一种基于金纳米颗粒和二碳化钛MXenes的双重催化鲁米诺电化学发光生物传感器

摘要

本公开涉及一种基于金纳米颗粒和二碳化钛MXenes的双重催化鲁米诺电化学发光生物传感器，结合多位点识别策略和新型二维材料‑Ti3C2MXenes的还原性，形成AuNPs‑MXenes作为ECL信号探针，设计高灵敏度电化学发光传感平台来检测Hela外泌体。在该策略中，SA聚合物分子可以提供多位点识别界面以捕获更多适体以提高外泌体的捕获效率，这有助于改善生物传感器的灵敏度并且AuNP‑MXenes可以双重催化鲁米诺ECL信号增强。基于这两种双重扩增策略，获得了高灵敏度和高选择性的生物传感器来检测外泌体，另外，ECL生物传感器也用于血清中的外泌体检测。

说明书

技术领域

本公开涉及一种二维纳米材料-Ti₃C₂MXenes利用其还原性，还原氯金酸形成AuNPs-MXenes的复合物，AuNPs-MXenes复合物双重催化鲁米诺电化学发光以及利用海藻酸钠的(SA)多位点效应构建电化学发光传感器检测外泌体的方法。

背景技术

这里的陈述仅提供与本公开有关的背景信息，而不必然构成现有技术。

外泌体是一种直径在30～100nm、具有双层膜结构的囊泡，可由多种细胞通过胞吐方式分泌至微环境中。外泌体存在于大多数人体液中，包括血液、尿液、唾液和母乳。它们由大多数哺乳动物细胞分泌，携带因子促进细胞-细胞通讯，包括mRNA、碳水化合物、蛋白质(CD63、CD81CD9和EpCAM)和DNA。据报道，外来体在抗肿瘤免疫应答、肿瘤诊断和其他过程中发挥重要作用，并且是早期癌症诊断的有希望的生物标志物。因此，用于外泌体检测的高灵敏度方法不仅对临床诊断有价值，而且还提供关于肿瘤生长和转移的基本生化过程的见解，同时还有助于进一步研究抗肿瘤免疫应答的相关机制。

迄今为止，已经开发了用于外泌体检测的各种方法，包括蛋白印迹法，流式细胞术或酶联免疫吸附剂。这些方法具有一定的缺点，如昂贵的仪器、复杂的技术技能和耗时的操作等。因此，开发简单、灵敏和可靠的外泌体检测方法是一项巨大的挑战。近年来，电致化学发光(ECL)作为一种强大的分析技术，因为由于其高灵敏度，快速性，易控制性和低成本。它已广泛用于蛋白质、DNA、酶等物质的检测，因此，基于ECL的这些优点，它可以有望应用于外泌体检测，分析外泌体的活性。

发明内容

针对背景技术，本公开涉及一种基于二碳化钛-MXenes和金纳米颗粒的双重催化鲁米诺电化学发光生物传感器与应用。

具体来讲，本公开涉及以下方面的技术方案：

在本公开的第一个典型的实施方式中，提供一种二维过渡金属碳化物-核酸适配体探针，其特点是：该探针包括纳米片Ti₃C₂MXenes、氨基酸和修饰有羧基的CD63蛋白核酸适配体，所述纳米片Ti₃C₂MXenes通过Ti-N键与氨基酸相连，氨基酸通过酰胺键与核酸适配体相连。

在本公开的第二个典型的实施方式中，提供所述二维过渡金属碳化物-核酸适配体探针的制备方法，该方法包括：将纳米片Ti₃C₂MXenes和氨基酸置于水中混合均匀后，搅拌，分离得到沉淀物，将得到的沉淀物与适配体进行酰胺反应即可得到二维过渡金属碳化物-核酸适配体探针。

在本公开的第三个典型的实施方式中，提供一种与所述探针配合使用的生物传感器电极，包括：表面修饰有聚丙烯酰胺的基体电极、海藻酸钠和修饰有氨基的CD63蛋白核酸适配体；

所述表面修饰有聚丙烯酰胺的基体电极和修饰有氨基的CD63蛋白核酸适配体均通过羧氨反应与海藻酸钠的连接。

在本公开的第四个典型的实施方式中，提供所述生物传感器电极的制备方法，该方法包括：将聚丙烯酰胺溶液滴到基体电极上，干燥；然后将基体电极浸泡在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和海藻酸钠的混合溶液中进行孵化；随后将基体电极进入核酸适配体溶液中进行孵化，得到生物传感器电极。

在本公开的第五个典型的实施方式中，提供一种电致化学发光(ECL)生物传感器，该生物传感器包括所述二维过渡金属碳化物-核酸适配体探针和所述生物传感器电极，当外泌体存在时，所述二维过渡金属碳化物-核酸适配体探针、所述生物传感器电极和外泌体形成三明治结构(二维过渡金属碳化物-核酸适配体探针-外泌体-生物传感器电极)，并将该三明治结构浸泡在氯金酸溶液中，原位形成AuNPs-二维过渡金属碳化物-核酸适配体探针-外泌体-生物传感器电极，即为电致化学发光(ECL)生物传感器。

在本公开的第六个典型的实施方式中，提供一种电致化学发光的试剂盒，该试剂盒包括所述二维过渡金属碳化物-核酸适配体探针、所述生物传感器电极、鲁米诺和氯金酸溶液。

在本公开的第七个典型的实施方式中，提供所述二维过渡金属碳化物-核酸适配体探针、所述生物传感器电极或所述的电致化学发光(ECL)生物传感器或所述试剂盒在采用电致化学发光方法检测外泌体中的应用。

在本公开的第八个典型的实施方式中，提供一种非诊断目的的检测外泌体的方法，该方法包括采用所述二维过渡金属碳化物-核酸适配体探针、所述生物传感器电极或所述的电致化学发光(ECL)生物传感器或所述试剂盒在采用电致化学发光方法检测外泌体的步骤。

与本发明人知晓的相关技术相比，本公开其中的一个技术方案具有如下有益效果：

本申请结合多位点识别策略和新型二维材料-Ti₃C₂MXenes的还原性，形成AuNPs–MXenes-Apt作为ECL信号探针，设计高灵敏度电化学发光(ECL)传感平台来检测Hela外泌体。在该策略中，海藻酸钠(SA)聚合物分子可以提供多位点识别界面以捕获更多适配体以提高外泌体的捕获效率，这有助于改善生物传感器的灵敏度并且AuNP-MXenes-Apt可以双重催化鲁米诺使ECL信号增强。基于这两种双重扩增策略，获得了高灵敏度和高选择性的生物传感器来检测外泌体，另外，ECL生物传感器也用于血清中的外泌体检测。该传感器可作为检测外泌体的可行性工具，为外泌体的临床诊断等提供了有力的证据。

附图说明

构成本公开一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。

图1为本公开电化学发光传感器的组装及机理示意图。

图2是Ti₃AlC₂的SEM图。

图3是MXenes的TEM图。

图4是MXenes剥离前后的XRD图。

图5是不同浓度外泌体的电化学发光传感器的信号响应；a-h代表:10²,5×10²,10³,2.5×10³,5×10³,10⁴，5×10⁴,10⁵particles/μL。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，需要一种高灵敏度和高选择性的生物传感器来检测外泌体，针对此，在本公开的第一个典型的实施方式中，提供一种二维过渡金属碳化物-核酸适配体探针，其特点是：该探针包括纳米片Ti₃C₂MXenes、氨基酸和修饰有羧基的CD63蛋白核酸适配体，所述纳米片Ti₃C₂MXenes通过Ti-N键与氨基酸相连，氨基酸通过酰胺键与核酸适配体相连。

本公开中核酸适配体特异性结合的是外泌体表面的CD63蛋白。在本公开的一个或一些实施方式中，所述CD63蛋白的核酸适配体的包括但不仅仅限于以下序列：5'--TTTTTTCAC CCC ACC TCG CTC CCG TGA CAC TAA TGC TA，如SEQ ID NO.1所示，还可以包括其他特异性结合CD63蛋白的核酸适配体。

该探针的设计既能保留MXenes自身的优良性质：大的比表面积，导电性好，高的催化性质以及超强的还原性，还能使MXenes表面带有氨基，便于修饰在电极上。这种是利用氨基酸和MXenes之间的相互作用力结合，形成Ti-N键，使MXenes表面修饰氨基。与之前研究的通过静电吸附作用相比，利用当前这种的修饰方式，比静电吸附作用更加的稳定，可以使MXenes表面带有氨基，进行下一步的修饰。

在本公开的一个或一些具体的实施方式中，所述氨基酸为甘氨酸或亮氨酸，经过试验验证，甘氨酸或亮氨酸可以与Ti₃C₂MXenes更好的结合。

在本公开的第二个典型的实施方式中，提供所述二维过渡金属碳化物-核酸适配体探针的制备方法，该方法包括：将纳米片Ti₃C₂MXenes和氨基酸置于水中混合均匀后，搅拌，分离得到沉淀物，将得到的沉淀物与适配体进行酰胺反应即可得到二维过渡金属碳化物-核酸适配体探针。

进一步的，所述Ti₃C₂MXenes、氨基酸和水的投料比例(0.5～1)mg：(4～6)mg：(10～40)mL；室温下搅拌18～36h。

进一步的，所述酰胺反应的温度为35～40℃，时间为0.5～1.5h。

Ti₃C₂MXenes具有良好的电子转移能力，优异的催化能力，良好的生物相容性以及超强的还原性。此外，Ti₃C₂MXenes大的比表面积还使其成为加载更多生物分子的良好载体，从而显著提高生物传感器的灵敏度。进一步的，所述纳米片Ti₃C₂MXenes的制备方法，包括以下步骤：将LiF加入浓度为8～10mol/L的盐酸中，搅拌，随后将Ti₃AlC₂粉末加入此混合物中并在30～40℃下搅拌18～36小时；随后将溶液离心洗涤，使pH≥6，弃去上清液，在沉淀中加入水，离心，弃去上清液，继续在沉淀中加入水，在氮气的保护下，超声0.5～1.5h，最后，将溶液离心，保留上清液，即为纳米Ti₃C₂MXenes分散液。

在本公开的第三个典型的实施方式中，提供一种与所述探针配合使用的生物传感器电极，包括：表面修饰有聚丙烯酰胺的基体电极、海藻酸钠和修饰有氨基的CD63蛋白核酸适配体；

所述表面修饰有聚丙烯酰胺的基体电极和核酸适配体均通过羧氨反应与海藻酸钠的连接。

进一步的，所述基体电极为玻碳电极。

海藻酸钠(C₆H₇O₆Na)n主要由海藻酸的钠盐组成，由β-D-甘露糖醛酸(M单元)与α-L-古洛糖醛酸(G单元)依靠β-1,4-糖苷键连接并由不同比例的GM、MM和GG片段组成的共聚物，表面含有许多羧基，可以提供更多的识别位点，而且其亲水性好，附着力低，性能优异，并且具有生物相容性，因此本公开利用其优异的性质可以显着提高生物传感器的灵敏度和选择性。在多分散性分子群中，通常Mw>Mn。Mw/Mn的系数为分散性指数，海藻酸钠商品的指数经典范围为1.5～2.5。

在本公开的第四个典型的实施方式中，提供所述生物传感器电极的制备方法，该方法包括：将聚丙烯酰胺溶液滴到基体电极上，孵化待干；然后将基体电极浸泡在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和海藻酸钠的混合溶液中进行孵化；随后将基体电极进入核酸适配体溶液中进行孵化，得到生物传感器电极。

进一步的，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和海藻酸钠的体积比例为0.8～1.2：0.8～1.2：1.8～2.2，EDC的浓度为80～120μM，NHS的浓度为300～500μM，海藻酸钠的浓度为0.5～1.5mg/ml；在35～40℃孵化1～3h。

进一步的，随后将基体电极进入核酸适配体溶液中进行孵化，孵化条件为：35～40℃孵化1～3h。

进一步的，所述聚丙烯酰胺的重均分子量为：MW≥300万。

在本公开的第五个典型的实施方式中，提供一种电致化学发光(ECL)生物传感器，该生物传感器包括所述二维过渡金属碳化物-核酸适配体探针和所述生物传感器电极，当外泌体存在时，所述二维过渡金属碳化物-核酸适配体探针、所述生物传感器电极和外泌体形成三明治结构(二维过渡金属碳化物-核酸适配体探针-外泌体-生物传感器电极)，并将该三明治结构浸泡在氯金酸溶液中，原位形成AuNPs-二维过渡金属碳化物-核酸适配体探针-外泌体-生物传感器电极，即为电致化学发光(ECL)生物传感器。

在本公开的第六个典型的实施方式中，提供一种电致化学发光的试剂盒，该试剂盒至少包括所述二维过渡金属碳化物-核酸适配体探针、所述生物传感器电极、氯金酸溶液和鲁米诺。

在本公开的第七个典型的实施方式中，提供所述二维过渡金属碳化物-核酸适配体探针、所述生物传感器电极或所述的电致化学发光(ECL)生物传感器或所述试剂盒在采用电致化学发光方法检测外泌体中的应用。

在本公开的第八个典型的实施方式中，提供一种非诊断目的的检测外泌体的方法，该方法包括采用所述二维过渡金属碳化物-核酸适配体探针、所述生物传感器电极或所述的电致化学发光(ECL)生物传感器或所述试剂盒在采用电致化学发光方法检测外泌体的步骤。

采用所述试剂盒进行检测的方法包括：将所述生物传感器电极浸泡至待测外泌体溶液中，使外泌体附着在生物传感器电极上，随后将附着外泌体的生物传感器电极浸泡至二维过渡金属碳化物-核酸适配体探针溶液中，使探针附着在生物传感器电极的外泌体上，从而组成探针和生物传感器电极夹载外泌体的生物传感器，再将所述生物传感器浸泡在氯金酸溶液中，使纳米金颗粒还原在电极复合物的表面上，进而制备成表面附着有纳米金颗粒的探针和生物传感器电极夹载外泌体的电化学发光生物传感器，对该电化学发光生物传感器在鲁米诺溶液中进行电化学发光检测。

具体方法包括：

(1)标准溶液的配制：配制一组不同浓度的外泌体标准溶液；

(2)工作曲线的绘制：将所述生物传感器电极分别浸泡至不同浓度的外泌体标准溶液中，使外泌体附着在生物传感器电极上，随后将附着外泌体的生物传感器电极浸泡至二维过渡金属碳化物-核酸适配体探针溶液中，使探针附着在生物传感器电极的外泌体上，从而组成探针和生物传感器电极夹载外泌体的生物传感器，再将所述生物传感器浸泡在氯金酸溶液中，使纳米金颗粒还原在电极复合物的表面上，进而制备成表面附着有纳米金颗粒的探针和生物传感器电极夹载外泌体的电化学发光生物传感器，在光电倍增管为600V下对该电化学发光生物传感器在鲁米诺溶液中进行电化学发光检测，得到不同浓度的外泌体标准溶液的ECL强度，再根据外泌体标准溶液的浓度以及相应的ECL强度，绘制线性关系曲线；

(3)样品的检测：根据步骤(2)中的方法测定待测外泌体溶液的ECL强度，再根据所述线性关系曲线，得到待测外泌体溶液中外泌体的浓度。

该检测方法用于非诊断目的的检测外泌体，可研究抗肿瘤免疫应答的相关机制等。

在本公开中，发现Ti₃C₂MXenes可以作为催化剂和还原剂，利用其还原性，还原HAuCl₄形成AuNPs-MXenes复合物，用于改进鲁米诺的ECL。从而我们开发了一种基于SA的多位点识别与AuNPs-MXenes催化鲁米诺电化学发光结合的高灵敏度生物传感器平台用于外泌体检测。检测限为30个/微升，该检测限相对高于酶联免疫的传统方法以及申请人前期研究得到的ECL生物传感器。此外，基于双重扩增策略，其他外泌体的检测都取得了成功，这表明该平台是可行的。因此，基于SA的多位点识别和AuNPs-MXenes-Aptamer纳米探针结合的生物传感器为评估外来体表面蛋白表达提供了强有力的工具，并开启了对外来体在代谢过程中的生理功能以及临床诊断的新见解和药物筛选。

电化学发光传感器的组装及实验原理：

电化学发光传感器的组装及机理如图1所示，基体电极玻碳电极(GCE)]表面修饰聚丙烯酰胺(PAM)，由于PAM表面含有氨基，从而根据羧氨反应，可以在其表面修饰表面带有很多羧基的海藻酸钠(SA)，这样可以增加适配体结合的活性位点，使更多的适配体修饰在电极上，从而捕获更多的外泌体。接着合成MXenes-Aptamer(MXenes-glycine-Apt)作为探针与外泌体结合，形成三明治结构，最后利用MXenes超强的还原性，使组装完成的电极浸泡在氯金酸(HAuCl₄)中，在电极表面形成AuNPs-MXenes-Aptmer复合物，形成的AuNPs–MXenes-Aptmer双重催化鲁米诺的电化学发光，利用产生的电化学发光信号的强弱来反映捕获外泌体的多少，从而达到检测外泌体的目的。电化学发光信号较强则在电极表面的AuNPs–MXenes-Aptmer较多，从而间接的说明在电极上的外泌体较多，可以根据电化学信号的强弱来反映出此传感器捕获外泌体的多少。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本公开的技术方案。

实验试剂与材料

适配体为5'-COOH-TTTTTTCAC CCC ACC TCG CTC CCG TGA CAC TAA TGC TA，5'-NH₂-TTTTTTCAC>3AlC₂(98％)购自福斯曼科学有限公司(中国北京)。聚丙烯酰胺(PAM)和鲁米诺购自Sigma-Aldrich。HAuCl₄·3H₂O(48％，w/w)获自Shanghai>

实验仪器

电化学工作站，电化学发光工作站，使用三电极体系(参比电极：Ag/AgCl电极，对电极：铂丝电极，工作电极：玻碳电极)，扫描电子显微镜SEM，透射电子显微镜，紫外分光光度仪，傅里叶红外光谱仪等。

实施例1

1、MXenes-glycine-Aptmer纳米探针的合成

将0.8g LiF加入10ml,9mol/L的盐酸中，搅拌5分钟，随后将Ti₃AlC₂(0.5g)粉末加入此混合物中并在35℃下搅拌24小时。随后将溶液离心洗涤7-8次，使pH≥6，弃去上清液，在沉淀中加入40-50mL去离子水，以3500rpm离心60分钟，弃去上清液，继续在沉淀中加入40-50mL去离子水，在氮气的保护下，超声1h,最后，将溶液以3500rpm离心60分钟，保留上清液(即为纳米Ti₃C₂MXenes分散液)，并在4℃下保存备用。

将5mg的甘氨酸(glycine)溶于20ml去离子水中在室温下搅拌。然后，逐滴加入10mL浓度为0.075mg/ml的Ti₃C₂MXenes分散液并在室温下搅拌24小时，随后以12000r离心20分钟，弃去上清液，沉淀标记为MXenes-glycine，备用。

EDC(400mM)和NHS(100mM)和Aptamer(1uM，5'-COOH-TTTTTT CAC CCC ACC TCGCTC CCG TGA CAC TAA TGC TA)混合物在37℃下活化1小时。此后，将200μL获得的Ti₃C₂MXenes-glycine在37℃下加入Aptmer溶液中，反应1h，最后，将混合物以12000rpm离心10分钟，弃去上清液，洗涤并加入去离子水。

2、电极的组装及肽链在电极上的共价反应

(1)玻碳电极表面预处理

将玻碳电极(GCE)用0.3μm的Al₂O₃粉末在麂皮上进行打磨抛光处理，然后分别用乙醇、水超声清洗3min，用纯净氮气将电极表面吹干。

清洗吹干的玻碳电极作工作电极，Ag/AgCl作参比电极，铂丝作对电极，铁氰化钾溶液中，-0.2～0.6V，100mV/s，扫描CV至稳定。如此反复，直至玻碳电极的氧化还原电势差在80mV左右，将玻碳电极用水洗净，氮气吹干。

(2)电化学发光生物传感器的组装

PAM修饰处理后的GCE：取浓度为0.1mg/ml的PAM 6μl滴到玻碳电极表面，37℃下孵化待干，接着将电极浸泡在100μM EDC，400μM NHS，以及1mg/ml的SA中(体积比按照:1:1:2)，37℃下孵化2h。随后将电极浸没在1μM(40μL)Aptmer(5'-NH₂-TTTTTTCAC>

将Aptmer/SA/PAM/GCE浸没在不同浓度的Hela外泌体中，在37℃的环境中2h。洗净吹干后得到exosomes/Aptmer/SA/PAM/GCE。

将已捕获外泌体的电极用蒸馏水洗净吹干后，置于探针溶液中37℃下孵化2h，待反应完全之后用蒸馏水进行清洗，氮气吹干，然后将组装好的电极(MXenes-Aptmer/exosomes/Aptmer/SA/PAM/GCE)浸泡在2mg/ml的HAuCl₄溶液中1h，随后将电极冲洗吹干，即得到制备好的电化学发光生物传感器。

由于CD63蛋白在外泌体上是普遍存在的，只是含量有不同，因此可利用该传感器平台监测不同细胞分泌的外泌体。本申请采用该方法还检测了肝癌细胞(HepG2)外泌体和卵巢癌细胞(OVCAR)外泌等。

3、实验结果的讨论

图2为剥离前的Ti₃AlC₂的扫描电子显微镜示意图。

图3为剥离后的MXenes的TEM图。由图可见经过剥离。形成纳米片的MXenes。

图4为剥离前后MXenes的XRD图。

图5为不同浓度外泌体催化后的电化学发光传感器的信号响应，利用此电化学发光生物传感器对外泌体进行分析。由图5可见，随着外泌体浓度的增加，电化学发光信号逐渐增大。在外泌体的浓度为10²-5*10⁵个/微升范围内，电化学发光信号的大小与外泌体的浓度的对数呈线性关系。

实施例2

1、MXenes-glycine-Aptmer纳米探针的合成

同实施例1。

2、电极的组装及传感器的组装

(1)玻碳电极表面预处理

同实施例1

(2)电化学发光生物传感器的组装

PAM修饰处理后的GCE：取浓度为0.1mg/ml的PAM 6μl滴到玻碳电极表面，37℃下孵化待干，接着将电极浸泡在100μM EDC，400μM NHS，以及1mg/ml的SA中(体积比按照:1:1:2)，37℃下孵化2h。随后将电极浸没在0.8μM(40μL)Aptmer中,37℃下孵化2h，洗净吹干后得到Aptmer/SA/PAM/GCE。将Aptmer/SA/PAM/GCE浸没在不同浓度的外泌体中，在25℃的环境中1h。洗净吹干后得到exosomes/Aptmer/SA/PAM/GCE。

将已捕获外泌体的电极用蒸馏水洗净吹干后，置于探针溶液中37℃下孵化2h，待反应完全之后用蒸馏水进行清洗，氮气吹干，然后将组装好的电极浸泡在2mg/ml的HAuCl₄溶液中1h，形成AuNPs-MXenes--Aptmer/exosomes/Aptmer/SA/PAM/GCE，随后将电极冲洗吹干，即得到制备好的电化学发光生物传感器。

实施例3

1、MXenes-glycine-Aptmer纳米探针的合成

同实施例1

2、电极的组装及传感器的组装

(1)玻碳电极表面预处理

同实施例1。

(2)电化学发光生物传感器的组装

PAM修饰处理后的GCE：取浓度为0.1mg/ml的PAM 6μl滴到玻碳电极表面，37℃下孵化待干，接着将电极浸泡在100μM EDC，400μM NHS，以及1mg/ml的SA中(体积比按照:1:1:2)，37℃下孵化2h。随后将电极浸没在1.2μM(40μL)Aptmer中,37℃下孵化2h，洗净吹干后得到Aptmer/SA/PAM/GCE.将Aptmer/SA/PAM/GCE浸没在不同浓度的外泌体中，在50℃的环境中30分钟。洗净吹干后得到exosomes/Aptmer/SA/PAM/GCE。

将已捕获外泌体的电极电极用蒸馏水洗净吹干后，置于探针溶液中37℃下孵化1h，待反应完全之后用蒸馏水进行清洗，氮气吹干，然后将组装好的电极浸泡在2mg/ml的HAuCl₄溶液中1h，形成AuNPs-MXenes-Aptmer/exosomes/Aptmer/SA/PAM/GCE，随后将电极冲洗吹干，即得到制备好的电化学发光生物传感器。

上述实施例为本公开较佳的实施方式，但本公开的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本公开的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本公开的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 青岛大学

<120> 一种基于金纳米颗粒和二碳化钛MXenes的双重催化鲁米诺电化学发光生物传感器

<130> 2018

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 38

<212> DNA

<213> 核酸适配体

<400> 1

ttttttcacc ccacctcgct cccgtgacac taatgcta 38