一种用于检测甲状腺结节良恶性相关基因变异的引物、试剂盒及检测方法

摘要

本发明公开一种用于检测甲状腺结节良恶性相关基因变异的引物、试剂盒及检测方法。本发明可以同时检测6个基因的15个位点的变异以及3个融合基因变异，其中包括BRAF基因、KRAS基因、HRAS基因、NRAS基因、TERT基因、EIF1AX基因和RET/PTC1融合、RET/PTC3融合、PAX8/PPARγ融合。这些基因的热点突变和融合变异，都与甲状腺结节的良恶性密切相关。因此使用本发明对患者的样本进行检测，可以协助医生对细胞学无法明确诊断的甲状腺结节进行良恶性鉴别，提高甲状腺结节良恶性鉴别的准确性，减少甲状腺结节患者的过度医疗，为国家节约医疗资源，无疑具有非常重大的现实意义和巨大的经济效益。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种用于检测甲状腺结节良恶性相关基因变异的引物、试剂盒及检测方法。

背景技术

甲状腺结节是人群中普遍存在的一种甲状腺疾病，是甲状腺细胞在局部异常生长所引发的病变。大多数情况下，甲状腺结节是良性的，可以采取保守治疗的方式，但也有5％-10％的甲状腺结节是恶性的，需要早期手术治疗，才能获得良好的预后效果。

目前，B超是检查甲状腺结节的首选手段，可以根据甲状腺结节的影像学特点初步判断结节的性质，使得甲状腺结节的检出率可以达到76％，在这些被检出的甲状腺结节中，结节性甲状腺肿和甲状腺腺瘤等良性结节的比例约为85％-95％，仅有5％-15％的结节为恶性结节，即甲状腺癌，不应当也不可能对每一个甲状腺结节的患者都进行手术治疗。因此，为了进一步提高甲状腺癌的检出率，通过细针穿刺(FNA)的方法获取甲状腺细胞，进行细胞学检查是当今评估甲状腺结节是否为恶性肿瘤的金标准，然而即便如此，仍然有20％-30％的甲状腺结节无法通过这种方式获得明确诊断。

随着分子生物学技术的进展，分子诊断在甲状腺结节良恶性的鉴别诊断中，逐渐受到人们的关注。美国国立综合癌症网络(NCCN)2019年版的临床实践指南中明确指出：(1)对细针穿刺(FNA)无法确定的疑似滤泡型及Hurthle细胞癌(诊断依据为血管或包膜的浸润)，分子检测有助于判定其良恶性；(2)细胞学无法明确诊断的结节,利用分子诊断的技术，检测BRAF、RAS、RET/PTC、PAX8/PPARγ等癌基因的变异对辅助诊断甲状腺癌具有重要作用。

因此，我们发明了一种用于检测甲状腺结节良恶性相关基因变异的引物、试剂盒及检测方法，通过对一组甲状腺结节良恶性相关的基因变异进行检测，其检测结果可以用来协助医生对细胞学无法明确诊断的甲状腺结节进行良恶性鉴别，可以提高甲状腺结节良恶性鉴别的准确性，减少甲状腺结节患者的过度医疗，从而为国家节约医疗资源，为患者减少不必要的治疗所产生的各种后遗症，无疑具有非常重大的现实意义和巨大的经济效益。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种准确度高、灵敏度佳、特异性好的用于检测甲状腺结节良恶性相关基因变异的引物、试剂盒及检测方法，为鉴别甲状腺结节的良恶性提供良好的辅助作用。

进一步的，一种用于检测甲状腺结节良恶性相关基因变异的引物，包括如下扩增引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的BRAF基因的扩增引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的KRAS基因的扩增引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示的HRAS基因的扩增引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ IDNO.14所示的NRAS基因的扩增引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示的TERT基因的扩增引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQID NO.20所示的EIF1AX基因的扩增引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示的RET/PTC1融合基因的扩增引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示的RET/PTC3融合基因的扩增引物对，核苷酸如SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29所示的PAX8/PPARγ融合基因的扩增引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31所示的通用测序引物对，可用于特异性地检测样本中的BRAF基因、HRAS基因、KRAS基因、NRAS基因、TERT基因、EIF1AX基因这6个基因上15个突变位点的变异及RET/PTC1融合、RET/PTC3融合、PAX8/PPARγ融合这3个融合变异。

所述15个突变位点分别如表1所示：

表1基因名称和突变位点表

所述3个融合基因分别如表2所示：

表2融合基因名称和融合位置表

进一步的，一种用于检测甲状腺结节良恶性相关基因变异的试剂盒，包括上述所有用于检测甲状腺结节良恶性相关基因变异的引物。

进一步的，一种用于检测甲状腺结节良恶性相关基因变异的试剂盒，包括逆转录反应液、PCR反应液、阳性DNA质控品、阳性RNA融合质控品、阴性RNA融合质控品、无核酸酶水。

进一步的，一种用于检测甲状腺结节良恶性相关基因变异的试剂盒，所述逆转录缓冲液体系包括：RNA逆转录酶、5×缓冲液、DTT、dNTPs、RNA酶抑制剂。

所述PCR反应液含有高保真DNA聚合酶、KCl、MgCl2、Tris-HCl、dNTPs。

所述阳性DNA质控品为正常人基因组DNA。

所述阳性RNA融合质控品为RET/PTC1融合RNA。

所述阴性RNA融合质控品为人非融合RNA。

优选的，所述试剂盒的存储温度为-20℃。

进一步的，一种用于检测甲状腺结节良恶性相关基因变异的检测方法，包括如下步骤：

(1)从待测样本中提取DNA，对提取的DNA进行浓度和纯度检测；

(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，用SEQ ID NO.1～20所示的核苷酸序列为引物，进行第一轮PCR扩增，纯化扩增产物；

(3)以步骤(2)所述扩增产物为模板，用SEQ ID NO.30～31所示的核苷酸序列为引物，进行第二轮PCR扩增，纯化扩增产物，得到DNA测序文库；

(4)从待测样本中提取纯化RNA，对提取的RNA进行浓度和纯度检测；

(5)以步骤(4)提取的RNA为模板，通过逆转录生成相应的cDNA，纯化cDNA；

(6)以步骤(5)所述cDNA为模板，用SEQ ID NO.21～29所示的核苷酸序列为引物，进行第一轮PCR扩增，纯化扩增产物；

(7)以步骤(6)所述扩增产物为模板，用SEQ ID NO.：30～31所示的核苷酸序列为引物，进行第二轮PCR扩增，纯化扩增产物，得到RNA测序文库；

(8)对步骤(3)和步骤(7)所述测序文库进行质检，然后用二代测序仪进行测序；

(9)对测序结果用生物信息软件进行分析和注释。

优选的，

所述核苷酸序列SEQ ID NO.1～20所示的DNA特异性引物混合池浓度为10μM。

所述核苷酸序列SEQ ID NO.21～29所示的RNA特异性引物混合池浓度为10μM。

所述核苷酸序列SEQ ID NO.30～31所示的通用引物混合池浓度为10μM。

所述PCR扩增产物纯化使用的磁珠为Beckman Agencourt AMPure XP磁珠。

本发明具有以下有益效果：

(1)本发明可以同时检测BRAF基因、KRAS基因、HRAS基因、NRAS基因、TERT基因及EIF1AX基因共6个基因上的15个突变位点和RET/PTC1、RET/PTC3、PAX8/PPARγ3个融合基因，这些基因突变及融合变异都与甲状腺的良恶性有关，因此其检测结果可以用来协助医生对细胞学无法明确诊断的甲状腺结节进行良恶性鉴别，可以提高甲状腺结节良恶性鉴别的准确性。

(2)本发明基于高通量测序技术，其引物组合、试剂盒及检测方法具有检测灵敏度高、特异性好、重复性好的特点。

附图说明

图1为本试剂盒文库构建的原理图。

图2为本试剂盒的检测流程图。

图3为使用本试剂盒构建的DNA文库片段分布图。

图4为使用本试剂盒构建的cDNA文库片段分布图。

图5为10个不同的临床样本构建文库的测序深度图。

图6为同一实验人员对同一临床样本构建5次文库的测序深度。

图7为不同实验人员对同一临床样本构建5次文库的测序深度。

具体实施方式

为了更加透彻和全面地理解本发明所公开的内容，下面将参照附图对本发明进行详细的描述，但是本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例，通常属于本发明的技术领域的普通技术人员都能够理解这些描述，并可能在不脱离本发明方法的前提下，做出若干非意想不到的改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

实施例1一种用于检测甲状腺结节良恶性相关基因变异的引物。

本实施例涉及的甲状腺结节良恶性相关基因及位点选自COSMIC(Catalogue ofSomatic Mutations in Cancer)数据库，依据相关基因序列进行突变热点引物设计，设计范围包含了甲状腺结节良恶性相关基因中的突变热点。

如表3所示，本实施例中对甲状腺结节良恶性相关基因的热点突变共设计了16对特异性引物，每对特异性引物扩增目标区域大小为180-200bp,扩增产物大小为220-280bp，具有覆盖范围广、检测位点多、GC含量均衡、产物结构稳定、二聚体结构少等优点。具体的，

表3引物序列表

其中，i5和i7分别为6个碱基序列，index编号不同，这6个碱基序列也不同，用于区分不同样品。

在本实施例中，每个扩增引物对的5’端分别连接有长度为13bp的与通用引物完全互补的序列片段。通用引物对的两条引物的序列如SEQ ID NO.30和SEQ ID NO.31所示。

本实施例的特异性引物在多重PCR扩增时表现出很好的特异性、稳定性及均一性，在确保PCR扩增特异性的同时能保证其扩增效率。

实施例2一种用于检测甲状腺结节良恶性相关基因变异的试剂盒。

本实施例中所述用于检测甲状腺结节良恶性相关基因变异的试剂盒，主要包括：

(1)PCR特异性引物：用于扩增待测样本目标基因上的多个目标区域，扩增范围至少覆盖目标基因的热点突变区域，序列如表3中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.29所示。优选的，多重扩增引物对混合在一起构成引物池；

(2)通用引物：用于在文库构建过程中，对特异引物扩增目标区域的扩增产物进行再次扩增，对不同待测样本的测序文库进行标记，进而区分不同的样品，序列如表3中SEQID NO.30和SEQ ID NO.31所示；

(3)逆转录缓冲液：包括RNA逆转录酶、5×缓冲液、DTT、dNTPs、RNA酶抑制剂；

(4)PCR反应液：包括高保真DNA聚合酶、KCl、MgCl2、Tris-HCl、dNTPs；

(5)阳性DNA质控品：正常人基因组DNA；

(6)阳性RNA融合质控品：人RET/PTC1融合RNA；

(7)阴性RNA融合质控品：人非融合RNA。

优选的，所述试剂盒的存储温度为-20℃。

实施例3一种用于检测甲状腺结节良恶性相关基因变异的检测方法。

本实施例的检测方法包括以下步骤：

(1)样本DNA和RNA提取：参照试剂盒说明书，使用AllPrep DNA/RNA Mini Kit试剂盒分别提取DNA和RNA，使用NanoDrop进行浓度及纯度的测定，根据测定的核酸样本浓度结果，使用无核酸酶水将核酸样本稀释至10-50ng/μL作为扩增建库的核酸起始浓度。

(2)DNA文库构建：

(2a)DNA靶区域扩增：

按照下列反应体系和扩增条件进行第一轮PCR扩增：

DNA多重PCR扩增程序设置：

(2b)第一轮PCR产物纯化：

参照试剂盒说明书，使用AMPure XP Beads纯化试剂盒对第一轮PCR产物进行纯化：

1)将以上25μL PCR扩增产物涡旋混匀并离心，将上清转移至一个新的1.5mL离心管中，然后加入17.5μL AMPure XP Beads，用移液器吹打混匀，室温静置5分钟；

2)将上述装有上清的1.5ml离心管放置于磁力架上，静置5分钟，待溶液澄清后，小心吸取上清转移至另一个新的1.5mL离心管中，加入15μL AMPure XP Beads，用移液器吹打混匀，室温静置5分钟；

3)将上述离心管放置于磁力架上，静置5分钟，待溶液澄清后，小心吸去上清，含有磁珠的离心管仍留在磁力架上；

4)在上述离心管中加入200μL 80％的乙醇，静置30秒，用移液器小心吸去上清；

5)重复上述步骤一次；

6)室温静置10分钟，待乙醇完全挥发；

7)向离心管中加入12μL无核酸酶水，移液器吹打混匀，充分悬浮磁珠，室温静置5分钟；

8)将上述离心管放置到磁力架上，静置5分钟，待溶液澄清后，小心吸取10μL上清到新的0.2mL PCR管中，进行第二轮PCR扩增。

(2c)DNA第二轮PCR扩增：

按照下列反应体系和扩增条件进行第二轮PCR扩增：

不同的样本文库需使用不同的index编号引物。

DNA多重PCR扩增程序设置：

(2d)DNA第二轮PCR产物回收

参照试剂盒说明书，使用AMPure XP Breads纯化试剂盒对第二轮PCR产物进行纯化：

1)将以上50μL PCR扩增产物涡旋混匀并离心，将上清转移至一个新的1.5mL离心管中，然后加入27.5μL AMPure XP Beads，使用移液器吹打混匀，室温静置5分钟；

2)将上述装有上清的1.5ml离心管放置于磁力架上，静置5分钟，待溶液澄清后，小心吸取上清转移至一个新的1.5mL离心管中，加入15μL AMPure XP Beads，用移液器吹打混匀，室温静置5分钟；

3)将上述离心管放置于磁力架上，静置5分钟，待溶液澄清后，小心吸去上清，含有磁珠的离心管仍留在磁力架上；

4)在上述离心管中加入200μL 80％的乙醇，静置30秒，用移液器小心吸去上清；

5)重复上述步骤一次；

6)室温静置10分钟，待乙醇完全挥发；

7)向离心管中加入22μL无核酸酶水，移液器吹打混匀，充分悬浮磁珠，室温静置5分钟；

8)将上述离心管放置到磁力架上，静置5分钟，待溶液澄清后，小心吸取20μL上清到新的1.5mL离心管中，该纯化产物即为构建好的文库，质检通过后上机测序。

(3)cDNA文库构建：

(3a)逆转录制备cDNA：

按照下面反应体系和扩增条件进行RNA逆转录：

扩增程序设置：

将获得的cDNA作为扩增反应模板备用。

(3b)cDNA靶区域扩增：

按照下列反应体系和扩增条件进行PCR扩增：

多重PCR扩增程序设置：

(3c)cDNA第一轮PCR产物纯化：

参照试剂盒说明书，使用AMPure XP Beads纯化试剂盒对cDNA第一轮PCR扩增产物进行纯化：

1)将以上25μL PCR扩增产物涡旋混匀并离心，将上清转移至一个新的1.5mL离心管中，然后加入25μL AMPure XP Beads，用移液器吹打混匀，室温静置5分钟；

2)将上述装有上清的1.5ml离心管放置于磁力架上，静置5分钟，待溶液澄清后，小心吸去上清，含有磁珠的离心管仍仍留在磁力架上；

3)在上述离心管中加入200μL 80％的乙醇，静置30秒，用移液器小心吸去上清；

4)重复上述步骤一次；

5)室温静置10分钟，待乙醇完全挥发；

6)向离心管中加入12μL无核酸酶水，移液器吹打混匀，充分悬浮磁珠，室温静置5分钟；

7)将上述离心管放置到磁力架上，静置5分钟，待溶液澄清后，小心吸取10μL上清到新的0.2mL PCR管中，进行第二轮PCR扩增。

(3d)cDNA第二轮PCR扩增：

按照下列反应体系和扩增条件进行第二轮PCR扩增：

不同的样本文库需使用不同的index编号引物。

DNA多重PCR扩增程序设置：

(3e)cDNA第二轮PCR产物回收

参照试剂盒说明书，使用AMPure XP Breads纯化试剂盒对第二轮PCR产物进行纯化：

1)将以上50μL扩增产物涡旋混匀离心，将上清转移至一个新的1.5mL离心管中，然后加入40μL AMPure XP Beads，使用移液器吹打混匀，室温静置5分钟；

2)将上述装有上清的1.5ml离心管放置于磁力架上，静置5分钟，待溶液澄清后，小心吸去上清，含有磁珠的离心管仍留在磁力架上；

3)在上述离心管中加入200μL 80％的乙醇，静置30秒，用移液器小心吸去上清；

4)重复上述步骤一次；

5)室温静置10分钟，使乙醇完全挥发；

6)向离心管中加入22μL无核酸酶水，移液器吹打混匀，充分悬浮磁珠，室温静置5分钟；

7)将上述离心管放置到磁力架上，静置5分钟，待溶液澄清后，小心吸取20μL上清到新的1.5mL离心管中，该纯化产物即为构建好的文库，质检通过后上机测序。

(4)上机测序：将构建好的文库，准确定量并稀释到合适浓度，参照Illumina公司的官方操作说明书进行上机测序。

(5)生信分析：对测序结果利用生物信息软件进行分析和注释。

实施例4一种用于检测甲状腺结节良恶性相关基因变异试剂盒的测序深度性能验证。

利用本发明所述的试剂盒，对上海复旦大学附属肿瘤医院头颈外科提供的10例甲状腺癌样本进行检测，检测方法按照实施例3的步骤进行。10例样本检测的结果表明，对于不同样本，本发明所述试剂盒检测深度均表现良好，例如BRAF基因T1799A位点，在10例样本中的检测深度分别为：9834.93、5915.42、4201.23、3713.57、6742.76、11361.92、5752.67、27824.62、8728.12、33962.28(图5)，最低测序深度3713.57，最高测序深度33962.28，均达到试剂盒设定的最低测序深大于1000的性能指标，确保了测序结果的准确性。

实施例5一种用于检测甲状腺结节良恶性相关基因变异试剂盒的重复性实验。

利用本发明所述的试剂盒，对上海复旦大学附属肿瘤医院头颈外科提供的同1例甲状腺癌样本，由实验室同一技术人员分别进行5次检测，检测方法按照实施例3的步骤进行，5次检测中，以BRAF基因T1799A位点的测序深度为例，其测序深度分别为37824.62、35531.44、39144.74、38655.30、34960.28(图6)，BRAF基因T1799A位点突变可以被稳定的检出，检出的突变频率分别为40.09％、40.2％、39.9％、39.2％、40.3％，其他位点的检测情况类似。因此表明，对于同一样本，本发明所述试剂盒具有良好的检测重复性。

实施例6一种用于检测甲状腺结节良恶性相关基因变异试剂盒的重现性实验。

利用本发明所述的试剂盒，对上海复旦大学附属肿瘤医院头颈外科提供的同1例甲状腺癌样本，由实验室5位不同实验人员，分别按照实施例3的步骤进行检测，以BRAF基因T1799A位点的检测结果为例，该位点的测序深度分别为41420.42、23812.79、47981.92、47522.67、36519.78(图7)，BRAF基因T1799A位点突变可以被稳定地检出，检出的突变频率分别为27.11％、26.65％、27.34％、26.92％、26.25％。结果表明，其他位点的检测情况类似。因此表明，对于同一样本，不同实验操作人员使用本发明所述试剂盒检测结果均表现良好。本发明所述试剂盒具有良好的检测重现性。

实施例7通过50例临床样品的回顾性实验检验本发明试剂盒的性能。

利用本发明所述的试剂盒，对上海复旦大学附属肿瘤医院头颈外科提供的50例患者的甲状腺样本进行检测，检测方法按照实施例3的步骤进行。

具体的，对上述50例样本进行DNA和RNA的抽提纯化，文库构建，使用Illumina公司的NovaSeq高通量测序平台对样本文库进行测序，测序读长为PE150，测序结果要求平均测序深度大于1000，且达到95％，对不合格样本进行重新测序。

对测序结果进行分析，判断每个患者甲状腺结节的良恶性，并将判断结果与患者的病理检测结果进行比对，比较结果之间的差异。具体如表4所示：

表4患者样本试剂盒检测结果与患者临床病理结果对照表

针对这50例临床甲状腺结节的患者，将依据本发明试剂盒检测的结果和临床实际的病理检测结果相对比，应用统计学方法计算得出：本发明试剂盒的敏感度达到了81.8％，特异性达到了92.9％，阳性预测值达到了90％，阴性预测值达到了86.7％，准确性达到了88％，因此能够成为临床医生鉴别甲状腺结节良恶性的一个非常重要的参考依据。

最后说明的是，以上所例举的实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明的技术方案的限制。本领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，可以对本发明的形式、内容和细节做出非意想不到的改变，而这些改变并没有偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海润安医学科技有限公司

<120> 一种用于检测甲状腺结节良恶性相关基因变异的引物、试剂盒及检测方法

<160> 31

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gctcttccga tcttctcagg gccaaaaatt taatcagtg 39

<210> 2

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gctcttccga tctggaaaat gagatctact gttttccttt acttac 46

<210> 3

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gctcttccga tcttcaaaga atggtcctgc accagt 36

<210> 4

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gctcttccga tctgatagtg tattaacctt atgtgtgaca tgttct 46

<210> 5

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gctcttccga tcttccttaa tgtcagctta ttatattcaa tttaaac 47

<210> 6

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gctcttccga tctgcactgt aataatccag actgtgtttc tc 42

<210> 7

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gctcttccga tctgcagcag ctgctggcac c 31

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gctcttccga tctcctgggg ctgggcctg 29

<210> 9

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gctcttccga tctgacgcag ccggcctgg 29

<210> 10

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gctcttccga tctggtccct gagccctgtc ctc 33

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gctcttccga tctccgacaa gtgagagaca ggatcag 37

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gctcttccga tctgctcgcc aattaaccct gattac 36

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gctcttccga tctatccttt cagagaaaat aatgctccta g 41

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gctcttccga tcttccctcc ctgccccctt ac 32

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gctcttccga tctcagggag cgcacggctc 30

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gctcttccga tctactgggg acccgggcac 30

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<212> DNA

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gctcttccga tcttctccat ggataataac aaaaattgga 40

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gctcttccga tctgagtaaa ttacagtgct gacttatgag tatttc 46

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gctcttccga tctaagaaag gatgttattt taaaaagcgt aa 42

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gctcttccga tctcatactg ttttacagat aattaatgtc atttacc 47

<210> 21

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gctcttccga tctgcattgt catctcgccg ttcc 34

<210> 22

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gctcttccga tctctgctct gcctttcaga tggaag 36

<210> 23

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gctcttccga tctaagtcag catccggtat tgtagctg 38

<210> 24

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gctcttccga tctgtgtacc ctgctctgcc tttcag 36

<210> 25

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gctcttccga tctcatgcct gcgatggcag ag 32

<210> 26

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gctcttccga tctgtaggtc tggtgagtcg agaggttg 38

<210> 27

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ctcttccgat ctaaggcgga gctagataaa gaggaag 37

<210> 28

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

gctcttccga tctcgaggtg gtgctggctg aag 33

<210> 29

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

gctcttccga tcttggatct gttcttgtga atggaatg 38

<210> 30

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca cactctttcc ctacacgacg ctcttccgat 60

ct 62

<210> 31

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

caagcagaag acggcatacg agatgtgact ggagttcaga cgtgtgctct tccgatct 58