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法律状态
2020-02-18
授权
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2019-04-23
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N15/113 申请日:20181219
实质审查的生效
2019-03-29
公开
公开
技术领域
本发明涉及一种适用于滋养细胞肿瘤患者血浆外泌体miRNA实时荧光定量PCR研究的内参。
背景技术
妊娠滋养细胞肿瘤(Gestational Trophoblastic Neoplasia,GTN)是一组来源于胎盘滋养细胞的恶性肿瘤。GTN进展极快，具有较强的亲血管性生物学特征，很早即可通过血液转移，对化疗极为敏感，是实体瘤中对化疗最敏感者，其治愈率已达80％～90％，但仍有约10％－20％患者因发生耐药而达不到治愈目的。目前GTN的临床治疗多以FIGO2000妊娠滋养细胞肿瘤分期与预后评分系统为指导，但对于GTN化疗效果的评估，特别是化疗耐药性的预测仍难以令人满意。随着分子医学的发展，寻找GTN早期诊断及耐药性预测的分子标志物，以便对GTN患者进行分层、针对性治疗，从而提高其治愈率，已成为GTN研究的关注点。
外泌体(Exosome)是由细胞主动分泌的一种大小约为40～100nm、具有脂质双分子层膜结构的小囊泡。Exosome几乎在所有类型的体液中均可有效检测，外周血中同样存在Exosome，且肿瘤细胞在其发生发展的过程中会不断释放肿瘤特异性外泌体至胞外,并通过其携带肿瘤源性DNA、RNA及蛋白质等物质参与体内活动。2007年Valadi等第一次在外泌体中提取到miRNA。外泌体miRNA由于受到膜结构的保护，可免于RNA酶的降解，因而能够在体液循环和微环境中检测到，而其具有的肿瘤来源特异性的特点使其有望成为一种早期诊断与病情及疗效监控的方法。随着提取和分析方法的不断进步，目前已有众多报道将外泌体miRNA应用于临床诊治，以实现个体化的精准医疗。
因此，在血浆外泌体内筛选出一个或多个与GTN初始化疗耐药相关miRNA也是一个令人期待的研究课题。但外周血外泌体miRNA目前尚无统一认可的内参miRNA。任何一种内参基因的所谓恒定表达都只是在一定类型的细胞或实验因素作用下有范围的恒定，在其他类型的细胞中或实验因素作用下则是变化的，盲目地使用内参基因，一方面可能使基因表达的微小差异难以发现，另一方面可能致错误甚至相反的结论，因此所研究组织的不同其选择的内参往往也不同。目前文献中用来实时荧光定量PCR外泌体miRNA的内参的分子主要有miR-16-5p、miR-21、U6等。
发明内容
本发明的目的在于提出了一种适用于妊娠滋养细胞肿瘤患者血浆外泌体miRNA实时荧光定量PCR研究的新内参分子，可避免不同血浆标本外泌体miRNA的质量、产量以及逆转录效率上可能存在的差别，更好的对实时荧光定量PCR检测的数据进行校正和标准化，提高研究的准确性和可靠性。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案是：一种适用于妊娠滋养细胞肿瘤患者血浆外泌体miRNA的PCR内参，所述内参为has-miR-129-5p，序列是SEQ ID NO.1所示的CUUUUUGCGGUCUGGGCUUGC。
进一步的，所述内参的正向引物的序列SEQ ID NO.1所示的CTTTTTGCGGTCTGGGCTT。
本发明的有益效果在于：
本发明提出了一种适用于妊娠滋养细胞肿瘤病人血浆外泌体miRNA的实时荧光定量PCR研究的新内参分子，可以更好的对实时荧光定量PCR检测的数据进行校正和标准化，提高研究的准确性及可靠性。
附图说明
图1本发明中，利用试剂盒提取的患者血浆中外泌体的电镜下形态。
图2本发明中，利用试剂盒提取的患者血浆中外泌体的分子标记物的鉴定图。
图3滋养细胞肿瘤患者血浆中外泌体内差异miRNA的表达谱图。
图4滋养细胞肿瘤患者血浆中外泌体内miRNA质检图。
图5 miRNA RT-PCR产物琼脂糖电泳结果图。
图6 miRNA RT-PCR产物TA克隆测序结果图。
图7外泌体内miRNA real-time PCR引物扩增标准曲线(a)和溶解曲线图(b)。
图8各候选内参分子滋养细胞肿瘤患者血浆中外泌体内的表达差异数据图。
图9(a)和(b)候选内参基因进行geNorm分析结果图。
具体实施方式：
下面结合附图对本发明进行进一步的解释和说明：
本发明共选用滋养细胞肿瘤患者标本65例。抽取病人血浆5ml置于ETDA管内，血浆的分离在采血后2h内完成，4000g 10min 4℃离心，取上层血浆分装至1.5mlEP管内，-80℃保存，直至使用，避免反复冻融。
随机选取妊娠滋养细胞肿瘤患者血浆20例(包括MTX敏感病人10例及耐药10例)。去除血浆内纤维蛋白原后，利用Exoquick(SBI)试剂盒提取血浆中外泌体，利用MiRNeasymicro Kit(QIAGEN)提取外泌体miRNA，并用Qubit microRNA试剂盒及Aligent Small RNAkit试剂盒对外泌体miRNA进行定量及质检鉴定。建立小RNA文库后，进行二代测序以及数据分析。对测序结果按照以下原则选择候选内参分子：(1)在妊娠滋养细胞肿瘤患者血浆外泌体中均高表达的miRNA；(2)按照变异系数CV进行统计分析，选择在妊娠滋养细胞肿瘤MTX敏感及耐药患者血浆外泌体中表达无明显差异的miRNA；(3)在每个miRNA家族中选一最具有代表性的miRNA。目前荧光定量PCR外周血外泌体内miRNA内参分子主要有：小分子RNA(RNU6S)、miR-16-5p，miR-21等。合并二代测序结果及文献检索结果，最终选择以下分子作为本次研究的候选内参miR-129-5p、miR-320a、miR-127-3p、miR-99b-5p、miR-128-3p、miR-16-5p和U6。从miRBase数据库(http://microRNA.sanger.ac.uk)中获得所需要miRNA成熟体的序列，上海生工公司设计相应的加尾法引物。选取65例标本提取血浆内外泌体miRNA，经过定量及质检后，采用通用加尾法逆转录RNA及实时荧光定量PCR检测，并对PCR产物进行TA克隆并测序以确定其特异性。最后应用geNorm及Normfinder两个专用的内参分析软件进行数据分析，从而发现可适用于妊娠滋养细胞肿瘤血浆外泌体miRNA实时荧光定量PCR研究的内参分子。
具体实验步骤及结果如下：
1.标本的收集及分组：
抽取妊娠滋养细胞肿瘤病人血浆5ml置于ETDA管内，血浆的分离在采血后2h内完成，4000g 4℃离心10min，取上层血浆分装至1.5mlEP管内，-80℃保存，直至使用，避免反复冻融。滋养细胞肿瘤病人的入组、排除以及分组标准如下。
滋养细胞肿瘤组患者入组标准(符合下列全部条件)：
①签署知情同意书
②临床诊断为妊娠滋养细胞肿瘤
③没有接受放、化疗的初治病人(包括预防性化疗)
④年龄20-45岁
⑤体力分级：ECOG评分≥60分
⑥血象(3天内)：WBC≥3.5×109/L，ANC≥1.5×109/L,Pt≥80×109/L,血清胆红素≤正常值高限的1.5倍，转氨酶≤正常值高限的1.5倍，BUN、Cr≤正常值高限
⑦无严重内科合并症
⑧患者能按方案要求接受随访
排除标准：
①临床未明确诊断妊娠滋养细胞肿瘤
②病理诊断为中间型滋养细胞肿瘤，包括PSTT和ETT
③已进行放、化疗者(包括预防性化疗)
④有严重的或不能控制的内科疾患，不适合化疗者
⑤1年内接受过异体输血、移植手术、细胞治疗或接受过免疫治疗者
分组标准：
耐药组：每2周检测血HCG水平，若连续2次检测血HCG水平呈平台(±10％)或上升(＞10％)，否则为敏感组。
2.建立血浆外泌体内miRNA文库及二代测序及结果分析：
滋养细胞肿瘤患者血浆中外泌体内差异miRNA的表达谱图见图3。
按照以下原则在测序结果中选择候选内参分子如下表：(1)在滋养细胞肿瘤患者血浆外泌体中均高表达的miRNA；(2)按照变异系数CV进行统计分析，选择滋养细胞肿瘤MTX敏感及耐药患者血浆外泌体中表达无明显差异的miRNA；(3)在每个miRNA家族中选一最具有代表性的miRNA。
结合文献，目前选择作为miRNA qRT-PCR的内参分子包括：miR-129-5p、miR-320a、miR-127-3p、miR-99b-5p、miR-128-3p、miR-16-5p和U6。
3.血浆内外泌体的提取：
(1)将-80℃储存的血浆样品置于冰上融化，取250ml血浆至EP管内；
(2)4℃16000g离心10min，以去除冷凝蛋白和细胞碎片，取其上清；
(3)加入等体积STAGO的PT试剂，可室温下放置10-15min，室温下10000g离心5min去除血浆中的纤维蛋白原等；
(4)按1/4标本总体积加入Exoquick exosome precipitation solution，充分混匀；
(5)加入RNase A(10ug/ul)使混合物的终浓度为10ug/ml，在4℃冰箱内放置至少12h；
(6)加入murine rnase inhibitor(浓度为40000U/ML)150units/ml，充分混匀；
(7)室温下1500g离心30min，吸弃上清；
(8)剩余物室温下1500g离心5min，弃剩余上清；
(9)200ulPBS清洗沉淀；
(10)用20ul灭菌PBS重悬外泌体沉淀，用200ul枪头使外泌体充分溶解于PBS中。
4.血浆内外泌体内miRNA的提取：
(1)加入700ul qiazol lysis buffer到含exosome的20ul重悬液中，充分混匀直至完全溶解没有沉淀，室温下孵育5min；
(2)加入140ul氯仿，充分混匀，室温下静置2-3min；
(3)4℃12000g离心15min；
(4)取上层水相转移至新的EP管，估计体积V，注意避免混入下层液相，再加入1.5V100％乙醇，混合均匀；
(5)吸取700ul样品至旋转柱子中，并放入2ml收集管。轻轻盖上盖子，室温下200g离心30s，室温≥8000g(≥10000rpm)离心30s，弃去收集管中的液体；
(6)剩余样品重复(5)；
(7)往柱子中加入700ul RWT buffer，轻轻盖上盖子，室温下200g离心30s，室温≥8000g(≥10000rpm)离心30s，弃去冲洗液；
(8)加入500ul RPE buffer，轻轻盖上盖子，室温下200g离心30s，(室温≥8000g(≥10000rpm)离心30s，弃去冲洗液；
(9)加入500ul 80％乙醇，轻轻盖上盖子，室温下200g离心30s，室温≥8000g(≥10000rpm)离心2min洗去柱子膜，弃去冲洗液；
(10)将旋转柱放入新的2ml收集管中，打开柱子盖，最大转速(21130g)离心5min使膜干燥，弃去含有冲洗液的收集管；
(11)将旋转柱放入新的1.5ml收集管中，往柱中心加入14ulRNase-free水，轻轻盖上盖子，室温下孵育5min，最大转速离心90s溶解RNA；
(12)Qubit定量miRNA的浓度，安捷伦2100生物分析仪对提取的外泌体内miRNA进行质检。滋养细胞肿瘤患者血浆中外泌体内miRNA质检图见图4。
5.候选内参分子进行qRT-PCR检测：
合并测序结果及参考文献结果，最终选择以下分子作为妊娠滋养细胞肿瘤患者血浆外泌体miRNA定量研究的候选内参：miR-129-5p、miR-320a、miR-127-3p、miR-99b-5p、miR-128-3p、miR-16-5p和U6，利用上海生工生物有限公司在线工具设计相应的加尾法引物如下表。
从大量的病例中随机选取的65例，提取血浆外泌体及其所包含的miRNA，对miRNA进行质检，利用miScript II RT Kit(Qiagen cat:#218161)以加尾法进行逆转录。
miRNA加尾法RT体系(20ul)：
RT循环参数如下：37℃60min，95℃5min
仪器：48well geneAmp PCR system 9700
取上述逆转录产物加入200ul RNase-free水，稀释cDNA，利用The miScript SYBRGreen PCR Kit(Qiagen cat:#218076)，行荧光定量PCR检测、通过添加溶解曲线、PCR产物琼脂糖电泳以及TA克隆测序以确定PCR产物的特异性。
qPCR反应体系(25ul):
PCR循环参数：95℃预变性15min，(94℃14s，55℃30s，70℃30s)40个循环。
仪器：Applied biosystems 7900HT
miRNA qRT-PCR产物大小定位——电泳结果显示产物的大小在80bp，是所需扩增的目的片段，详见图5。
miRNA qRT-PCR产物序列确定——内参U6和miR-129-5p测序分析结果显示序列的符合率为100％。详见图6。
miRNA qRT-PCR引物扩增效率和特异性确定，标准曲线示扩增效率达100％，各个样本的溶解曲线重合提示引物的特异性好，扩增曲线接近重合提示扩增产物在各个样本中表达稳定，详见图7。
6.候选内参分子qRT-PCR检测结果分析：
各候选内参分子在血浆外泌体中表达的水平均用Ct值表示，其在表达差异如图8所示，其表达的最大、最小Ct及其表达的变动范围如下表所示：
7.运用geNorm及Normfinder内参软件进行数据分析：
7.1 Normfinder的分析结果：
Normfiner的分析结果显示miR-129-5p是妊娠滋养细胞肿瘤血浆外泌体miRNA研究的最稳定的内参分子。
候选内参分子总体表达的稳定性
7.2 geNorm分析结果：
该程序将某一内参基因与其它内参基因表达水平的两两比值经对数变换后，计算其平均标准差作为基因表达稳定度的平均值M，对所有候选内参基因的表达稳定度进行排序，并对标准化因子进行配对差异分析来判定所需内参基因的最适数目。候选内参基因按M值进行排序，M>1.5者认为不适合作内参，M值越小说明基因表达越稳定。GeNorm分析显示最稳定的是miR-129-5p，候选内参基因进行geNorm分析结果详见图9。
经本发明筛选方法筛选得出的内参分子的筛选结果：
miR-129-5p是一种发现滋养细胞肿瘤血浆外泌体内miRNA的定量研究中的合适的内参，其恒定性均优于以前常用的内参。
下面通过试验方法来说明本发明的具体筛选过程：
例如：以miR-129-5p作为内参实时荧光定量PCR法检测妊娠滋养细胞肿瘤化疗患者MTX敏感组和耐药组血浆外泌体miR-219a-5p表达的差异。
实验操作过程：
1、血浆中外泌体的提取
①将-80℃储存的血浆样品置于冰上融化，取250ml血浆至EP管内。
②4℃16000g离心10min，以去除冷凝蛋白和细胞碎片，取其上清
③加入等体积STAGO的PT试剂，可室温下放置10-15min，室温下10000g离心5min去除血浆中的纤维蛋白原等。
④按1/4标本总体积加入exoquick exosome precipitation solution，充分混匀
⑤加入RNase A(10ug/ul)使混合物的终浓度为10ug/ml，在4℃冰箱内放置至少12h。
⑥加入murine rnase inhibitor(浓度为40000U/ML)150units/ml，充分混匀
⑦室温下1500g离心30min，吸弃上清，
⑧剩余物室温下1500g离心5min，弃剩余上清
⑨用200ulPBS清洗沉淀
⑩用20ul灭菌PBS重悬外泌体沉淀，用200ul枪头使外泌体充分溶解于PBS中。
2、血浆外泌体内miRNA的提取
(1)加入700ul qiazol lysis buffer到含exosome的20ul重悬液中，充分混匀直至完全溶解没有沉淀，室温下孵育5min。
(2)加入140ul氯仿，充分混匀，室温下静置2-3min。
(3)4℃12000g离心15min。
(4)取上层水相转移至新的EP管，估计体积V，注意避免混入下层液相。加入1.5V100％乙醇，混合均匀。
(5)吸取700ul样品至旋转柱子中，并放入2ml收集管。轻轻盖上盖子，室温下200g离心30s，室温≥8000g(≥10000rpm)离心30s，弃去收集管中的液体。
(6)剩余样品重复(5)。
(7)往柱子中加入700ul RWT buffer。轻轻盖上盖子，室温下200g离心30s，室温≥8000g(≥10000rpm)离心30s，弃去冲洗液。
(8)加入500ul RPE buffer。轻轻盖上盖子，室温下200g离心30s，(室温≥8000g(≥10000rpm)离心30s。弃去冲洗液。
(9)加入500ul 80％乙醇，轻轻盖上盖子，室温下200g离心30s，室温≥8000g(≥10000rpm)离心2min洗去柱子膜。弃去冲洗液。
(10)将旋转柱放入新的2ml收集管中。打开柱子盖，最大转速(21130g)离心5min使膜干燥。弃去含有冲洗液的收集管。
(11)将旋转柱放入新的1.5ml收集管中。往柱中心加入14ulRNase-free水，轻轻盖上盖子，室温下孵育5min，最大转速离心90s溶解RNA。
(12)Qubit定量miRNA的浓度，安捷伦2100生物分析仪对提取的外泌体内miRNA进行质检。
(12.1)miRNA-129-5p及miRNA-219a-5p加尾法逆转录引物及实时荧光定量PCR引物的设计：
从miRBase数据库(http://microRNA.sanger.ac.uk)中获得所需miRNA成熟体序列。生工公司设计相应的加尾法引物。miRNA-129-5p的正向引物为CTTTTTGCGGTCTGGGCTT，miRNA-219a-5p的正向引物为AGTGATTGTCCAAACGCAATTCT。
(12.2)对血浆外泌体中提取的miRNA用加尾法进行逆转录：
miRNA加尾法RT体系(20ul)：
RT循环参数如下：37℃60min，95℃5min
仪器：48well geneAmp PCR system 9700
取上述产物加入free水200ul对cDNA进行稀释
(12.3)取上述RT产物，分别进行荧光定量PCR检测：
qPCR反应体系(25ul)
PCR循环参数：95℃预变性15min，(94℃14s，55℃30s，70℃30s)40个循环。
仪器：Applied biosystems 7900HT
(12.4)数据分析：
利用SPSS17.0统计学软件，以miR-129-5p为内参利用2-ΔΔCt methods统计分析妊娠滋养细胞肿瘤患者MTX化疗敏感组和耐药组之间miR-219a-5p表达的差异性。
值得注意的是，具体实施方式仅是对本发明的说明，不应将其视为对本发明的技术方案的限制和限定，因此，采用本发明的实质内容而仅做局部改变，仍应落入本发明的保护范围内。
序列表
<120> 一种适用于妊娠滋养细胞肿瘤患者血浆外泌体miRNA的PCR内参
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
cuuuuugcgg ucugggcuug c 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
ctttttgcgg tctgggctt 19
机译： 根据全面超声检查的数据和患者血浆中人绒毛膜促性腺激素的水平，对输卵管间质进行渐进输卵管妊娠的差异器官保留治疗方法（可选）
机译： 使用锁定核酸钳PCR检测去势抵抗性前列腺癌患者血浆样本中循环肿瘤DNA中的雄激素受体（AR）突变
机译： 外泌体miRNA面板标记组合物，用于诊断早期肝癌的非侵入性体外诊断
