件为：NaOH用量为绝干原料质量的10﹪～14﹪，温度120℃～150℃，时间50分钟～120分钟。 

本发明的酶处理条件优选为：pH值8.0～9.0，温度50℃～55℃，绝干原料与复合酶液的质量比为100:1.5，绝干原料与水的质量比为1:5～7，浸酶时间40分钟～50分钟。 

由于采用上述技术方案，本发明较好的实现了发明目的，各组分酶的活力高，单位成本低，发酵周期短，工业化程度高，且复合酶液中各组份酶对结晶纤维素、羧甲基纤维素均没有活性；应用于造纸制浆，无需增加设备，工艺简单、使用方便，与传统化学制浆法比较，用碱量降低50﹪左右，废水中COD含量降低30﹪以上，生产成本降低20﹪左右，且提高了纸的产品品质。 

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。 

实施例1： 

一种杨木片造纸制浆用复合酶液的生产方法，将各组份酶经称量、复配罐混合配制、防腐、检验、包装后存放于5℃库房中，所述各组份酶为碱性果胶酶、木聚糖酶和甘露聚糖酶；所述碱性果胶酶为CCTCC NO：M 2010004菌种经菌种培养、摇瓶发酵，种子罐到发酵罐、过滤、除菌、防腐处理后制备；所述木聚糖酶为CGMCC NO：5466菌种经菌种培养、摇瓶发酵，种子罐到发酵罐、过滤、除菌、防腐处理后制备；所述甘露聚糖酶为CGMCC NO：6226菌种经菌种培养、摇瓶发酵，种子罐到发酵罐、过滤、除菌、防腐处理后制备；所述复合酶液中碱性果胶酶的活力为800u/ml～1200u/ml，木聚糖酶的活力为1000u/ml～2500u/ml，甘露聚糖酶的活力为2000u/ml～3000u/ml。

本发明所述的CCTCC NO：M 2010004菌种是在中国宁夏土壤中通过自然采集菌样，从近百株菌株中经摇瓶筛选得到二株出发菌株，并在细胞水平下采用亚硝基胍和紫外线辐射诱变得到近万株菌株，经过摇瓶筛选得到一株实验室编号为MAPLE61的菌株，即耐热枯草芽胞杆菌（Heat～resistant Bacillus subtilis），其生物学特性为：菌体呈杆状，菌体两端较平整、单个细胞(0.7～0.75)*(2.5～2.9)微米，无荚膜，周生鞭毛，菌落乳白色，革兰氏染色阳性，需氧菌，液体培养生长期菌体多数呈链状排例且以三连体或四连体居多；形成芽胞，芽孢形态椭圆到杆状，（0.6～0.8）*（1.0～1.4）微米，位于菌体中央或稍偏。该菌种已于2010年1月11日提交中国典型培养物保藏中心保藏（湖北省武汉市武汉大学），保藏号为：CCTCC NO：M 2010004，并于2010年1月15日提交了保藏存活证明。 

该菌种的斜面培养基配方为：1000mL蒸馏水中，加入牛肉膏5g～10g，酵母膏5g～10g，蛋白胨10g～15g，葡萄糖5g～10g，氯化钠5g～10g，碳酸钠0.3～0.5g，琼脂粉20g，调pH值6.9～7.1，0.1MPa灭菌20分钟～30分钟，制成试管斜面，接种该菌种，33℃～35℃，培养18小时～24小时。 

该斜面菌种通过摇瓶发酵检验菌种产酶能力合格后，可以作为种子扩培使用或发酵产酶使用。 

摇瓶发酵的培养条件是：以质量计，培养基配方(﹪)麦麸6～8、玉米粉0.5～1、玉米浆（氮含量40﹪）1～2、氯化钠0.5～0.8、碳酸钠0.2～0.3、纤维质粉1～2、水85.0～91.0，其中所述各组分之和为100﹪，灭菌前，调pH值为8.0～8.5，0.1MPa灭菌25分钟～35分钟，培养条件：33℃～35℃，转速260 r/分钟 ～280r/分钟，培养18小时～22小时。 

酶液制备为由茄瓶斜面到种子罐到发酵罐，二级发酵，制备标准化酶液。以质量计，其培养基配方为（﹪）麦麸6～8、玉米粉0.5～1、玉米浆（氮含量40﹪）1～2、氯化钠0.5～0.8、碳酸钠0.2～0.3、纤维质粉1～2、水85.0～91.0，其中所述各组分之和为100﹪，灭菌前，调pH值为8.0～8.5，0.1MPa灭菌25分钟～35分钟，装罐总体积不超过70％；种子罐的培养条件：温度（℃）：36℃～38℃，搅拌转速（r/分钟）：220，通气量（v/v） 0时～5时，1：0.40～0.46、5时以后1：0.50～0.56；发酵罐的培养条件：温度（℃）：0小时～4小时，36～38，4小时以后33～35，搅拌转速（r/min）：0小时～4小时，180，4小时～6小时，200，6小时以后220，通气量（v/v）：0小时～4小时，1：0.25～0.27，4小时～6小时，1：0.33～0.36，6小时以后1：0.5～0.55。 

酶液制备后，制备标准碱性果胶酶液，将发酵醪液经过板框过滤、硅藻土除菌，经防腐处理得到在15℃密封存放三个月条件下，酶活力保持率为95﹪以上的标准碱性果胶酶液。 

本发明碱性果胶酶的酶活力测定是用DNS显色，分光光度计比色法测得。其测定条件为：以1﹪的果胶为底物在pH9.6、60℃水浴反应10分钟，加DNS沸水浴显色，550nm比色。酶活力单位定义为：在测定条件下，每小时水解果胶产生1mg还原糖（以半乳糖醛酸计）所需的酶量定义为一个酶活力单位。 

以上内容已在专利号为201010238630.4、发明名称为一种碱性果胶酶生产方法及在造纸制浆中的应用的专利申请中详细描述，其保藏存活证明也已随申请向中国专利局提交。 

本发明所述的CGMCC NO：5466菌种是在中国宁夏采集，在菌种选育筛选过程中，采用了试管液体培养基反应DNS显色初步定性筛选和摇瓶产酶定量筛选的方法，筛选出一株实验室编号为KERR89的高产菌株，根据主要生理生化特征及16S rRNA基因序列、gyrB基因序列等实验数据综合分析鉴定为沙福芽孢杆菌（Bacillus safensis），其生物学特性为：革兰氏染色阳性菌，产芽孢，菌体呈短杆状，单细胞直径小于1um，以二分裂方式增殖；在本发明所述培养基上菌落呈圆形，白色、表面光滑，均一，边缘整齐，略有光泽，黏稠。该菌种已于2011年11月17日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏（北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号：CGMCC NO：5466，并于同日提交了保藏存活证明。 

该菌种的斜面培养基配方为：蛋白胨0.5﹪～1﹪、牛肉膏0.3﹪～0.5﹪、酵母膏0.3﹪～0.5﹪、葡萄糖0.3﹪～0.5﹪、氯化钠0.3﹪～0.5﹪、琼脂1.8﹪～2.2﹪、水94.8﹪～96.5﹪，其中所述各组分之和为100﹪，调pH值6.9～7.1，0.1MPa灭菌20分钟～30分钟，制成试管斜面，接种该菌种，32℃～35℃，培养24小时～26小时。 

该斜面菌种通过摇瓶发酵检验菌种产酶能力合格后，可以作为种子扩培使用或发酵产酶使用。 

摇瓶发酵的培养条件是：以重量计，培养基配方为麦麸5﹪～8﹪、纤维质粉1.5﹪～2﹪、葡萄糖0.3﹪～0.5﹪、硫酸铵0.3﹪～0.5﹪、玉米浆1﹪～2﹪、磷酸氢二钾0.1﹪～0.2﹪、氯化钠0.3﹪～0.5﹪、水86.3﹪～91.5﹪，其中所述各组分之和为100﹪，灭菌前，调pH值为8.0～8.5，0.1MPa灭菌20分钟～35分钟，培养条件：33℃～35℃，摇床转速260 r/min ～280r/min，培养48小时～52小时。 

酶液制备为由茄瓶斜面到种子罐到发酵罐，二级发酵，制备标准化酶液。 

种子培养基配方为：以重量计，麦麸5﹪～8﹪、玉米粉1.5﹪～2﹪、硫酸铵0.3﹪～0.5﹪、玉米浆1﹪～2﹪、磷酸氢二钾0.1﹪～0.2﹪、氯化钠0.3﹪～0.5﹪、水86.8﹪～91.8﹪，其中所述各组分之和为100﹪，灭菌前，调pH值为6.5～7.0，0.1MPa灭菌30分钟～35分钟，种子罐装料总体积不超过70％；培养条件：温度33℃～38℃，搅拌转速180 r/min～220 r/min，通气量以v/v 计：0小时～5小时，1：0.40～0.46，5小时以后，1：0.50～0.56，罐压0.06 MPa～0.07MPa，培养周期为7小时～9小时。 

产酶发酵罐的培养基配方为：以重量计，麦麸5﹪～8﹪、纤维质粉1.5﹪～2﹪、葡萄糖0.3～0.5﹪、硫酸铵0.3﹪～0.5﹪、玉米浆1﹪～2﹪、磷酸氢二钾0.1﹪～0.2﹪、氯化钠0.3﹪～0.5﹪、水86.3﹪～91.5﹪，其中所述各组分之和为100﹪，灭菌前，调pH值为8.0～8.5，0.1MPa灭菌30分钟～35分钟，装料总体积不超过70﹪；培养条件：温度33℃～38℃，搅拌转速180 r/min～220 r/min，通气量以v/v 计：0小时～2小时，1：0.40 ～0.42，2小时～4小时，1:0.50～0.52，4小时～6小时，1:0.55～0.68，6小时以后1:0.60～0.62，罐压0.06 MPa～0.07MPa，发酵周期为48小时～52小时。 

酶液制备后，制备标准化木聚糖酶液。将产酶发酵罐的发酵醪液经过板框过滤、硅藻土除菌，经防腐处理得到在15℃密封存放三个月条件下，酶活力保持率为95﹪以上的标准木聚糖酶液。 

本发明木聚糖酶的活力测定方法为，用pH值为9.0，0.1mol/L的甘氨酸—氢氧化钠缓冲液为溶剂配制2﹪木聚糖（sigma来自于桦木产品）溶液。吸取0.9ml底物于15ml刻度试管中，在要求温度水浴平衡3min，加入0.1ml适当稀释酶溶液，反应10min，加入3ml  3，5～二硝基水杨酸试剂，沸水浴中显色15min，冷凉后用蒸馏水定容至15ml，分光光度计550nm波长测光吸收值。酶活力定义为，在测定条件下每小时水解底物产生1mg还原糖（以木糖计，）所需酶量定义为一个酶活力单位（u）。 

本发明所述的CGMCC NO：6226菌种是在中国宁夏采集，在菌种选育筛选过程中，筛选出一株实验室编号为PARK9639的高产菌株，根据主要生理生化特征及16S rRNA基因序列、gyrB基因序列等实验数据综合分析鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），该菌种已于2012年06月15日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏（北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号：CGMCC NO：6226，并于同日提交了保藏存活证明。 

该菌种的斜面培养基配方为：1000mL蒸馏水中，加入牛肉膏3g～8g，酵母膏3g～8g ，蛋白胨8g～12g，葡萄糖3g～5g ，氯化钠3g～5g，调pH值6.9～7.1，0.1MPa灭菌28分钟～32分钟，制成试管斜面，接种该菌种，34℃～36℃，培养20小时～24小时。 

该斜面菌种通过摇瓶发酵检验菌种产酶能力合格后，可以作为种子扩培使用或发酵产酶使用。 

摇瓶发酵的培养条件是：以质量计，培养基配方为：魔芋粉3﹪～4﹪、麦麸2﹪～4﹪、氮含量40％的玉米浆0.5﹪～1﹪、酵母膏0.5﹪～1﹪，磷酸氢二铵0.2﹪～0.3﹪、磷酸氢二钾0.02﹪～0.05﹪、蛋白胨0.1﹪～0.2﹪、硫酸镁0.02﹪～0.05﹪、碳酸钠0.20﹪～0.25﹪、水89.15﹪～93.46﹪，其中所述各组分之和为100﹪，灭菌前，调pH值为pH8.0～pH8.5，0.1MPa灭菌30分钟～35分钟，培养条件：32℃～37℃，摇床转速260 r/min ～280r/min，培养34小时～42小时。 

酶液制备为由茄瓶斜面到种子罐到发酵罐，二级发酵，制备标准化酶液。 

种子培养基配方为：以质量计，麦麸5﹪～6﹪、玉米粉1﹪～2﹪、氮含量40﹪的玉米浆1﹪～2﹪、氯化钠0.4﹪～0.6﹪、碳酸钠1﹪～2﹪、硫酸铵0.3﹪～0.5﹪、水86.9﹪～91.3﹪，其中所述各组分之和为100﹪，灭菌前，调pH值为6.5～7.0，0.1MPa灭菌30分钟～35分钟；种子罐装料总体积不超过70﹪，培养条件为：温度33℃～38℃，搅拌转速180 r/min～220 r/min，通气量以v/v 计：0小时～4小时，1：0.25 ～0.27 ，4小时～6小时，1:0.33 ～0.36 ，6小时以后，1:0.50 ～0.55，罐压0.06 MPa～0.07MPa，培养周期为7小时～9小时。 

产酶发酵罐的培养基配方为：以质量计，魔芋粉3﹪～4﹪、麦麸2﹪～4﹪、氮含量40％的玉米浆0.5﹪～1﹪、酵母膏0.5﹪～1﹪，磷酸氢二铵0.2﹪～0.3﹪、磷酸氢二钾0.02﹪～0.05﹪、蛋白胨0.1﹪～0.2﹪、硫酸镁0.02﹪～0.05﹪、碳酸钠0.20﹪～0.25﹪、水89.15﹪～93.46﹪，其中所述各组分之和为100﹪，灭菌前，调pH值为8.0～8.5，0.1MPa灭菌30分钟～35分钟，装料总体积不超过70﹪；培养条件：温度33℃～38℃，搅拌转速180 r/min～220 r/min，通气量以v/v 计：0小时～4小时，1：0.30 ～0.32 ，4小时～6小时，1:0.40～0.42，6小时以后1:0.50～0.55，罐压0.06 MPa～0.07MPa，发酵周期为34小时～42小时。 

酶液制备后，制备标准化甘露聚糖酶液。将产酶发酵罐的发酵醪液经过板框过滤、硅藻土除菌，经防腐处理得到在15℃密封存放三个月条件下，酶活力保持率为95﹪以上的标准甘露聚糖酶液。 

甘露聚糖酶的酶活力测定方法为，利用0.05mol/L pH6.0的十二水合磷酸氢二钠和一水合柠檬酸缓冲液配制0.5%的槐豆胶溶液。在0.9ml该底物溶液中加入0.1ml适当稀释的酶溶液，50℃准确计时反应10min，在550nm测光吸收值。其酶活力定义为，在测定条件下每小时水解槐豆胶产生1mg还原糖（以甘露糖计）所需酶量定义为一个酶活力单位（u）。 

本发明所述的CGMCC NO：6225菌种是在中国宁夏采集，在菌种选育筛选过程中，筛选出一株实验室编号为KERR7989的高产菌株，根据主要生理生化特征及16S rRNA基因序列、gyrB基因序列等实验数据综合分析鉴定为阿拉提芽孢杆菌（Bacillus altitudinis），该菌种已于2012年06月15日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏（北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号：CGMCC NO：6225，并于同日提交了保藏存活证明。 

该菌种的斜面培养基配方为：1000mL蒸馏水中，加入牛肉膏5g～10g，酵母膏5g～10g，蛋白胨10g～15g，葡萄糖5g～10g，氯化钠3g～8g，调pH值6.9～7.1，0.1MPa灭菌20分钟～30分钟，制成试管斜面，接种该菌种，33℃～35℃，培养18小时～24小时。 

该斜面菌种通过摇瓶发酵检验菌种产酶能力合格后，可以作为种子扩培使用或发酵产酶使用。 

摇瓶发酵的培养条件是：以质量计，培养基配方为：麦麸6﹪～8﹪、纤维质粉1﹪～2﹪、氮含量40﹪的玉米浆1﹪～2﹪、硫酸铵0.3﹪～0.5﹪、磷酸氢二钾0.1﹪～0.2﹪、蛋白胨0.5﹪～1﹪、硫酸镁0.03﹪～0.05﹪、碳酸钠0.2﹪～0.3﹪，水85.95﹪～90.7﹪，其中所述各组分之和为100﹪，灭菌前，调pH值为8.0～8.5，0.1MPa灭菌25分钟～35分钟，培养条件：33℃～35℃，摇床转速260 r/分钟 ～280r/分钟，培养48小时～52小时。 

酶液制备为由茄瓶斜面制得细胞液体种子到种子罐，再到产酶发酵罐，二级发酵，制备标准化酶液。 

种子培养基配方为：以质量计，麦麸5﹪～6﹪、玉米粉1﹪～2﹪、氮含量40﹪的玉米浆1﹪～2﹪、氯化钠0.4﹪～0.6﹪、碳酸钠1﹪～2﹪、硫酸铵0.3﹪～0.5﹪、水86.9﹪～91.3﹪，其中所述各组分之和为100﹪，灭菌前，调pH值为6.5～7.0，0.1MPa灭菌25分钟～35分钟；种子罐装料总体积不超过70﹪，培养条件为：温度33℃～38℃，搅拌转速180 r/min～220 r/min，通气量以v/v 计：0小时～4小时，1：0.25 ～0.27 ，4小时～6小时，1:0.33 ～0.36 ，6小时以后，1:0.50 ～0.55，罐压0.06 MPa～0.08MPa，培养周期为7小时～9小时。 

产酶发酵罐的培养基配方为：以质量计，麦麸6﹪～8﹪、纤维质粉1﹪～2﹪、氮含量40﹪的玉米浆1﹪～2﹪、硫酸铵0.3﹪～0.5﹪、磷酸氢二钾0.1﹪～0.2﹪、蛋白胨0.5﹪～1﹪、硫酸镁0.03﹪～0.05﹪、碳酸钠0.2﹪～0.3﹪、水85.95﹪～90.87﹪，其中所述各组分之和为100﹪，灭菌前，调pH值为8.0～8.5，0.1MPa灭菌25分钟～35分钟，装料总体积不超过70﹪；培养条件：温度33℃～38℃，搅拌转速180 r/min～220 r/min，通气量以v/v 计：0小时～4小时，1：0.30 ～0.32 ，4小时～6小时，1:0.40～0.42，6小时以后1:0.50～0.55，罐压0.06 MPa～0.07MPa，发酵周期为36小时～42小时。 

酶液制备后，制备标准化木质素酶液。将产酶发酵罐的发酵醪液经过板框过滤、硅藻土除菌，经防腐处理得到在15℃密封存放三个月条件下，酶活力保持率为95﹪以上的标准木质素酶液。 

木质素酶的酶活力的测定方法：配置0.2mg/L的丁香醛连氮溶液装入黑色试剂瓶中冰箱保存5天内有效。使用时将其用 25mmol/L pH7.5的Tris缓冲液稀释10倍，吸取2.5ml该底物溶液中加入0.5ml适当稀释的酶溶液，30℃准确计时反应5min，在530nm测光吸收值。酶活力定义为，酶在测定条件下每小时作用底物使吸光值每增加1.0个单位时定义为1个酶活力单位（u）。 

将制备好的碱性果胶酶液、木聚糖酶液、甘露聚糖酶液和木质素酶液经称量、复配罐混合配制、防腐、检验、包装后存放于5℃库房中备用，所述复合酶液中碱性果胶酶的活力为500u/ml～1000u/ml（本实施例为1000u/ml），木聚糖酶的活力为2500u/ml～3500u/ml（本实施例为2000u/ml），甘露聚糖酶的活力为1500u/ml～2000u/ml（本实施例为1600u/ml），木质素酶的活力为1000u/ml～2000u/ml（本实施例为1800u/ml）。 

上述复合酶液在杨木片造纸制浆中的应用，造纸原料经预处理后送入蒸煮锅进行酶处理，即将原料用复合酶液浸泡，酶处理条件为：pH值7.0～9.5，温度40℃～60℃，绝干原料与复合酶液的质量比为100:1.2～1.8，绝干原料与水的质量比为1:4～8，浸酶时间20分钟～60分钟；酶处理后在蒸煮锅中蒸煮，蒸煮条件为：NaOH用量为绝干原料质量的10﹪～14﹪，温度120℃～150℃，时间30分钟～120分钟。 

本发明的酶处理条件优选为：pH值8.0～9.0，温度50℃～55℃，绝干原料与复合酶液的质量比为100:1.5，绝干原料与水的质量比为1:5～7，浸酶时间40分钟～50分钟。 

本实施例pH值8.5，温度55℃，绝干原料与复合酶液的质量比为100:1.5，绝干原料与水的质量比为1:8，浸酶时间50分钟。酶解完成后进入蒸煮工序，蒸煮时的蒸煮条件为：NaOH用量为绝干原料质量的12﹪，温度150℃，时间110分钟。通过高温高压的蒸煮，酶被彻底灭活，对后续工艺不会产生任何不良影响。 

本发明将复合酶液应用于杨木片造纸制浆中，复合酶液中的各组份酶有效水解原料中高耗化工料的果胶、果胶质、杂多糖等物质，可直接降低化工料用量；同时，各组份酶酶解植物组织中细胞与细胞之间相粘连的中胶层中的果胶、果胶质，木质素使细胞与细胞疏离或分开，木质素脱落，形成毛细孔；酶解细胞壁中的木聚糖、木质素等形成的网络，导致网络结构破坏和细胞壁结构松动，出现裂隙，为化工料直接迅速渗透到植物空腔并直接作用于木质素创造条件，从而提高化工料利用率，达到降低化工料用量目的。 

在减少碱等化工料的无效消耗方面：果胶酶水解原料中的果胶质，木聚糖酶水解原料中的木聚糖，甘露聚糖酶水解原料中的甘露聚糖、木质素酶降解原料中的木质素，减少了碱等化工料作用于果胶质、木聚糖、甘露聚糖等杂多糖的消耗，减少了碱等化工料作用在部分木质素上的消耗，从而达到直接降低碱等化工料消耗的目的。 

在提高碱等化工料的可及性和利用率方面：通过果胶酶水解原料孢间层中的果胶质，木聚糖酶水解木聚糖，甘露聚糖酶水解甘露聚糖使孢间层的粘连物质减少，使细胞疏离形成空隙和毛细孔利于碱等化工料的快速渗入，木质素酶降解原料中的木质素使木素碎片脱落，纤维素暴露，提高碱等化工料的可及性和作用效率。 

木聚糖酶不产纤维素酶，不损伤纤维，且甘露聚糖酶、木质素酶为碱性酶，适应于碱性环境、热稳定性好，对结晶纤维素、羧甲基纤维素均没有活性，不影响纸浆强度。 

本发明经在以杨木片为原料的造纸厂工业化生产实践表明，与传统化学制浆法比较，用碱量降低50﹪左右，蒸煮时间也下降30分钟以上，废水中COD含量降低30﹪以上，生产成本降低20﹪左右，且提高了纸的产品品质。