用于肺结核证候特征蛋白质检测的试剂盒及其应用

摘要

本发明公开了用于肺结核证候特征蛋白质检测的试剂盒及其应用，其包括iTRAQ同位素标记试剂，SAA1、IGHG3、IGHM、IGHA1、LAC2、IGLL5、HPT、HBA和HBD蛋白标准品。本发明的试剂盒能够筛选肺结核中医证候的特征性血清蛋白质，具有较高的特异性和准确性。

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白质组学技术领域，尤其涉及的是用于肺结核证候特征蛋白质检测的试剂 盒及其应用。

背景技术

血清蛋白质组组成成分、表达水平与证候有密切联系，用蛋白质组学方法分析动态变化 的蛋白质组，对统一肺结核证候辨证，规范证候分型，探讨证候的生物学本质有重要意义。 iTRAQ-2DLC-MS/MS是将iTRAQ同位素标记技术、二维液相色谱串联质谱技术相联用，能对 所有蛋白质进行同位素标记；与质谱联用时，信号离子表现为不同质荷比的峰，根据波峰的 高度及面积可得到准确的蛋白质定量信息，非常适合对多样本的平行分析，可用以发现更多 与疾病相关的特征蛋白。为此，应用iTRAQ-2DLC-MS/MS技术，研究肺结核证候的差异蛋白 质，获得能反映肺结核证候的特征性蛋白质，有助于研究肺结核中医证候的生物学本质。

SAA1(Serum amyloid A protein1)，即淀粉样蛋白1，是一种急性炎性蛋白，具有巨噬细 胞趋化作用；能通过促进脂肪分解(主要是甘油三酯TG的分解)、抑制脂肪生成、抑制机体 对脂肪酸利用等，使机体积累脂肪酸。

IGHG3(Ig gamma-3 chain C region)，即IgG3恒定区，也称IgG3Fc段，由B细胞合成分泌。 能与中性粒细胞、巨噬细胞上的IgG Fc受体(FcγR)结合，对巨噬细胞起调理作用，能促进巨噬 细胞吞噬作用。

IGHA1(Ig alpha-1 chain C region)，即IgA1恒定区，也称IgA1 Fc段，由B细胞合成分泌。 人IgA1抗体能通过其Fc段与Fcα受体1(FcαR1，也称CD89)结合抵抗机体Mtb感染，对机体 起保护作用。

IGHM(Ig mu chain C region)，即IgM恒定区，也称IgM Fc段，由B细胞合成分泌。IgM Fc 有很强的补体激活能力，Mtb可以通过IgM Fc激活补体C1q进而激活补体经典途径，补体通过 巨噬细胞表面的补体受体进入细胞，使Mtb和巨噬细胞的相互作用加强。

LAC2(Ig lambda-2 chain C regions)，即Igλ恒定区，也称Igλ Fc，是Ig轻链的恒定区(CL， Ig轻链Fc)，其含量变化与B细胞表达相关。

IGLL5(Immunoglobulin lambda-like polypeptide 5)，是一种类Igλ蛋白，该蛋白在B细胞 发育的前B细胞阶段具有关键作用，IGLL5蛋白缺失则B细胞发育被阻断。

HPT(Haptoglobin)，即触珠蛋白，是一种急性炎性蛋白，其主要功能是结合并消除红细 胞释放的血红蛋白，并阻止血液中活性氧的产生。HBA(Hemoglobin subunit alpha)为血红 蛋白α亚基，HBD(Hemoglobin subunit delta)为血红蛋白δ亚基，两者均参与从肺部到各种外 围组织的氧气运输。

发明内容

本发明所有解决的技术问题是如何提供一种能够筛选肺结核中医证候特征性血清蛋白质 的试剂盒。

本发明的技术方案如下：

本发明一方涉及用于肺结核证候特征蛋白质检测的试剂盒，其包括iTRAQ同位素标记试 剂，SAA1、IGHG3、IGHM、IGHA1、LAC2、IGLL5、HPT、HBA和HBD蛋白标准品。

在本发明的一个优选实施方式中，其特征在于所述的iTRAQ同位素标记试剂，包括安捷 伦多重吸附去高丰度蛋白液相色谱柱、iTRAQ试剂盒和Sep-Pak Vac C18反相硅胶吸附脱盐 柱。

本发明另一方面还涉及上述试剂盒在制备肺结核证候特征蛋白质的标记中的应用。

本发明另一方面还涉及上述试剂盒在检测离体血清样本中标记肺结核证候特征蛋白质中 的应用，其中所述的应用包括如下步骤：

(1)血清于-80℃中取出，待4℃自然溶解，将血清样品使用Agilent multiple affinity removal LC column-Human 14(MARS)柱子，除高丰度蛋白，所述高丰度蛋白包括血清白蛋白、 免疫球蛋白G，抗胰蛋白酶，IgA，IgM，然后收集第一个峰，流出柱子后蛋白质进行3K分 子量截留超滤以去除洗脱液中的盐成分，再用丙酮在-20°沉淀过夜，蛋白质沉淀用溶解液再 悬浮；

(2)进行蛋白消化，再用iTRAQ试剂标记样本：首先取样品加入预冷的丙酮，于-20° 沉淀1小时，12000rpm离心15分钟，弃上清，用试剂盒中带的溶解液20μL和1％SDS 1μL 充分混悬溶解样品；加入还原试剂2μL，60°反应1小时；加入半胱氨酸封闭试剂1μL，室 温处理10分钟；再按照酶/蛋白质＝1/20的比例加入测序级修饰trypsin酶，37℃酶解过夜，使 蛋白质变性、烷基化、消化，再加入50μL异丙醇，混匀，分别加入各管样品中，室温反应 一小时，之后各加入三倍体积水，使标记试剂分解；

(3)上述标记好的混合样本用Sep-Pak Vac C18柱子脱盐处理，去除标记过程中的标记 试剂和相关的盐，以便于后续分析。先用100％乙腈冲洗柱子3次，再用0.1％TFA冲洗柱子 3次；再将400μL 0.1％TFA溶解样品，加载到柱子上，用0.1％TFA冲洗柱子3-5次；最后用 50％7腈0.1％TFA400μL洗脱下样品，并将样品冷冻干燥后进行后续分析；

(4)将冷冻干燥后的样品进行分离和检测，任选的，包括与所述的蛋白质标准品进行对 比分析的步骤。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的步骤(4)的分离和检测是通过二维液相色谱和 串联质谱进行，再将检测获得的图谱进行对比分析。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的对比分析通过Protein Pilot 4.2 beta软件进行。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的应用是非诊断和非治疗目的的。

本发明的试剂盒可以用于筛选肺结核中医证候特征性血清蛋白质，该血清蛋白质能反映 肺结核证候的特征，鉴定肺结核中医证候。

说明书附图

表1肺结核三证9种特征性血清蛋白质的Unused ProtScor、置信度等值(第1次重复)

表2肺结核三证9种特征性血清蛋白质的Unused ProtScor、置信度等值(第2次重复)

表3肺结核三证9种特征性血清蛋白质在肺结核证候间的比值(第1次重复)

表4肺结核三证9种特征性血清蛋白质在肺结核证候间的比值(第2次重复)

图1去高丰度蛋白紫外检测图谱

图2SAA1蛋白在健康人、肺结核三证患者中的变化图

图3IGHG3、IGHA1、IGHM、LAC2和IGLL5蛋白在健康人、肺结核三证患者中的变化图

图4HPT和HBA、HBD蛋白在健康人、肺结核三证患者中的变化图

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例，对本发明进行详细说明。

材料：安捷伦去高丰度蛋白的柱子；ITRAQ试剂盒购自Applied Biosystem公司；Sep-Pak Vac C18脱盐柱子购自waters公司；质谱仪器Triple Tof 5600 systems购自美国Applied Biosystem公司；Protein Pilot 4.2 beta软件购自美国ABI。

实施例1

肺结核中医证候分型，肺结核患者和健康对照者血清样本采集和临床检测：①根据中医 证候标准，分为肺阴虚、阴虚火旺、气阴两虚、阴阳两虚四证。将符合上述两种标准的患者 纳入实验，并排除肺外结核、糖尿病、结节病、变态反应性疾病和6个月内服用免疫抑制或 免疫调节剂病例。②收集证候组，包括肺阴虚、阴虚火旺、气阴两虚、阴阳两虚证共200例， 但是阴阳两虚证患者极少，不足以进行实验。收集健康对照组200例。所有参加者血样均为 晨起空腹抽取，采用一次性真空不抗凝采血管，采集外周血3.0mL，4小时内离心(3000 r/min，10min，4℃)，吸上清后分装成各50μL，保存于-80℃冰箱。

实施例2

去除高丰度蛋白，iTRAQ同位素标记血清蛋白质：将肺结核证候组患者(每种证候10 例)和健康对照者(10例)血清于-80℃中取出，待4℃自然溶解，将每组证候患者血清以 及健康对照者各取5μL混合，形成每管50μL的混合血清。使用Agilent multiple affinity removal LC column-Human 14(MARS)柱子，除去14种高丰度蛋白(血清白蛋白、免疫球蛋白G，抗 胰蛋白酶，IgA，IgM等)，在过柱子过程中进行紫外检测。初始体积为40μL混合血清进行 处理收集第一个峰，流出柱子后蛋白质进行3K分子量截留超滤(Millipore)以去除洗脱液中的 盐成分，再用丙酮在-20°沉淀过夜，蛋白质沉淀用溶解液再悬浮，最后用Bradford法测定 蛋白质浓度。

先进行蛋白消化，再用iTRAQ试剂标记样本。首先各组取100μg样品加入预冷的丙酮， 于-20°沉淀1小时，12000rpm离心15分钟，弃上清，用试剂盒中自带的溶解液20μL和1％ SDS 1μL充分混悬溶解样品；加入还原试剂2μL，60°反应1小时；加入半胱氨酸封闭试剂 (cystine blocking regent)1μL，室温处理10分钟；再按照酶/蛋白质＝1/20的比例加入测序级 修饰trypsin酶，37℃酶解过夜，使蛋白质变性、烷基化、消化。再往各组标记试剂 (113，118，119，121)中加入50μL异丙醇，混匀，分别加入各管样品中，室温反应一小时，之 后各加入三倍体积水，使标记试剂分解。其中113标记健康对照组，118标记肺结核肺阴虚 组，119标记肺结核阴虚火旺组，121标记肺结核气阴两虚组。合并各管标记好的样品，真空 冷冻干燥。

实施例3

标记蛋白质脱盐处理，2DLC-MS/MS分离、检测蛋白质：将上述标记好的混合样本用 Sep-Pak Vac C18柱子脱盐处理，去除标记过程中的标记试剂和相关buffer的盐，以便于后续 分析。先用100％乙腈冲洗柱子3次，再用0.1％TFA冲洗柱子3次；再将400μL 0.1％TFA溶 解样品，加载到柱子上，用0.1％TFA冲洗柱子3-5次；最后用50％乙腈0.1％TFA400μL洗 脱下样品，并将样品冷冻干燥后进行后续分析。

将脱盐后的混合iTRAQ标记样本进行第一维强阳离子柱(SCX)分离，先将样本加到流动 A相(25％乙腈，10mM KH2PO4，PH2.6)中，再加到柱子中，以0％-80％线性梯度的的B 相(10mM KH2PO4，350mM KCL，25％ACN，PH 2.6)，以200μL/min的流速洗脱60min； 用214nm/280nm波长的紫外检测，根据峰型和时间共收取10个梯度。再用20μL第二维反 相液相色谱A相(5％ACN，0.1％甲酸)溶解，进行第二维分析，第二维反相液相色谱用的 是ZORBAX 300SB-C18柱子，用5％-35％梯度的B相(95％ACN，0.1％甲酸)，用300μL/min 的流速洗脱分离90min。第二维反相液相色谱与质谱(Triple Tof 5600系统)直接相联用，用 400-1500m/z波长扫描范围进行MS分析，一个图谱选择20个最强的母离子进行串级扫描， 用100-2000m/z波长扫描范围进行进行MS/MS分析，获得差异蛋白质质谱检测图谱信息， 每个SCX片段都重复两次。

实施例4

Protein Pilot 4.2 beta软件鉴定、分析差异蛋白质：导出MS/MS波谱，并用Protein Pilot 4.2 beta软件分析，并检索SWISSPROT HUMAN数据库。软件会对每种蛋白质打两种分值： unused ProtScore和total ProtScore，在两次重复中unused ProtScore＞1.3并且有一个以上肽段 有95％置信度的蛋白进入下一轮数据分析。通过Protein Pilot 4.2beta软件获得蛋白质ID，并 根据同一种蛋白质在不同组别中的质谱峰面积获得蛋白质比值，并分析蛋白质生物学功能等 信息。第一次实验共检测出unused ProtScore＞1.3且一个以上肽段置信度为95％的蛋白质398 个，第二次重复检测出这种蛋白质384个。

实施例5

挑选肺结核证候特异性差异蛋白质：对比健康对照组、肺结核肺阴虚证组、阴虚火旺证 组、气阴两虚证组，之间进行蛋白质两两比值，找出肺结核证候组之间差异表达的蛋白质， 蛋白质比值＞1.25的表明其表达显著上调，蛋白质比值＜0.8的的表明其表达显著下调。其中 肺结核肺阴虚证组与健康对照组比较，共有116个差异表达蛋白质，64个表达上调，52个表 达下调；阴虚火旺证组与肺结核肺阴虚证组比较共有71个差异表达蛋白质，44个表达上调， 27个表达下调；气阴两虚证组与阴虚火旺证组比较共有65个差异表达蛋白质，21个表达上 调，44个表达下调。再从中挑选出肺结核三个证候均有差异，并且与肺结核病理发生密切相 关的蛋白质，共挑选出SAA1、IGHG3、IGHM、IGHA1、LAC2、IGLL5、HPT、HBA、HBD 等9个蛋白质。

去除高丰度蛋白及紫外检测鉴定，iTRAQ同位素标记血清蛋白质

将肺结核证候组患者(每种证候10例)和健康对照者(10例)血清于-80℃中取出，待 4℃自然溶解，每组各取5μL血清混合，形成每管50μL的混合血清。使用Agilent multiple affinity removal LC columm-Human 14(MARS)柱子，除去14种高丰度蛋白过程中进 行紫外检测，紫外检测结果如图1所示。用测序级修饰trypsin酶消化蛋白质后，再进行iTRAQ 试剂标记，其中113标记健康对照组，118标记肺结核肺阴虚组，119标记肺结核阴虚火旺组， 121标记肺结核气阴两虚组。

标记蛋白质脱盐处理，2DLC-MS/MS分离、检测蛋白质

用Sep-Pak Vac C18柱子脱盐，去除标记过程中的标记试剂和相关buffer的盐分。将脱 盐后的混合iTRAQ标记样本进行第一维强阳离子柱(SCX)分离，分离过程中用214nm/280nm 波长的紫外检测，根据峰型和时间共收取10个梯度。第二维反相液相色谱用ZORBAX 300SB-C18柱子分离，并直接与质谱(Triple Tof 5600系统)相联用，用400-1500m/z波长 扫描范围进行MS分析，一个图谱选择20个最强的母离子进行串级扫描，用100-2000m/z波 长扫描范围进行进行MS/MS分析，获得差异蛋白质质谱检测图谱信息，每个SCX片段都重 复两次。

Protein Pilot 4.2 beta软件鉴定、分析差异蛋白质

将MS/MS导出的波谱用Protein Pilot 4.2 beta软件分析，并检索SWISSPROT HUMAN数 据库。软件会对每种蛋白质打两种分值：unused ProtScore和total ProtScore，在两次重复中 unused ProtScore＞1.3并且有一个以上肽段有95％置信度的蛋白进入下一轮数据分析。第一次 实验共检测出unused ProtScore＞1.3且一个以上肽段置信度为95％的蛋白质398个，第二次 重复检测出这种蛋白质384个。并检索SWISSPROT HUMAN数据库后，获得蛋白质ID，蛋 白质生物学功能、蛋白质比值等信息。

表1.肺结核三证9种特征性血清蛋白质的Unused ProtScor、置信度等值(第1次重复)

表2.肺结核三证9种特征性血清蛋白质的Unused ProtScor、置信度等值(第2次重复)

表3.肺结核三证9种特征性血清蛋白质在肺结核证候间的比值(第1次重复)

表4.肺结核三证9种特征性血清蛋白质在肺结核证候间的比值(第2次重复)

挑选肺结核证候特异性差异蛋白质

对比健康对照组、肺结核肺阴虚证组、阴虚火旺证组、气阴两虚证组，进行蛋白质两两 比较，蛋白质比值＞1.25的表明其表达显著上调，蛋白质比值＜0.8的的表明其表达显著下调。 其中肺结核肺阴虚证组与健康对照组比较，共有116个差异表达蛋白质，64个表达上调，52 个表达下调；阴虚火旺证组与肺结核肺阴虚证组比较共有71个差异表达蛋白质，44个表达 上调，27个表达下调；气阴两虚证组与阴虚火旺证组比较共有65个差异表达蛋白质，21个 表达上调，44个表达下调。再从中挑选出肺结核三个证候均有差异，并且与肺结核病理发生 密切相关的蛋白质，共挑选出SAA1、IGHG3、IGHM、IGHA1、LAC2、IGLL5、HPT、HBA、 HBD等9个蛋白质，蛋白在健康对照者和肺结核三证患者中的变化如图2、3、4所示。

本发明采用筛选肺结核中医证候特征性血清蛋白质的方法，比较肺结核不同证候患者与 健康对照者之间差异表达的蛋白质，筛选肺结核中医证候的特征性血清蛋白质，具有较高的 特异性和准确性。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经 过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护 范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。