烟草中水溶性总糖、还原糖和淀粉的连续流动分析方法

摘要

本发明公开了一种烟草中水溶性总糖、还原糖和淀粉的测定方法，使用以下装置：样品萃取分离瓶，包括：外套管(1)、内套管(2)；样品萃取架(5)；样品收集架(6)；转抽(7)。步骤为：萃取总糖和还原糖；高氯酸水解淀粉后萃取；在连续流动分析仪上测定即得到烟草中水溶性总糖、还原糖和淀粉的含量。本发明的测定方法具有前处理简单方便、重复性好的优点。

说明书

技术领域

本发明属化学分析技术领域，具体涉及一种烟草中水溶性总糖、还原糖和淀粉的连续流动分析方法。

背景技术

基因组学是现代生命科学中最活跃、最重要的前沿领域之一。中国烟草总公司于2010年底启动了“烟草基因组计划重大专项”，希望通过重大专项的实施，在基因工程育种方面取得重大突破，实现香气质、香气量、有害成分、烟碱、产量、抗性、养分高效利用、烤性等的精确改良和定向育种，为卷烟减害降焦提供新的途径。随着“烟草基因组计划重大专项基于基因组编辑技术的工厂化育种方案”的推进，以所有基因编辑素材为对象，通过化学成分分析对素材进行筛选，并通过烟叶的配伍性测试和卷烟配方验证，确定工业可用性强的品种，成为了烟草行业迫切需求的关键技术内容。

糖类化合物是烟叶所有成分中含量最大的一类化合物，占干物质总量的25wt％～50wt％。烟草中的水溶性总糖包括葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖，其中葡萄糖、果糖、麦芽糖是还原糖，蔗糖是非还原糖。烟草中的糖类化合物对烟叶品质影响巨大。烤烟中的糖类除与氨基酸反应生成糖–氨基酸缩合物外，还可以直接作为某些香味成分的前体物，经热解形成香味物质。而且，烟叶燃吸时，糖类化合物高温裂解后能使烟气呈酸性(pH 5.3～6.5)，对烟气的香气和吃味都有良好的作用，并能减少烟气的刺激性。因此烟草中的水溶性总糖与还原糖是决定烟叶品质的重要化学成分，是烟草化学常规分析中的重要项目。

淀粉是高等植物中碳水化合物贮藏的主要形式，成熟的鲜烟叶中淀粉含量高达40wt％。与其他植物相比，鲜烟叶中的淀粉只作为暂时贮存形态，烟叶经调制、发酵后，淀粉大部分转化为小分子碳水化合物，小分子碳水化合物在燃吸过程中会裂解产生酸性物质，这些酸性物质在中和含氮化合物燃烧过程中产生的碱性气体方面有着重要作用；适宜的淀粉含量是提高卷烟香吃味质量的重要指标。

可见，随着基于基因组编辑技术的工厂化育种方案的推进，水溶性总糖、还原糖和淀粉已成为基因工厂化育种素材化学筛选和评价体系中重要的检测评价指标。

目前，烟草行业糖类化合物的测定方法主要有费林试剂法、近红外分光光度法、连续流动分析法、毛细管电泳法、气相色谱法和高效液相色谱法等。淀粉的测定常用碘显色连续流动分析法、离子色谱法、高效液相色谱法等。其中，连续流动分析技术因具有检测速度快、样品和试剂用量少等优点，在国内外烟草行业被广泛应用于烟草中水溶性糖、总植物碱、钾、氯、淀粉、石油醚提取物等成分的检测中。

在传统的连续流动分析中，如果要对同一个样品中的水溶性总糖、还原糖和淀粉进行检测，需要称取两份样品，并采用不同的前处理方法分别对两份样品进行提取净化方能实现，不仅操作繁琐，而且需要耗费双倍甚至更多的时间、试剂、人力、物力，严重影响检测工作效率。

随着烟草行业烟草基因编辑工厂化育种工作的启动，通过基因编辑将产生数万个素材。要对海量素材进行快速化学分析评价，现有方法很难满足需求。

为解决上述问题，提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种烟草中总糖、还原糖和淀粉的连续流动分析方法。

本发明的目的还在于提供一种集快速萃取、过滤为一体的前处理装置，可有效实现烟草样品中总糖、还原糖和淀粉的快速萃取和分离。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的。

一种烟草中水溶性总糖、还原糖和淀粉含量的测定方法，使用以下装置：

样品萃取分离瓶，包括：外套管1，其底部密封且为平底；内套管2，其外径与所述外套管1的内径相适配，其长度大于所述外套管1的长度；筛板3，位于所述内套管2的下端开口内，为一个或多个；密封圈11，套在所述内套管2的下端外，与所述外套管内壁形成密封；样品萃取架5，其内有若干样品萃取分离瓶放置孔51，用于放置所述样品萃取瓶；样品收集架6，其内有若干第一样品瓶放置孔61和若干第二样品瓶放置孔62，用于放置第一样品瓶610和第二样品瓶620；转抽7，位于所述样品收集架6中心部；所述样品收集架6和所述样品萃取架5可分别围绕所述转抽7旋转；水浴槽4，放置在所述样品萃取分离瓶放置孔51下面；

该方法包括以下步骤：

①称取0.5g烟草样品放置于外套管1中，加入50mL萃取剂，插入内套管2并放置在所述样品萃取架5上进行超声萃取30min；

②萃取结束后把上述内套管2下压，使萃取液完全通过筛板3过滤后进入到内套管2中，然后将萃取液转移至圆底烧瓶中；

③向内套管2中再次加入20mL萃取剂，将内套管2向上拉，使萃取剂在真空作用下通过筛板3进入到外套管1中，充分振荡洗涤样品；然后再次把内套管下压，使洗涤液完全通过筛板3过滤后进入到内套管2中，合并洗涤液于所述圆底烧瓶中；然后在90℃水浴中将所述圆底烧瓶内萃取液中的萃取剂蒸干回收；然后向蒸干萃取剂后的圆底烧瓶中加入50mL的5wt％的醋酸溶液混匀后将其转移至第一样品瓶610中，再用20mL的5wt％醋酸溶液充分洗涤圆底烧瓶再转移至第一样品瓶610中，用5wt％醋酸溶液将第一样品瓶610定容至刻度得到试液A，用于烟草中水溶性总糖和还原糖含量的测定；

④向移出萃取液的内套管2中加入25mL的40wt％高氯酸溶液；把内套管向上拉，让高氯酸溶液在真空作用下完全通过筛板3进入到外套管1中，然后放置在所述样品萃取架5上进行超声萃取10min；

⑤萃取结束后取出样品萃取架5，将内套管2下压，让提取液通过筛板3进入到内套管2中，然后将内套管2中提取液转移至第二样品瓶620中；

⑥向内套管2中加入25mL水，将内套管2向上拉，使水在真空作用下通过筛板3进入到外套管1中，充分振荡洗涤样品；然后再次把内套管下压，使洗涤液完全通过筛板3过滤后进入到内套管2中，将洗涤液转移至第二样品瓶620中；用水将第二样品瓶620定容至刻度得到试液B，用于烟草中淀粉含量测定；

⑦在连续流动分析仪上测定步骤③得到的试液A和步骤⑥得到的试液B，即得到烟草中水溶性总糖、还原糖和淀粉含量。

优选地，所述的筛板3的孔径为20μm，所述筛板3由密封圈11固定在所述内套管2的下端开口内。

优选地，步骤①、②或③所述的萃取试剂为80v/v％乙醇水溶液。

本发明的有益效果：

1、本发明使用的装置通过一次样品前处理即可获得水溶性总糖、还原糖和淀粉含量的测定结果，与现行标准方法中糖和淀粉分别称取样品分别进行样品前处理再分别测定含量相比，具有简单、方便、萃取效果好、样品处理通量高等优点。

2、本发明通过采用自主设计的样品萃取分离瓶，超声萃取完成后稍加放置，烟草样品粉末就沉降到样品外套管底部，过滤时内套管中的筛板只与上层清夜接触，这样可有效的避免过滤过程中的筛板堵塞，过滤速度更快，过滤操作更容易实现，使样品前处理周期大大缩短。本发明的样品萃取瓶设计精巧，实用新强，使得样品萃取效果有较大提高。

3、本发明的样品前处理和测试方法和目前行业标准相比，日样品分析量可提高5倍以上，为基因编辑素材化学筛选提供了快速、准确、可靠的高通量分析方法。

附图说明

图1为本发明的外套管示意图；

图2为本发明的内套管示意图；

图3为本发明的内套管插入外套管口部示意图；

图4为本发明的内套管下压示意图；

图5为本发明的内套管上拉示意图；

图6为本发明的样品萃取架和样品收集架示意图；

图7为本发明的第一样品瓶、第二样品瓶及水浴槽示意图；

附图说明：1-外套管；11-密封圈；12-样品；2-内套管；3-筛板；4-水浴槽；5-样品萃取架；51-样品萃取分离瓶放置孔；6-样品收集架；61-第一样品瓶放置孔；62-第一样品瓶放置孔；610-第一样品瓶；620-第二样品瓶；7-转轴。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细地说明，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

除非另有说明，本发明的百分比浓度为体积百分比浓度。

1、仪器与试剂

AA3型连续流动分析仪，BRAN+LUEBBE公司生产，由：取样器、比例泵、渗析器、螺旋管、比色计(配570nm和410nm滤光片)等部件组成；

电子天平，瑞士梅特勒公司生产，感量0.0001g；

KR-934CFS型超声波发生器，东莞市铠瑞超声自动化科技有限公司生产；

改进的样品萃取分离瓶见附图，由外套管和带孔径为20μm过滤筛板及密封圈的内套管组成，外套管的内径为3.0cm，高度为8.0cm，内套管外径为2.9cm，长度为10cm，密封圈厚度为0.6mm，与外套管内壁形成密封。样品萃取分离瓶使用前先检验密封性，在1.3-1.5倍大气压下密封圈处不漏液为合格。本发明的样品萃取分离瓶可以重复使用，每次使用完毕后清洗干净晾干后即可再次使用。

参照标准YC/T 159-2002和YC/T 216-2013中所述方案配制本研究所用试剂、标准储备液和工作溶液。

2、乙醇提取烟草样品中的糖类化合物

47置于超声波发生器中在室温下超声萃取30分钟；萃取结束后取出样品萃取架，把内套管下压，让糖类化合物萃取液通过过滤筛板进入到内套管中，含淀粉的样品残渣留在外套管中，将内套管中糖类化合物的乙醇萃取液转移至100mL圆底烧瓶中；向内套管中再次加入80v/v％乙醇溶液20mL；把内套管向上拉，使乙醇溶液在真空作用下通过筛板进入到外套管中，充分振荡洗涤；洗涤完后再次把内套管下压，让洗涤液通过过滤筛板进入到内套管中，将内套管中洗涤液转移合并至100mL圆底烧瓶中；然后在90℃水浴中将100mL圆底烧瓶内糖类化合物提取液中的乙醇蒸干回收；向蒸干乙醇后的圆底烧瓶中加入50mL的5wt％醋酸溶液混匀，将圆底烧瓶中的糖类化合物醋酸液转移至第一样品瓶(610)中，再用5wt％醋酸溶液充分洗涤圆底烧瓶，将洗涤液也转移至第一样品瓶(610)中，用5wt％醋酸溶液定容至刻度得到试液A，用于水溶性总糖和还原糖含量的测定。

3、高氯酸提取烟草样品残渣中的淀粉

向上述的移出糖类化合物提取液的样品萃取分离瓶的内套管中加入25mL的40wt％高氯酸溶液；把内套管向上拉，让高氯酸溶液在真空作用下通过筛板进入到外套管中；将样品萃取分离瓶放置在样品萃取架上，然后放置于超声波发生器中在室温下超声萃取10分钟；萃取结束后取下样品萃取分离瓶，把内套管下压，让淀粉提取液通过过滤筛板进入到内套管中，然后将内套管中淀粉提取液转移至第二样品瓶中；再向内套管中加入25mL水，将内套管向上拉，使水在真空作用下通过筛板进入到外套管中，充分振荡洗涤样品；然后再次把内套管下压，使洗涤液完全通过筛板过滤后进入到内套管中，将洗涤液转移至第二样品瓶中；用水将第二样品瓶定容至刻度得到试液B，用于烟草中淀粉含量测定。

4、流动分析仪检测

将上述得到的试液A在流动分析仪上与对羟基苯甲酸酰肼反应，于85℃的碱性介质中生成黄色的偶氮化合物，在410nm测定，即得到烟草中水溶性总糖、还原糖的含量。

将上述得到的试液B在酸性条件下与碘发生显色反应，在570nm下测定，即得到烟草中淀粉含量。

实施例：

按上述的方法要求，测试10种烟草样品中总糖、还原糖和淀粉的含量。

分析结果为：10种烟草样品测定总糖含量范围为：18.5％-28.7wt％，还原糖含量范围为15.4％-26.1wt％，淀粉含量范围为2.9％-4.1wt％。

烟草样品在相同条件下平行测定7次，并计算7次平行测定结果的相对标准偏差，可得总糖的RSD为1.8％、还原糖的RSD为2.1％、淀粉的RSD为1.6％，说明方法精密度良好。烟草样品在不同时间内测定为每天测定1次，共7次，计算7次测定结果的相对标准偏差，可得总糖的RSD为2.3％、还原糖的RSD为2.2％、淀粉的RSD为1.9％；说明在不同时间内测定，方法精密度仍然良好。

回收率实验：样品按选定的前处理条件处理，并按选定的流动分析仪检测分析，测定时称取相同的烟草样品2份，其中一份为基准，另一份加入已知量的糖和淀粉标样(设0.05mg、0.2mg、1.0mg三个添加量)，通过加入标准的测出量除以标准加入量计算回收率。得到总糖的回收率在95.4％～101.1％之间，还原糖的的回收率在92.7％～98.1％之间，淀粉的的回收率在96.4％～101.3％，说明本方法方法具有很高的回收率。

通过对比行业标准的前处理方法及检测方法，本发明的前处理方法和检测方法效率提高5倍以上，适合烟草样品高通量分析检测工作的开展。