一种强迫性障碍相关基因GalR1的多态性位点及其应用

摘要

本发明公开了一种强迫性障碍相关基因GalR1的单核苷酸多态性位点的检测方法以及在诊断强迫性障碍方面的应用。本发明中GalR1基因的单核苷酸多态性位点rs1944545为G等位位点，在其DNA互补链上为C等位位点，以及由位于该基因上的SNP位点rs4621062、rs11662010、rs5373、rs5374、rs4890921和rs1944545组成的单倍型AACTTG；利用本发明提供的强迫性障碍相关基因及其多态性位点的核酸序列，构建对强迫性障碍进行遗传学诊断的试剂盒，可应用于对强迫性障碍的辅助诊断和对个体是否具有强迫性障碍的易感性进行判别，有利于疾病的预防、早期诊断、治疗和新药开发。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术的基因领域，具体的说，本发明涉及一种与强迫性障碍相关的基因 GalR1及其多态性位点，本发明还涉及分析GalR1基因等位基因突变的方法，以及GalR1基 因单核苷酸多态性在诊断强迫性障碍方面的用途。

背景技术

强迫性障碍是一种常见的精神疾病，人群中患病率在1.8-3.0％。患者主要临床表现为强 迫观念或强迫行为，这些强迫观念或强迫行为引起患者的显著苦恼，并花费大量时间(每天花 费1小时以上)，或者严重地干扰了患者的日常生活、职业(学业)功能、社交活动或人际关 系。根据世界卫生组织公布的数据，在世界范围内，强迫性障碍的致残率列各种疾病的前10 位。双生子研究和家系研究发现遗传因素在强迫性障碍的发病机制中起重要作用(Pauls D L.Dialogues in Clinical Neuroscience.2010；Vol 12(2)：149-163)。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)是疾病的易感性、外显性、 抵抗性以及药物反应性等生物学性状差别的重要遗传学基础，很多疾病与基因突变或基因多 态性有关。不同于传统的单基因疾病的研究方式，目前对基因的相互作用、多个基因组合与 疾病关系的研究日益受到关注。随着SNPs的不断发现与基因组多态性和基因突变有关的数据 库dbSNP、HGBASE等相继建立，为从SNPs探讨复杂性疾病的机制提供了可行性，因此对疾病 家系病例进行连锁定位和选定区域的候选基因进行SNPs的关联研究，可能是多基因疾病遗传 学研究如强迫性障碍取得突破的希望(Ercan-Sencicek AG，Stillman AA，Ghosh AK，Bilguvar  K，Mason CE，Abbott T，Gupta A，King RA，Pauls DL，State MW.L-histidine  decarboxylase and Tourette’s syndrome.N Engl J Med.2010 May 20；362(20)：1901-1908.)。

甘丙肽(galanin)受体1(Galanin receptor 1，GalR1)基因全长2.1K，定位于染色 体上18q23区域，共有3个外显子，属于G蛋白偶联受体，在不同物种之间有高度的保守性。 GalR1的mRNA在中枢神经系统的所有区域均有表达，特别是在杏仁核、下丘脑、脊髓和背根 有高表达，并与多种神经递质共存，其中，GalR1与5-羟色胺1A受体(5-HT_1A)形成共聚体， 可能对情绪的调节起主要作用(Borroto-Escuela DO，Narvaez M，Marcellino D，Parrado C， Narvaez JA，Tarakanov AO，Agnati LF，Díaz-Cabiale Z，Fuxe K.Galanin receptor-1  modulates 5-hydroxtryptamine-1A signaling via heterodimerization.Biochem Biophys  Res Commun.2010 Mar 19；393(4)：767-772.)。激活GalR1可以活化其偶联的G_1/。蛋白，使 cAMP水平下降和打开内向整流钾离子通道。GalR1参与甘丙肽的镇痛、抑制加压素和醛固酮 的活性、调节摄食和代谢行为、抗惊厥和抗焦虑等生理功能。由于GalR1与神经递质的释放 有密切的关系，他们的表达异常可能与强迫性障碍或抑郁症等精神疾病的病理机制相关。

经对现有技术的国内外文献检索，至今未见有GalR1基因与强迫性障碍关联的研究报告， 也没有GalR1基因多态性位点与强迫性障碍的相关性的报道。

发明内容

本发明的目的在于揭示与强迫性障碍密切相关的GalR1基因多态性位点和区域，及其在 检测强迫性障碍易感人群的方法。

首先，本发明确定一种与强迫性障碍密切相关的易感基因GalR1，其特征在于GalR1基 因的SEQ ID NO：1所示序列的第137位单核苷酸多态性位点rs1944545为G，在其DNA互补链 上为C等位位点，以及由位于该基因上SNP位点rs4621062、rs11662010、rs5373、rs5374、 rs4890921和rs1944545组成的单倍型AACTTG的个体，即GalR1基因的SEQ ID NO：4所示序 列的第30位SNP位点rs4621062为A，在其DNA互补链上为T等位位点，第400位SNP位点 rs11662010为A，在其DNA互补链上为T等位位点；GalR1基因的SEQ ID NO：3所示序列的第 34位SNP位点rs5373为C，在其DNA互补链上为G等位位点，第368位SNP位点rs5374为 T，在其DNA互补链上为A等位位点；GalR1基因的SEQ ID NO：2所示序列的第139位SNP位 点rs4890921为T，在其DNA互补链上为A等位位点。

其次，本发明提供一种检测GalR1基因的单核苷酸多态性的方法，其特征在于，它包括 如下步骤：

(1)基因组DNA提取，用基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA；

(2)PCR扩增GalR1基因的6个SNP位点的目的片段；

(3)使用SAP碱性磷酸酶进行纯化，去除未反应完的dNTP等物质；

(4)使用根据GalR1基因的6个SNP位点设计的UEP引物进行SNP位点的单碱基延伸反应；

(5)使用飞行时间质谱仪进行扫描，根据各单碱基延伸引物的分子量的不同判断这些SNP位 点的差异；

(6)结果判定，GalR1基因SNP位点rs1944545为G，在其DNA互补链上为C等位位点，或 SNP位点rs4621062、rs11662010、rs5373、rs5374、rs4890921和rs1944545组成的单倍型 AACTTG的个体为强迫性障碍的易感人群。

再次，本发明提供了一种等位基因特异性的核酸引物，其特征在于，其长度为17-30bp， 具有SEQ ID NO：5、6、7或8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22 所示的序列，且特异性的扩增出含GalR1基因的SEQ ID NO：1所示序列中第137位的SNP扩 增产物或SEQ ID NO：2所示序列中第139位扩增产物，SEQ ID NO：3所示序列中第34位和368 位的扩增产物，SEQ ID NO：4所示序列中第30位和400位扩增产物。

最后，本发明提供了一种检测强迫性障碍的诊断试剂盒。包括：

(1)特异性扩增GalR1基因单核苷酸多态位点的引物6组；

(2)检测扩增产物与正常的GalR1基因相比是否存在变化的所需的试剂。

具体实施方式

以下结合具体实施例，以进一步说明本发明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而 不用于限制本发明的范围，在阅读本发明的下述内容后，本领域技术人员可以对本发明做各 种改动或修改，但改动或修改的等价形式同样落在本发明所限定的范围内。

1、技术路线

(1)本实施例中首先进行样本的收集和基因组DNA提取：

从山东青岛地区收集到散发的强迫性障碍患者224例，平均年龄29.36±14.67岁(标 准差)，其中女性85例；所有患者均符合强迫性障碍的DSM-IV(diagnostic and statistical manual of mental disorders，fourth edition)诊断标准，每个病人的诊断均经2位精神科 专家确认。同样来自山东青岛地区无血缘关系的健康自愿对照组419例，平均年龄37.44± 10.58岁(标准差)，其中女性为163例。全体参与者均为汉族，并在正式知情同意书上签字。 用基因组DNA提取试剂盒从人血液中提取DNA，浓度校正至5ng/ul.

(2)PCR扩增GalR1基因的6个SNP位点的目的片段：

本发明采用等位基因特异的实时聚合酶链反应技术(allele specific real time PCR) 对GalR1基因的6个SNP位点在强迫性障碍散发患者和正常对照组中的频率分布情况进行了 检测。PCR反应在ABI PRISM 7900荧光定量PCR仪进行，等位位点采用飞行时间质谱仪检测。

SNP位点rs1944545扩增引物：

正向引物：5′-ACGTTGGATGTCAAATCCTACCCACTGTGC-3′(SEQ ID NO：5)

反向引物：5′-ACGTTGGATGCTGTAAATCATCAGTGACGC-3′(SEQ ID NO：6)

SNP位点rs4890921扩增引物：

正向引物：5′-ACGTTGGATGGTCGTCATACCCTATCATGG-3′(SEQ ID NO：8)

反向引物：5′-ACGTTGGATGTATGATGCACCCCACTGAAG-3′(SEQ ID NO：9)

SNP位点rs5374扩增引物：

正向引物：5′-ACGTTGGATGTGGAGAACTTCGTCACGCTG-3′(SEQ ID NO：11)

反向引物：5′-ACGTTGGATGGGTGATCACTAGGCTGTTGC-3′(SEQ ID NO：12)

SNP位点rs5373扩增引物：

正向引物：5′-ACGTTGGATGTCGAGATCACCGTCCCTTC-3′(SEQ ID NO：14)

反向引物：5′-ACGTTGGATGTGCCTGGTGGCACCGTCTTT-3′(SEQ ID NO：15)

SNP位点rs11662010扩增引物：

正向引物：5′-ACGTTGGATGCCTTTCCCTTTGCACTTCTC-3′(SEQ ID NO：17)

反向引物：5′-ACGTTGGATGAAAATTGGCCGCCTAATCCC-3′(SEQ ID NO：18)

SNP位点rs4621062扩增引物：

正向引物：5′-ACGTTGGATGAAAAACACCGATGCGTTTCC-3′(SEQ ID NO：20)

反向引物：5′-ACGTTGGATGTTTGGATTACCCATCCCCTC-3′(SEQ ID NO：21)

单碱基延伸引物：

rs1944545：5′-TCAGTGACGCTGAATCC-3′(SEQ ID NO：7)

rs4890921：5′-GCAGCAAAGGAGGAAGA-3′(SEQ ID NO：10)

rs5374：5′-TCACTAGGCTGTTGCCCAGCAC-3′(SEQ ID NO：13)

rs5373：5′-GTGGCACCGTCTTTGCGCCG-3′(SEQ ID NO：16)

rs11662010：5′-ACTTCTCTCCTCTGTAGC-3′(SEQ ID NO：19)

rs4621062：5′-GATGCGTTTCCAGCATTC-3′(SEQ ID NO：22)

PCR扩增试剂：

灭菌双蒸水0.95ul，PCR缓冲液(含15mM MgCl₂)0.625ul，dNTP(2.5mM)1ul，MgCl₂(25mM)0.325ul，HotStar Taq酶(Qiagen)0.1ul，PCR引物1ul，DNA 1ul(5ng/1ul)。 PCR反应条件：94℃15分钟预变性；94℃20秒变性，56℃30秒退火，72℃1分钟延伸共 45个循环；最终72℃3分钟延伸。

(3)去磷酸消化剩余的dNTP：

反应体系：1.53ul水、0.17ul SAP缓冲液、0.3单位碱性磷酸酶(Sequenom)。

去磷酸反应条件：在37℃进行40分钟，然后85℃5分钟使酶失活。

(4)单碱基延伸反应：针对SNP的单碱基延伸引物在下列反应体系中进行：0.755ul水、 0.2ul 10X iPLEX缓冲液、0.2ul终止混合物、0.041ul iPLEX酶(Sequenom)，0.804ul 10uM 的延伸引物。

单碱基延伸反应条件：94℃30秒预变性；94℃5秒变性，52℃5秒退火，80℃5秒延 伸5个循环，共40个循环；最后72℃3分钟延伸。在终止反应物中加入6mg阳离子交换树 脂(Sequenom)脱盐，混合后加入25ul水悬浮。

(5)最终的分型产物点样到一块384孔的spectroCHIP(Sequenom)上，并用飞行时间质谱 进行分析。

2、GalR1基因SNP与强迫性障碍的相关性

统计：利用CLUMP 1.9 Version卡方分析(http://linkage.rockefeller.edu/soft/list. html)计算等位基因、基因型在强迫性障碍患者和正常对照组的频率分布，使用Haploview 程序计算出患者与正常对照之间的单倍型差异，统计学的显著性水平设定为p＜0.05。

结果：位于18q23区域的GalR1基因的多态性位点rs1944545(其等位位点对为A/G)等位 位点和基因型在强迫性障碍患者和正常对照组的频率分布(见表1)。GalR1基因的6个多态 性位点(rs4621062、rs11662010、rs5373、rs5374、rs4890921和rs1944545)组成的单倍 型AACTTG在年龄小于18岁的强迫性障碍患者和正常对照组中的频率分布有显著差异P＝0.007 (X2＝7.307)。

从表1中可以看出，GalR1基因上的常见单核苷酸多态性位点rs1944545的G等位位点， 即在其DNA互补链上为C等位位点，在患者群体中的分布频率远远大于正常对照组(P＝0.006)， 是产生强迫性障碍的一个危险等位位点。

因此GalR1基因SNP位点rs1944545为G，在其DNA互补链上为C等位位点，或SNP位点 rs4621062、rs11662010、rs5373、rs5374、rs4890921和rs1944545组成的单倍型AACTTG 的个体为强迫性障碍的易感人群。

表1.GalR1基因多态性位点rs1944545基因型、等位位点数在强迫性障碍患者和正常对 照组中的频率分布

OR：odds ratios；Cl：confidence intervals

3、检测试剂盒

制备检测强迫性障碍患者易感性的试剂盒，其中含有SEQ ID NO：1、2、3、4所示的序列 中6个单核苷酸多态性位点引物对。

其中，单核苷酸多态性位点rs1944545扩增引物如下：

正向引物：5′-ACGTTGGATGTCAAATCCTACCCACTGTGC-3′(SEQ ID NO：5)

反向引物：5′-ACGTTGGATGCTGTAAATCATCAGTGACGC-3′(SEQ ID NO：6)

单碱基延伸引物：5′-TCAGTGACGCTGAATCC-3′(SEQ ID NO：7)

用本检测方法提供的引物序列可以特异、高效的检测SEQ ID NO：1、2、3、4所示的序列 中的多态性位点。

本发明具有实用性的例证：

1)所建立的方法可用于分析人体的位于18q23区域GalR1基因上的常见型单核苷酸多态 性位点rs1944545位点的G等位位点在其DNA互补链上为C等位位点或6个SNP位点组成的 单倍型AACTTG的有无，来应用于对强迫性障碍的辅助诊断和对个体是否具有强迫性障碍易感 性进行评判。从而有利于疾病的预防、早期诊断和治疗。

2)可以利用本发明所介绍的方法以及上述1)所述rs1944545位点的G等位位点和单倍 型区域作为药物设计靶点来进行药物的筛选，寻找出具有调节GalR1表达的活性分子，促进 新的抗抑郁药物的开发(治疗强迫性障碍的药物主要是抗抑郁药)。

3)利用本发明提供的强迫性障碍相关的基因及其多态性位点的核酸序列，构建对强迫性 障碍进行遗传学诊断的试剂盒。

4)采用本发明提供的引物序列可以特异、高效的检测SEQ ID NO：1、2、3、4所示的序 列中的多态性位点。

5)由于GalR1与5-HT_1A基因形成共聚体，因此很可能参与了其它精神障碍如抑郁症、其 它神经症等的病理过程。因此，本发明为今后对GalR1基因与其它精神疾病的关系公开了前 期最宝贵的经验、基础研究和应用技术。