盐酸替罗非班异构体分离方法及D构型盐酸替罗非班定量方法

摘要

本发明提供一种盐酸替罗非班异构体的分离方法及D构型盐酸替罗非班的定量方法。本发明通过调整高效液相色谱条件，使得分离盐酸替罗非班异构体的灵敏度提高了3～10倍，分离度提高至2.0以上，从而显著提高了D构型盐酸替罗非班定量的准确性。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种异构体的分离方法及D构型异构体的定量方法，具体地本发明涉及一种 盐酸替罗非班异构体的分离方法及D构型盐酸替罗非班的定量方法。

背景技术：

替罗非班化学名为“N-(正丁基磺酰基)-O-[4-(4-哌啶基)丁基]-L-酪氨酸”。替罗非班具有 如下化学结构

替罗非班成盐后，尤其是替罗非班盐酸盐，已经广泛用于治疗不稳定型心绞痛或非Q波心肌 梗塞病人，预防心脏缺血事件，同时也适用于冠脉缺血综合征病人进行冠脉血管成形术或冠 脉内斑块切除术，以预防与经治冠脉突然闭塞有关的心脏缺血并发症。

从上述替罗非班的结构式可以看出，替罗非班具有一个手性碳原子，因此在合成过程中 势必会存在两种构型的替罗非班，即D构型和L构型。其中只有L构型的替罗非班才是治疗有 效成分，而D构型的替罗非班则必须作为杂质严格控制其含量。替罗非班和酸成盐过程不会 发生构型改变，因此检测D构型替罗非班的方法同样可以用来检测D构型替罗非班盐。临床上， 采用的是替罗非班盐酸盐，亦叫做盐酸替罗非班。在最初的国家标准中主药有效成分的异构 体并不作为杂质准确定量。随着技术的进步和药品标准的逐渐升级，要求对即便没有毒性的 异构体也要作为杂质严格准确定量。现有检测技术中，国家标准(标准号为：YBH05622009) 用于分离和定量D型替罗非班异构体，采用ULTRON ES-OVM型手性色谱柱；以甲酸铵缓冲 液(6g甲酸铵溶于1000ml水中，甲酸调节pH值为4.1)-甲醇(90∶10)为流动相；流速0.8ml/min； 检测波长为227nm。此检测方法存在以下不足：

1.色谱图中基线噪声较大，噪声值为0.3011，检出限浓度为1.5μg/ml(供试品溶液浓度的 0.5％)，已经达到了杂质限度规定的浓度，因此影响D型替罗非班异构体峰面积的准确积分， 从而使低于检出限的D-异构体不能被检出；表1列出了5个随机抽取的标准号为YBH05622009 中所述方法的检测噪声值以及检测限浓度。

表1对比方法YBH05622009的噪声值以及检测限浓度

检测限浓度＊：是指分析方法能够从背景信号中区分出药物时，所需样品中药物的最低浓度。它是一 种限度检验效能指标，既能反映方法与仪器的灵敏度和噪音的大小，也能表明样品经处理后空白值的高低， 可以考察方法是否具备灵敏的检测能力。本品采用信噪比法测定检测限，即把测出的已知低浓度的试样信 号与噪声信号进行比较，计算可检出的最低浓度或量。一般以信噪比为3∶1时相应的浓度或注入仪器的量确 定检测限浓度。

2.分离度小，此方法的分离度只有1.68，接近药典规定的1.5的最低限，因此不利于D型 替罗非班盐酸盐异构体的检出以及分离定量。按照标准号为YBH05622009的检测方法随机5 次的实验结果所得D构型和L构型之间的分离度分别为1.63、1.62、1.60、1.65、1.68。

注：分离度是用来评价待测组分与相邻共存物或难分离物之间的分离程度，是衡量色谱 系统效能的关键指标。(详细定义以及计算方法见附件：中国药典2010年版二部附录VD附录 29页)

3.L构型替罗非班峰形变形严重(参见附图2A和2B)，影响积分的准确性。

4.根据公知常识“仪器对微量杂质和常量主成分的积分精确度和准确度不同”【见国家 食品药品监督管理局药品审评中心在2012年7月25日发布的对化药共性问题解答-药学中， 问题八下：3、关于杂质分析的定量方式(4)——面积归一化法，见附件】是造成用面积归 一化法对微量杂质的定量产生更大误差的原因之一。又由于标准号为YBH05622009的检测方 法噪音大，噪音对D构型盐酸替罗非班积分的影响也必然大。再加上L构型盐酸替罗非班的峰 形变形严重。综合以上三个影响因素，并标准号为YBH05622009对D构型盐酸替罗非班采用 面积归一化法进行定量会产生更大的误差，即采用的计算方法对D构型盐酸替罗非班进行定量的结果误差更大。其中A_D表示供试品 溶液D构型替罗非班或盐酸替罗非班峰面积；A_总表示供试品溶液D构型与L构型峰面积的总 和。

总之，现有分离和定量D构型盐酸替罗非班的方法存在由于分离度差、噪音大等原因造 成的准确性差、误差大的缺点，亟需找到一种准确性好、误差小的分离和定量D构型盐酸替 罗非班的方法。

发明内容：

本发明的目的是克服分离和定量D构型盐酸替罗非班的方法存在的分离度差、噪音大等 原因造成的准确性差、误差大的缺点，提供一种准确性好、误差小的分离和定量D构型盐酸 替罗非班的方法。

本发明提供了一种盐酸替罗非班异构体的分离方法，其中，所述方法包括利用高效液相 色谱在如下条件下分离L构型盐酸替罗非班和D构型盐酸替罗非班的步骤：

所用色谱柱的固定相填料为卵粘蛋白手性色谱柱；

所述高效液相色谱的流动相包括由水相和有机相组成；水相为三氟醋酸水溶液，有机相 为甲醇或乙醇或异丙醇或乙腈或他们的任意比，

其中，以所述三氟醋酸水溶液为基准计算，所述三氟醋酸水溶液的浓度为0.08％～～0.2％， 并用三乙胺调节所述三氟醋酸水溶液的pH值为3.0～5.0，

所述水相和有机相的体积比在80∶20～99∶1之间；

检测流速为常用流速；

柱温不需要保温箱特殊调节；

检测波长为200～245nm。

本发明还提供了一种D构型盐酸替罗非班的定量方法，其特征在于，所述方法包括

(1)利用高效液相色谱在如下条件下检测供试品溶液中D构型盐酸替罗非班的步骤：

所用色谱柱的固定相填料为卵粘蛋白手性色谱柱；

所述高效液相色谱的流动相包括由水相和有机相组成：水相为三氟醋酸水溶液，有机相 为甲醇或乙醇或异丙醇或乙腈或他们的任意比，

其中，以所述三氟醋酸水溶液为基准计算，所述三氟醋酸水溶液的浓度为0.08％～0.2％， 并用三乙胺调节所述三氟醋酸水溶液的pH值为3.0～5.0，

所述水相和有机相的体积比在80∶20～99∶1之间；

检测流速为常用流速；

柱温不需要保温箱特殊调节；

检测波长为200～245nm。

(2)将步骤(1)得到的结果按照如下公式定量计算：

(即不加校正因子的主成分自身对照法)， 其中，A_D代表供试品溶液中D构型盐酸替罗非班的峰面积(本发明中所述A_D的含义均与其 相同)；A_对代表对照溶液中L构型盐酸替罗非班的峰面积(本发明中所述A_对的含义均与其 相同)；或者(即杂质对照品法)，其中， A_D纯代表D构型盐酸替罗非班纯品的峰面积(即本发明中所述A_D纯的含义均与其相同)；或 者(即面积归一化法)，其中，A_总代表供试品 溶液中D异构体与L异构体总和(本发明中所述A_总的含义均与其相同)。

与现有的分离和定量D构型盐酸替罗非班的方法相比，本发明的分离方法的优越性体现 在噪音降低了10倍，检测限浓度降低了3～10倍，即检测灵敏度提高了3～10倍，见下面的 表2数据和表1的对比结果。分离度至少提高到2.0以上。因此显著降低了标准号为 YBH05622009的方法中，噪音大和峰形变形严重这两个因素对D构型盐酸替罗非班进行定量 的影响。

目前由于D构型盐酸替罗非班纯品制备困难，市场上还没有此纯品出售。为了验证我们 所采用的定量计算方法“不加校正因子的主成分自身对照法”的准确性，另外我们采用高效 液相分离制备技术，分离消旋体盐酸替罗非班，制得疑似D构型盐酸替罗非班纯品100毫克， 并对疑似D构型盐酸替罗非班纯品分别进行了核磁共振图谱扫描分析、和质谱分析等结构确 证分析，并对其含量进行准确标定为99.8％。制备的目的在于验证的定量方法与的 准确性相当。因此在此不附对所取馏分进行结构确认(以确认其即为D构型盐酸替罗非班纯 品)的各项图谱。结构确证的各项结果证明疑似D构型盐酸替罗非班即为D构型盐酸替罗非 班纯品，纯度为99.8％。

将以上制得的D构型盐酸替罗非班纯品按照如下步骤配制成溶液：取D构型盐酸替罗非 班自制纯品，精密称定，加流动相溶解并稀释制成每1ml中约含1.25μg的溶液。按照与各实 施例相同的检测条件进行检测，所得D构型盐酸替罗非班纯品的峰面积记为A_D纯。将检测结 果按照如下公式计算D构型盐酸替罗非班的含量：

附图说明：

图1-1A为随机抽取的类似于实施例1或5供试品溶液的高效液相图谱；

图1-1B为随机抽取的类似于实施例1或5对照溶液的高效液相图谱；

图1-1C为随机抽取的类似于实施例1或5以及对照品溶液的高效液相图谱；

图1-2A为随机抽取的类似于优选实施例2、3、4供试品溶液的高效液相图谱；

图1-2B为随机抽取的类似于优选实施例2、3、4对照溶液的高效液相图谱；

图1-2C为随机抽取的类似于优选实施例2、3、4以及对照品溶液的高效液相图谱；

图2A为随机抽取的对比例供试品溶液的高效液相图谱；

图2B为随机抽取的对比例对照品溶液的高效液相图谱；

图3为与对照溶液浓度相同的D构型盐酸提罗非班纯品溶液采用本发明方法检测的高效 液相图谱。

具体实施方式：

本发明提供了一种盐酸替罗非班异构体的分离方法，其中，所述方法包括利用高效液相 色谱在如下条件下分离L构型盐酸替罗非班和D构型盐酸替罗非班的步骤：

所用色谱柱为固定相填料为卵粘蛋白手性色谱柱

所述高效液相色谱的流动相包括由水相和有机相组成：水相为三氟醋酸水溶液，有机相 为甲醇或乙醇或异丙醇或乙腈或他们的任意比，

其中，以所述三氟醋酸水溶液为基准计算，所述三氟醋酸水溶液的浓度为0.08％～0.2％， 并用三乙胺调节所述三氟醋酸水溶液的pH值为3.0～5.0，

所述水相和有机相的体积比在80∶20～99∶1之间；

检测流速为常用流速；

柱温不需要保温箱特殊调节；

检测波长为200～245nm。

优选所述水相三氟醋酸水溶液的浓度为0.1％-0.15％，所述三氟醋酸水溶液和有机相的体 积比在85∶15～90∶10之间。不管调动流动相中水相三氟醋酸水溶液的浓度还是调节水相和有 机相的比例都可以使分离度提高到2.0以上。例如最佳实施例3。另外，检测波长在227±5nm 使检测限浓度降低10倍，即灵敏度提高10倍，例如实施例2、3、4。

本发明还提供了一种D构型盐酸替罗非班的定量方法，其特征在于，所述方法包括

(1)利用高效液相色谱在如下条件下检测D构型盐酸替罗非班样品的步骤：

所用色谱柱的固定相填料为卵粘蛋白手性色谱柱；

所述高效液相色谱的流动相包括由水相和有机相组成：水相为三氟醋酸水溶液，有机相 为甲醇或乙醇或异丙醇或乙腈或他们的任意比，

其中，以所述三氟醋酸水溶液为基准计算，所述三氟醋酸水溶液的浓度为0.08％～0.2％， 并用三乙胺调节所述三氟醋酸水溶液的pH值为3.0～5.0，

所述水相和有机相的体积比在80∶20～99∶1之间；

检测流速为常用流速；

柱温不需要保温箱特殊调节；

检测波长为200～245nm。

(2)将步骤(1)得到的结果按照如下如下方法定量计算：

优选采用或者的方法进行定量计算。

除了步骤1带来的由于分离方法的改进，显著降低了标准号为YBH05622009的方法中， 由于检测方法的噪音和峰形变形严重这两个因素对D构型盐酸替罗非班进行定量的影响；步 骤2优选或者还克服了面积归一化法由于仪器对微量杂质和常量主成分的积分 精确度和准确度不同对定量带来更大误差的影响因素。

除非特殊说明，本发明中的供试品溶液、对照溶液和对照品溶液符合以下定义。

供试品溶液：取盐酸替罗非班适量，精密称定，加流动相溶解并稀释制成每1ml中约含 0.25mg的溶液即为供试品溶液。其目的是为了检测是否有D构型的杂质存在。

对照溶液：精密量取供试品溶液适量，加流动相稀释制成每1ml中约含1.25μg的溶液， 作为对照溶液。其目的是为了将供试品溶液稀释，使L构型的盐酸替罗非班的检测浓度在线 性范围内。

本发明对照品溶液：取盐酸替罗非班消旋体为对照品，精密称定，加流动相溶解并稀释 制成每1ml中约含2.5μg的溶液，作为对照品溶液。其目的在于用已知含有D构型和L构型 的消旋体作为对照，验证所采用的方法能将二者充分分离。

本发明的发明人具体作出了如下改进：

用固定相填充物为卵黏蛋白的手性色谱柱；高效液相色谱的流动相包括由水相和有机相 组成：水相为三氟醋酸水溶液，有机相为甲醇或乙醇或异丙醇或乙腈或他们的任意配比，其 中，以所述三氟醋酸水溶液为基准计算，所述三氟醋酸水溶液的浓度为0.08％～0.2％，并用三 乙胺调节所述三氟醋酸水溶液的pH值为3.0～5.0，所述水相和有机相的体积比在80∶20～99∶1 之间；检测流速为常用流速；柱温不需要保温箱特殊调节；检测波长为200～245nm。取对 照品溶液20μl注入液相色谱仪，出峰顺序为盐酸替罗非班D-异构体和L-异构体，二者的分 离度大于2.0(详见附件：中国药典2010年版二部附录VD附录29页、30页规定分离度应 该大于1.5)。取对照溶液20μl，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高 约为满量程的10％～20％；精密量取供试品溶液和对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪， 记录色谱图至主峰保留时间的1.5倍，供试品溶液的色谱图中如显D-异构体峰，量取其峰面 积，D-异构体峰面积不得大于对照溶液的主峰面积。其他常规项符合中国药典2010年版二部 中对高效液相色谱法(附录V D，附录29-31)测定的相关规定。

以上色谱条件能够保证噪音显著降低，表2是在以上色谱条件下随机抽取的5个检测结 果：

表2本发明色谱条件下的噪音值以及检测限度

对比表1和表2的检测结果，可见噪音值降低了3～10倍，检测限浓度降低了3～10倍 以上，也就是说灵敏度提高了3～10倍。另外随机抽取的五个样品的分离度均在2以上，最 佳分离条件的分离度达到5.5以上。

在保证D构型和L构型在充分分离、精确检测的基础上，将以上检测结果采用主成分自 身对照法进行定量计算，计算公式为：或者 或者优选采用或者

本发明实施例1：

用固定相为卵粘蛋白的手性色谱柱；以0.08％的三氟醋酸水溶液(以三乙胺调节pH值为 3.0)水相与甲醇的体积比为99∶1为流动相；流速为每分钟0.8ml；检测波长为230nm。

在此条件下检测供试品溶液、对照溶液以及对照品溶液所得到的检测图谱类似于图 1-1A、图1-1B和1-1C。将有机相换做乙醇、异丙醇、乙腈或它们之间任意组合后，只要其 他条件不变，所得检测结果与其类似。

本发明实施例2：

用固定相为卵粘蛋白的手性色谱柱；以0.10％的三氟醋酸水溶液(以三乙胺调节pH值为 3.5)与甲醇的体积比为85∶15为流动相；流速为每分钟0.8ml；检测波长为200nm。

在此条件下检测供试品溶液、对照溶液以及对照品溶液所得到的检测图谱类似于图 1-2A、图1-2B和1-2C。将有机相换做乙醇、异丙醇、乙腈或它们之间任意组合后，只要其 他条件不变，所得检测结果与其类似。

本发明实施例3：

用固定相为卵粘蛋白的手性色谱柱；以0.15％的三氟醋酸水溶液(以三乙胺调节pH值为 4.0)与甲醇的体积比为80∶20为流动相；流速为每分钟0.8ml；检测波长为227nm。

在此条件下检测供试品溶液、对照溶液以及对照品溶液所得到的检测图谱类似于图 1-2A、图1-2B和1-2C。将有机相换做乙醇、异丙醇、乙腈或它们之间任意组合后，只要其 他条件不变，所得检测结果与其类似。

本发明实施例4：

用固定相为卵粘蛋白的手性色谱柱；以0.2％的三氟醋酸水溶液(以三乙胺调节pH值为 4.5)与甲醇的体积比为96∶4为流动相；流速为每分钟0.8ml；检测波长为224nm。

在此条件下检测供试品溶液、对照溶液以及对照品溶液所得到的检测图谱类似于图 1-2A、图1-2B和1-2C。将有机相换做乙醇、异丙醇、乙腈或它们之间任意组合后，只要其 他条件不变，所得检测结果与其类似。

本发明实施例5：

用固定相为卵粘蛋白的手性色谱柱；以0.15％的三氟醋酸水溶液(以三乙胺调节pH值为 5.0)与甲醇的体积比为95∶5为流动相；流速为每分钟0.8ml；检测波长为245nm。

在此条件下检测供试品溶液、对照溶液以及对照品溶液所得到的检测图谱类似于图 1-1A、图1-1B和1-1C。将有机相换做乙醇、异丙醇、乙腈或它们之间任意组合后，只要其 他条件不变，所得检测结果与其类似。

以上各实施例检测结果均按照如下公式进行计算：或者或者

另外，利用本发明的实验条件检测D构型盐酸替罗非班纯品所得到的液相色谱图见图3。 随机抽取5次检测结果所得到的D构型盐酸替罗非班纯品的峰面积用浓度校正后与对照溶液 所得到的主成分L构型盐酸替罗非班的峰面积用浓度校正后相比较，其结果见表3。

表3相同浓度的对照品溶液和D构型纯品溶液在其他检测条件相同的情况下峰面积如下

注：因为峰面积与浓度成正比关系是公知常识，并且本发明中由于中，供试品溶液与对照溶液的浓度相同，所以没有对峰面积进行浓度校正。但是对比相同浓 度的L构型盐酸替罗非班与D构型盐酸替罗非班是否紫外吸收峰面积相同就需要进行浓度校正，因此设了 表中的对比对象。

由以上随机抽取的5个检测结果可以明显的看出，等量的A_对/C_对和A_D纯/C_D纯没有显著 性差异，即相同浓度的L构型盐酸替罗非班与D构型盐酸替罗非班峰面积相同。2005年3 月版的《化学药物杂质研究的技术指导原则》第六页中，“(三)有机杂质的定量方法，第二 段第三行”明确指出杂质对照品法定量相关杂质比较准确。还是本指导原则的第七页中，第 二段第一行“已知杂质对主成分的相对响应因子在0.9-1.1范围内时，可以用主成分的自身对 照法计算含量”。表3的结果A_对/C_对和A_D纯/C_D纯没有显著性差异，即证明了我们所采用的主 成分自身对照法的相对响应因子为1。因此在保证D构型和L构型充分分离的前提下，采用 进行计算与采用一样定量精准。

对比例

采用ULTRON ES-OVM型手性色谱柱；以甲酸铵缓冲液(6g甲酸铵溶于1000ml水中， 甲酸调节pH值为4.1)-甲醇(90∶10)为流动相；流速0.8ml/min；检测波长为227nm。

在此条件下检测供试品溶液、对照溶液以及对照品溶液所得到的检测图谱类似于图2A 和图2B。

对比例检测结果按照如下公式计算：

首先比较供试品溶液的图1-1A、图1-2A和图2A。从图2A明显的看出基线成较大的锯 齿状，即噪音较大。再看图2A的峰形拖尾处小峰无法说清是因为浓度大的严重拖尾变形还 是另有其他成分干扰。而图1-1A、图1-2A基线平滑，由于杂质与主成分之间的浓度相差100 倍，为检出杂质不得不将供试品溶液配置成现在的浓度，导致主成分峰稍有拖尾。具体对比 例的噪声值和本发明的噪声值见表1和表2，他们相差3～10倍。

再比较图图1-1C、图1-2C与图2B。图2B不光基线呈锯齿状不够平滑，而且出峰时间 间隔为5.708-4.353＝1.355分钟。而图1-1C、图1-2C的出峰时间间隔为7.130-4.285＝2.845 分钟和8.780-4.994＝3.786分钟，而且基线平滑无干扰。具体计算得到的分离度分别见表2。

从以上对比结果可以看出，对比例中L构型的盐酸替罗非班峰型变形严重，噪音较大， 因此峰面积积分误差较大，从而导致A_总误差较大，最终导致按照公式计算的单个杂质定量不准确。

综上所述，本发明检测条件“用固定相填料为卵粘蛋白的手性色谱柱；高效液相色谱的 流动相包括由水相和有机相组成：水相为三氟醋酸水溶液，有机相为甲醇或乙醇或异丙醇或 乙腈或他们的任意比，其中，以所述三氟醋酸水溶液为基准计算，所述三氟醋酸水溶液的浓 度为0.08％～0.2％，并用三乙胺调节所述三氟醋酸水溶液的pH值为3.0～5.0，所述水相和有 机相的体积比在80∶20～99∶1之间；检测流速为常用流速；柱温不需要保温箱特殊调节；检 测波长为200～245nm。”使灵敏度提高了3～10倍，分离度提高至2.0以上。无论采用哪种 定量方法计算都会显著提高检测和定量结果。