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第四届全国微生物基因组学学术研讨会

第四届全国微生物基因组学学术研讨会

  • 召开年：2012
  • 召开地：济南
  • 出版时间： 2012-08

主办单位：中国微生物学会;山东微生物学会

会议文集：第四届全国微生物基因组学学术研讨会论文集

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  • 摘要：利用454测序技术测定了井冈霉素产生菌野生型5008的全基因组序列，并结合特殊的末端片段克隆，获得了大小为10.15Mb的染色体序列，以及大小分别为165.57kb和73.28kb的线形质粒和环形质粒序列，其中编码数百个调节基因(环境应答)。在此基础上，制备了全基因组芯片，考察了野生型在28℃和37℃不同培养条件下的转录组变化。在37℃条件下，7.5%的编码区的表达都得到显著提高；在高温发酵条件下，谷氨酸的胞内浓度特异性增加，而且被井冈霉素的生物合成所利用，证实了谷氨酸是井冈霉素生物合成的直接N前体。在37℃条件下，有22个调节基因的转录明显提高。最终证实了证实了井冈霉素的生物合成与链霉菌的heat-shock调控系统紧密相关。
  • 摘要：通过对一株甲烷古菌的基因同源性及功能分析，化合物结构分析，生理学实验，Microarray分析等手段，证明甲烷古菌中也存在AHL介导的群感效应，说明群感效应在原核生物中普遍存在；而且群感效应信号分子可用于激发甲烷鬃菌形成长链细胞，促进厌氧污泥颗粒的形成—厌氧反应器高效运行的基础。
  • 摘要：为更好地研究高产工业菌株9-39中阿维菌素的高产机制，从基因组水平解析阿维菌素高产性状相关的关键基因，对其进行了全基因组序列的精细测定，在该工业菌株的基因组上发现了3个大片段缺失、463个SNP和35个InDel位点，为通过比较基因组研究揭示阿维菌素高产机制奠定了基础。菌株9-39的基因组共计约9,767,982 by(平均GC含量为70.7%)，编码8,148个可能的开放阅读框(ORF)。与ATCC31267基因组的比较分析发现，菌株9-39的基因组上core genome区域(oriC附近的6.5 Mb左右)相对保守，该区域包含绝大多数的必需基因，而左末端约1 Mb左右的亚端粒区域，在基因组的右末端同时存在一个反向重复的拷贝。在高产菌株左末端435 Kb的大片段缺失经实验验证表明对阿维菌素产量有促进作用，而菌株特有的大片段ST16(154 Kb)和ST27(202 Kb)对于阿维菌素产量也具有一定的促进作用。
  • 摘要：近年来，基于结核分枝杆菌己有的基因组数据，采用系统生物学的方法和思路，初步完成了结核分枝杆菌的全局性蛋白质-蛋白质以及蛋白质-DNA相互作用网络构建，发现和鉴定了一批重要的功能基因，为进一步系统研究结核分枝杆菌的基因功能，为发现潜在药物靶标奠定基础。(1)建立和完善了研究微生物蛋白质互作技术体系，并在不同微生物中获得成功应用，发现了DNA复制和转录调控新机制。(2)在国际上率先构建完成了第一个非计算机预测的结核分枝杆菌全局性蛋白质互作网络，鉴定了结核分枝杆菌的毒素-抗毒素蛋白的新功能，发现了病原菌潜伏和生长调控的新机制。(3)创建了结核杆菌转录调控研究平台，发现了关键调控因子及其靶调控的基因。(4)绘制了结核分枝杆菌全局性转录调控网络，发现了结核杆菌的耐药突变调控机制以及抗氧化能力。
  • 摘要：第二代高通量测序方法广泛的应用于微生物基因组研究,但第二代短reads测序方法对于较多重复片段的基因组测序结果处理能力有限.近期本实验室对一株产生重要药物的细菌进行基因组测序,该细菌基因组大小4Mb,GC含量67.9％。首先采用第二代中的Illumina技术进行测序，组装之后得到6条scaffold，其中contig为518条，结果已经非常不错。同样这对这株细菌，也同时采用了Pacific Biosciences公司最新推出的第三代单分子测序技术进行了测序，直接得到的3条scaffold，而且通过三代测序结果的进一步分析，认为这3条scaffold其中一条3.8Mb是环形基因组，而另外两个是167 Kb和47 Kb的质粒。第三代测序技术同时还可以得到整个基因组核酸被修饰的情况，通过分析测得整个基因组中含有6-mA修饰位点9459个，4-mC修饰位点4336个，并精确确定被修饰碱基的位置。
  • 摘要：本研究应用RNA测序技术，尝试通过全面获取黄曲霉对5-AC应答的转录组信息，期望对5-AC作用机理能有更深入的理解。在5-AC处理和非处理两个样品中，总共获得近5G的测序数据，其中近89.95%可以匹配到黄曲霉基因组上。分析结果发现，5-AC处理后的黄曲霉，仅有240个基因发生了显著差异表达(q值<0.05)，其中114个基因发生表达上调，116个基因发生表达下称显著差异表达的基因主要涉及丝氨酸蛋白酶的活性。在黄曲霉的55个次级代谢基因簇中，仅有编码一种非核糖体多肚的第35个基因簇的表达受到5-AC的显著影响。在AF生物合成基因簇的34个基因中，有超过四分之三的基因在5-AC处理之后发生了不同程度的表达下调。此外，其他次生代谢基因簇中多个基因也发生了不同程度的改变。多个涉及真菌发育的基因的表达也发生了显著的改变，包括编码veA蛋白的veA基因，这一蛋白在负责真菌次生代谢和生长发育共调控机制的三聚体蛋白velvet复合物Ve1B/VeA/LaeA中起着连接另外两个蛋白的作用。推测，5-AC可能通过某种机制，抑制了VeA的表达，使黄曲霉体内VeA蛋白浓度降低，减弱甚至阻断Ve1B和LaeA蛋白之间的连接，从而使黄曲霉的生长发育和次级代谢出现紊乱，诱导其产生白色绒毛状表型，并抑制AF的生物合成。与此同时，利用该RNA测序数据，完善了黄曲霉基因组注释，并发现了黄曲霉中的选择性剪接现象。
  • 摘要：针对高通量测序背景下微生物基因组gap closing过程，在Cytoscap。软件中开发了一个名为ContigScape的可视化插件工具。目的是把contigs之间的连接关系图示化，而不是用列表的方式线性化显示。由于repeat contig的存在，基因组contig之间真实的关系应该是网络状的，所以任何线性的表示方法都会丢失信息。这个工具基于开源软件CytoScape设计，界面简单，可直接处理454 Newbler拼装产生的ace文件，Illumina测序系统产生的mate-pair数据，或者由其他数据整理而成“CRS”格式文件。其优点在于强化contig的显示，尤其是可以正确显示基因组中重复片段的数目和连接关系，并能够预测基因组中的质粒，线性染色体的末端反向重复，以及IS element,核糖体RNA等特殊的重复片段。
  • 摘要：猪链球菌(Streptococcus suis)是引起猪链球菌病的病原菌。在已知的33种血清型中,猪链球菌2型(S.suis serotype2,SS2)的流行范围最广,毒力最强,并且可以导致特定人群的感染,引起脑膜炎、败血症、严重的中毒性休克甚至死亡。SS2的sntA基因编码一种含LPXTG基序的功能未知的细菌表面蛋白，在感染过程中和贫铁条件下均上调表达。运用酵母双杂交、Pull-down以及细胞内共定位等技术筛选并验证了SntA与宿主细胞的抗氧化蛋白AOP2的相互作用。进一步的生物学试验证实，SntA蛋白不仅可以抑制AOP2的抗氧化作用，而且还能与heme结合。同时在动物实验中发现，因为SntA蛋白的存在而使SS2在动物体内更容易存活，并且导致了SS2引发的细胞因子表达上升以及更加严重的脑组织损伤症状。因此，sntA的上调表达可能与SS2感染所引起的宿主氧化损伤有关。SntA与heme的结合或许是SS2从宿主体内获取螯合铁以适应贫铁环境的一种机制。综上，SntA很可能是猪链球菌的一种重要的毒力相关因子。
  • 摘要：核糖体再生因子在蛋白翻译过程中起重要作用，主要是在翻译终止后参与tRNA从核糖体上解离，使得核糖体得到重复利用。该基因的超表达可以提高蛋白产量，调节多种生理功能。链霉菌抗生素在野生菌中的合成表达往往较低，核糖体再生因子作为一个促进蛋白表达的基因，可以作为一个多效调控因子在抗生素合成过程中发挥作用。rn 鉴于抗肿瘤抗生素美达霉素产量较低，首先在美达霉素野生菌中克隆了核糖体再生因子，序列分析为一个新基因；构建了一个链霉菌超表达质粒，导入野生菌中，经LC/MSn检测发现核糖体再生因子的超表达导致美达霉素的合成水平提高三倍多，同时同一菌株中其它次生代谢产物的合成水平也有明显提高，表明这个基因在抗生素高产菌育种中的应用潜力。
  • 摘要：嗜碱微生物可以在高碱环境下生长，多数具有分泌碱性蛋白酶的能力，是碱性蛋白酶生产菌株筛选的重要资源。本研究对一株分离自新疆盐碱湖区的微生物进行菌株鉴定及初步的生理生化研究，发现:(1)这株细菌在常规放线菌培养基上生长较快，稳定期及不良环境下菌落由白色变为黄色，可能与次级代谢有关；(2)这株细菌在pH 10条件下呈现最快生长速率，且液体培养环境中可以调节培养基的酸碱度，使之处于碱性环境；(3)该菌最适合生长温度为37℃，但在低温(4℃)也可以较快地生长，显示一定耐冷特性；(4)利用添加NaCl(0.1-1M)的培养基中培养此菌，发现在含有0.5M以上NaCl培养基中还可以生长，对NaCl呈现中度耐受；(5)优化平板检测条件，发现此菌呈现碱性蛋白酶以及p-半乳糖昔酶活性；(6)培养基中添加酵母膏或NaCl有助于提高此菌的碱性蛋白酶的产生或活性；(5)扩增此菌的16SrRNA基因，经序列比对分析鉴定为一株氧化微杆菌。
  • 摘要：许多抗生素都由聚酮合酶(PKS)合成而来，类型ⅠPKS基因簇中通常含有一个类型II硫酷酶(TEⅡ)基因，对PKS合成起重要作用。本文以恰塔努加链霉菌中纳他霉素合成基因簇内ScnⅠ(TEⅡ)为研究对象，敲除scnⅠ基因导致纳他霉素的产量下降至野生株的40%左右，高表达scnⅠ基因对纳他霉素的产量影响不大；体外生化反应表明ScnⅠ可以将酞基载体蛋白(ACP)上的乙酞基(错误的合成砌块)水解除去，重生得到全辅基ACP。以上结果表明ScnⅠ的功能是:除去纳他霉素PKS合成过程中产生的错误合成砌块以保证整个合成过程的保真性。
  • 摘要：捕食线虫真菌是一类重要的微生物类群,它们能通过菌丝特化形成多种类型的捕食器官捕捉线虫。寡孢节丛孢是研究捕食线虫真菌和线虫相互作用的模式真菌,它在线虫的诱导下能形成三维菌网捕捉线虫。在前期的研究中，基于寡孢节丛孢的基因组、蛋白质组学和Real time PCR分析结果，首次提出了寡孢节丛孢捕器形成的假说。最近，通过同源重组技术对该假说中的部分基因进行了基因敲除和突变菌株的表型分析，这些基因编码的蛋白包括粘附相关蛋白、过氧化物酶体蛋白和信号途径相关蛋白等。研究的初步结果表明，这些蛋白的编码基因被敲除以后，突变株的表型发生了显著的变化，其中有些基因的突变菌株不再产生捕食器官，而有些基因的突变菌株产生更多的捕食器官，对线虫的捕食能力增强。
  • 摘要：利用己经建立的斜卧青霉高效遗传操作系统，构建了斜卧青霉450个转录调控因子的单基因缺失突变株库，在此基础上，采用高通量的表型筛查方法，从所构建的转录调控因子突变株库中，分别筛选出6株和10株纤维素利用能力下降或增强的转录调控因子缺失突变株，并构建了相应转录调控因子的回补菌株。通过对所构建菌株的表型及产纤维素酶特性的测定，以及利用基因组表达谱技术对突变株、野生菌株的mRNA群体间的差异表达分析，同时结合荧光定量PCR方法对基因差异表达的进一步验证，和染色质免疫共沉淀测序技术(ChIP-sect以及DNase Ⅰ印迹试验，研究所筛选的转录因子与DNA序列的相互作用，深入探究转录因子的结合靶点序列，进而构建木质纤维素基因表达的网络调控模型。
  • 摘要：为鉴定Myxococcus fulvus HW-1和Myxococcus xanthus DK1622中2个蛋白的NhaA功能，将MXAN_6055基因和MFUL_6055基因克隆到3个主要的nha基因(nhaA,nhaB和chaA)均缺失的E.coli KNabc中，发现2个同源基因均能回补E.coli KNabc一定的耐盐能力。对这2个同源基因进行经典的翻转膜实验，发现其钠离子转运活性非常低，结合Western blot的实验结果，推测这一结果是MXAN_6055基因和MFUL_6055基因在E.coliKNabc中表达水平过低造成的。荧光定量PCR实验显示，Na+可能对MXAN_6055/MFUL_6055基因的表达有诱导作用，但仍需进一步实验验证。另外，由于M.fulvus HW-1没有建立成熟的遗传操作体系，通过融合PCR技术，将MFUL_ 6055基因置换到了M.xanthus DK1622中，以对比分析该基因对粘细菌多细胞行为能力的影响。对该突变株的初步分析结果显示，MFUL_6055基因可能影响粘细菌的子实体形成能力。
  • 摘要：本文简述结合生物信息学和分子生物学实验技术建立的肺炎克雷伯菌比较基因组平台及其近期研究进展。首先，广泛收集了不同来源菌株，其次，通过MobilomeFINDER策略考察了36株菌染色体tRNA/tmRNA基因位点的外源DNA片段插入情况，发现了多个10~150kb大小的新基因组岛及新耐药质粒。基于tRIP-PCR普查结果，筛选出一株泛耐药的碳青霉烯酶产生菌Kpneumoniae HS11286进行了全基因组测序，并建立了该临床菌的遗传操作系统。提出对肺炎克雷伯菌可移动基因组的系统性研究将帮助人们更为深入地理解细菌遗传多样性、致病机理和耐药性传播机制。
  • 摘要：胸膜肺炎放线杆菌(APP)是巴斯德菌科放线杆菌属的一种猪呼吸道病原菌,引起猪的传染性胸膜肺炎,导致感染猪大量急性或慢性死亡,严重危害世界养猪业。2007年笔者采用Sanger测序法解析了APP血清3型中国分离株JL03的全基因组序列(2.24 Mb)，全面分析了该菌基因组的生物学特征。为了更好地揭示血清型多样性的遗传基础，用454测序平台对另外10个血清型的参考菌株的基因组进行了测序，对现有的13个不同血清型的APP基因组序列进行了深入的比较基因组学分析，结果发现，APP的pan-genome由3303个基因(基因簇)组成，包括1709个核心基因组基因、822个分布式基因和722个菌株特异性基因。对核心基因组基因的分子进化特征的分析鉴定出359个基因发生了同源重组，50个基因受到正选择作用。进一步的比较基因组学分析，发现APP血清型多样性主要由荚膜多糖(CPS)合成基因簇的遗传多样性决定的，也与脂多糖O抗原基因簇的遗传多样性相关(可能是亚型相关)。根据CPS合成基因簇及外毒素基因的多样性，可以用多重PCR方法对15种血清型的菌株进行快速鉴定和分型，分子分型试剂盒正在研制之中。毒力多样性主要与外毒素基因簇等有关。
  • 摘要：Natrinema sp. J7-2是一种可以在不添加氨基酸的人工合成培养基上生长的极端嗜盐古生菌。本研究测定了该菌的全基因组，这是第一个完整测定基因组的Natrinema属菌株。在此基础上，利用该菌基因组信息，采用合成培养基对该菌进行培养实验，对其碳、氮源代谢途径和氨基酸合成途径进行了分析。结果表明，Natrinema sp. J7-2的基因组由一个3,697,626-by的染色体和一个95,989-by的质粒pJ7-I组成。Natrinema sp. J7-2可以利用葡萄糖、甘油或者乙酸作为唯一碳源进行生长，从它的基因组数据中也鉴定到了代谢和异生这些化合物的代谢途径。同时，重构了该菌20种氨基酸的合成途径，发现嗜盐古生菌的精氨酸合成途径和细菌的赖氨酸合成途径之间可能存在演化关系。利用合成培养基进行的生长实验和基因组分析显示，该菌具有利用钱盐和亚硝酸盐的能力和途径。但是，Natrinema sp. T7-2不能利用硝酸盐作为唯一氮源生长，在其基因组中也没有找到利用硝酸盐的相关基因。同时，该菌具有一个不完整的反硝化作用途径，可以将亚硝酸还原为N20。此外，还利用比较基因组的方法对己知的嗜盐古生菌基因组进行了分析。结果显示，嗜盐古生菌主要利用TrkAH系统来摄取钾离子，而Kdp系统可能只是在低浓度钾离子条件下主动转运胞外的钾离子到胞内。Natrinema sp. J7-2基因组含有三个CRISPR结构，其中之一位于一个整合子之中，可能通过水平基因转移在不同物种间转移。还对已测定基因组的嗜盐古生菌进行了基因组系统进化分析，为全面了解嗜盐古生菌或其基因的垂直和非垂直进化提供了新线索。rn Natrinema sp. J7-2具有Tat及Sec分泌系统，含有可预测的139个Tat底物和172个Sec底物。对Natrinema sp. J7-2培养物胞外及膜组分进行了分析。结果表明，真正分泌并释放到培养基中的胞外蛋白数量有限，该菌株Tat系统主要用于分泌锚定于膜上的脂蛋白，而Sec系统主要用于转运膜蛋白。
  • 摘要：许多由聚酮合酶(PKS)合成的微生物次级代谢产物被应用于药物、农药和食品添加剂领域,磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPTase)负责催化PKS中酰基载体蛋白(ACP)的辅基化,即转移辅酶A中的磷酸泛酰巯基乙胺基到ACP上。rn 纳他霉素是一种多烯大环内醋类抗真菌抗生素，工业菌株恰塔努加链霉菌L10的基因组中除了负责合成纳他霉素的scn PKS以外，还含有簇(scm PKS, PKSⅠa. scw PKS和PKSⅡc)，以及2个PPTasePKS基因(SchPPr和SchACPS)。体外生化表征结果表明:SchPPT可以催化scn PKS、scmPKS、PKSⅠa, scw PKS和PKSⅡc，SchACPS可以催化scw PKS, PKSⅡc和脂肪酸合酶(FAS)；缺失掉SchPPT的N-端或者突变掉镁离子结合位点(D105和EI07)都导致SchPPT活性的丧失；将SchPPT的N-端融合到SchACPS上没有改变SchACPS对ACP底物的选择性。体内实验结果表明:SchPPT敲除株不能生产纳他霉素但是仍然可以生产抱子色素。综上所述:SchPPT对类型ⅠPKS和类型ⅡPKS的都有选择性，SchACPS对类型ⅡPKS和FAS具有选择性;2)SchPPT的N-端和镁离子结合位点都对SchPPT的活性至关重要;3) SchPPT的C-端可能决定了SchPPT的底物选择性。
  • 摘要：微量热技术ITC是一个强大的分析工具，它可以测量任何两个生物分子间的亲和力和热力学，被认为是进行结合筛选的“金标准”。因为ITC能够检测出仅仅测量亲合力的方法所错过的重要信息，使得它在检测结构活性关系(SAR)的研究扮演着至关重要的角色。微量热技术DSC主要用于表征生物大分子，如蛋白质的稳定性和折叠。当配体优先地结合自然形式的蛋白质，说明蛋白质是稳定的，其蛋白质-配体复合物的Tm是高于在没有配体蛋白的；如果配体优先结合的是变性蛋白，则Tm降低。差示扫描量热法(DSC)也是用来测量相互作用的结合常数。对于配体结合常数高达到1020M-1的紧密结合，是无法通过其他方法来测量，采用DSC确实是一种快捷、方便的测试工具。
  • 摘要：基因组光学图谱是利用光学成像方法，不依赖于测序技术、快速生成全基因组限制性内切酶酶切位点图谱的新技术。光学图谱技术操作流程直观、高效，提供了从菌株或混合样品中了解细菌、酵母或真菌基因组结构的方法。国内外的研究人员在不需扩增、PCR反应、构建克隆或末端配对文库、纯化培养或特异性基因组纯化试剂等前提下，己利用基因组光学图谱技术对微生物基因组的结构、功能、多样性以及遗传学特性等进行众多的研究。在光学图谱分析软件的辅助下，研究人员可利用基因组光学图谱进行如下应用:通过与参照菌株基因组光学图谱的比对可进行菌株鉴定；通过对基因组光学图谱的比对快速揭示基因组间的相似和差异性；通过基因组光学图谱的比对找出基因组上的插入、缺失、遗传修饰和致病基因岛等移动元原件；通过对基因组光学图谱的比对，鉴定、找到染色体上inversion. translocation等测序方法不易鉴别的结构变化；还可将微生物测序数据以基因组光学图谱为参照，进行快速、准确的排序，完成全基因组测序结果的拼接以及对以往基因组测序结果进行完善和验证；现今，通过大基因组软件基因组光学图谱也可用来辅助高等动植物等大基因组的高通量测序结果拼接及验证。
  • 摘要：本研究中通过高通量测序组装得到39.9 Mb灵芝基因组，对全部12080条蛋白编码序列进行功能注释，发现了重要功能产物灵芝酸(ganoderic acids ,GAs)相关合成酶中存在一个融合基因，N和C端和两种不同的酶分别具有同源性。而通过对碳水化合物水解酶分析，显示其含有木质素降解相关酶，如:锰过氧化物酶、LiP酶、漆酶等。
  • 摘要：本文从深圳福田红树林自然保护区土壤样品中分离纯化获得一株高酷酶活性的菌株，通过形态学和分子生物学初步鉴定该菌株为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，命名为Bacillus sp.W77。为了获得菌株的酯酶基因，本研究通过pUC18质粒载体构建了较为完整的基因文库，通过酯酶的选择培养基初步筛选具有酯酶活性的转化子，发现在阳性克隆子中有7个产酯酶的阳性克隆子，本文选取了一个产水解圈最大且最快的克隆子pUC 18E 1-2进行测序研究，提交pUC 18E1-2的测序结果到GenBank，用ORF Finder查找测序结果的开放阅读框架。发现它含有一个比较大的开放读码框(ORF)，经测序比对，该片段内含一个由1470bp的片段，编码489个氨基酸，G+C含量49.5%，预测等电点为4.96，预测编码产物分子量约为54 kDa。同源性分析表明，该ORF与Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168所产的对硝基苯酯酶有一定的同源性，该序列己经提交GenBank，登录号为JQ7017000。
  • 摘要：作为一种非传统型酵母，树干毕赤酵母因其宽广的碳源代谢能力而成为纤维素乙醇的潜在生产菌。为了更好的从系统层次理解从数据库中下载己公布的S.stipitis全基因组序列，采用自行编写的基于Matlab的程序，通过比较基因组学(Blastp)和KAAS的研究方法，整合生化数据库和文献组学的数据，构建具有基因-蛋白质-反应(gene-protein-reaction)关联的基因组规模代谢网络模型iTL885。所构建的模型包括1240个反应、870个代谢物和885个基因，分布在4个亚细胞系统。注释具有代谢功能的基因占全部基因的13.2%。借助这一模型，深入解析了树干毕赤酵母的生理特性:(1)注释获得了49个糖转运子，阐释了S.StipitiS高效利用不同碳源的分子机制；(2)获得了以葡萄糖为碳源时的最小基因集合(110个必需基因和158个必需生化反应)；(3)结合不同碳源(葡萄糖和木糖)的转录组数据，解析了制约乙醇和琥珀酸高效合成的限速步骤；(4)模拟了利用木糖发酵生长乙醇和乳酸，鉴定了潜在的基因敲除靶点来提高目的产物的产量。本研究所构建的S.stipitis的代谢网络模型不仅在一定程度上阐述生理代谢特点，指导代谢工程改造等，更为系统整合分析蛋白质组、转录组、代谢组和文献组等各种组学数据提供了有效的平台。
  • 摘要：本研究首先应用Solexa测序技术，利用paired-end结合mate-pair的方法及SOAPdenovo组装软件对该菌株进行全基因组测序和拼接，其全基因组大小为45.70MB，GC含量36.99%。通过基因预测软件测得基因17676个，与各数据库比对，共注释基因13243个。经进化树分析与同源基因的比较发现，华根霉基因组与目前己完成基因组测序的仅有的三株接合菌之间存在较为显著的差异，序列相似性普遍偏低，但同源基因的相似性大多在60%左右。基因功能和代谢网络分析表明，60%以上的功能基因主要与遗传信息、能量代谢等维持正常生长发育相关；在次级代谢方面，具较强的生物异源物质降解能力。在全基因组数据基础上，针对目前所报道的主要真菌毒素，从合成代谢途径及关键基因的角度，分析考察了华根霉(及其内共生菌)合成主要真菌毒素的潜在可能性。根霉毒素(根霉素与小抱根霉素)及其他主要丝状真菌毒素，主要合成代谢途径包括PKS.NRPS与PKS-NRPS混合代谢途径，菇类化合物代谢及其他代谢途径。在华根霉中仅存在较少PKS聚酮合成途径基因，不存在非核糖体多肤途径NRPS大环肽类结构物质合成的相关基因。测序数据分析表明华根霉中可能存在的内共生菌也与报道的根霉真菌毒素产生菌—Burkholderia菌存在较大差异。结果表明，华根霉不具备产目前己知的主要真菌毒素的关键基因与能力，其发酵产品是安全的，而且对一些具有毒性或抑菌作用的萜烯类、芳香类等化合物具有降解功能，是发酵工业应用中相对安全的生产菌。
  • 摘要：本实验室以前期对维生素C工业生产菌株K vulgare WSH001 和B.megaterium WSH002全基因组序列进行了测序和基因组分析。以此为基础，结合文献信息和公共数据库，分别构建了两菌的基因组规模代谢网络模型iWZ633和iMZ992。通过必需反应分析发现在合成培养基下小菌不能够自身合成半胱氨酸和泛酸，以至于体内辅酶A水平很低，可能严重影响其生长。同时流量平衡分析模型iMZ992预测大菌在基础培养基上能够合成并转运到大量代谢物到胞外，包括鸟嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤、烟酸、泛酸和8种氨基酸。这些物质均己报道对小菌的生长和产酸有不同的促进作用。两菌的GSMMs对分析两菌各自的生理代谢特性提供了一个重要的平台。另外，在此基础上整合两菌GSMMs，构建了基因组规模的两菌系统代谢模型iWZ-Kvu-663-Bme-992。该系统模型可用于分析两菌代谢基因对小菌生长的影响，两菌共培养时代谢流分布，其他组学数据的整合等。
  • 摘要：经过多年的研究，链霉菌遗传学己经取得了长足的发展，解析了大量基因的功能，但是在以研究蛋白质相互作用及蛋白质-DNA相互作用为基础的细胞内信号传导方面报道不多。本课题组以整合型启动子探针质粒pIJ8660为骨架，将EGFP编码序列改为多克隆位点，并在其前端插入了组成型强启动子ermEp*，以此为基础，通过密码子优化，将3FLAG, 3HA, 13Myc, 3Strep tagⅡ, 18His等标签蛋白编码序列分别插入到启动子下游，构建了一系列含单个标签或者两个标签的表达载体，并以天蓝色链霉菌中ECFσ因子SigT为模型，成功实现了表达。该系列载体的构建，为研究体内蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用打下了基础，并为在蛋白质组、基因组水平上通过串联亲和纯化(TAP)、ChIP-Seq方法筛选相关调控元件与调控靶点提供了有力工具。
  • 摘要：甘油酸激酶以甘油酸为底物，催化生成2-磷酸甘油酸或3-磷酸甘油酸。至今己有数种甘油酸激酶在真核生物、细菌以及古细菌中报道。甘油酸激酶在生物体内具有重要的生理功能，根据序列特征，可将其分为三个家族。利用甘油酸激酶的催化性质，可以在生物工程领域制备有机化合物磷酸甘油酸，其中古菌甘油酸激酶因为其独特的底物特异性、嗜热与热稳定性以及较高的催化效率具有良好的应用前景。本文从酶的来源、催化活性、结构特征、分类、生理功能以及应用等方面对甘油酸激酶的研究概况做了综述，并对进一步的研究方向进行了展望。
  • 摘要：海洋放线菌不仅可产生多种新颖的天然产物，而且还是很多工业酶的生产菌，但目前对海洋放线菌来源的纤维素降解酶研究还比较少。本研究前期分离鉴定了一株新的海洋放线菌，命名为星海链霉菌，并进行了全基因组测序。基因组序列分析结果表明，该菌种含有4个大的降解纤维素的基因簇，每个基因簇中都包含10个以上基因，且都存在木聚糖酶基因，以及纤维素的膜结合或转运蛋白基因，同时包含一些配糖的水解酶类，半乳糖普酶，β-N-乙酞氨基己糖苷酶，α-N-阿拉伯呋喃糖酶等，另外，还发现数个零散的纤维素酶基因，也有的基因以纤维素酶及纤维二糖水解酶复合物的形式存在，少数周边存在调控基因以及转运蛋白。进一步分析发现18个和降解纤维素相关糖昔水解酶的基因编码序列，其表达产物分属于GH5，GH6，GH9，GH12，GH 16，GH48家族，其中一些水解酶不但具有信号肤而进行胞外的分泌，而且有的具有纤维素底物结合结构域与之相连，推测这些糖苷水解酶可协同作用，降解纤维质底物用来维持菌体的代谢生长。选定基因Gene-1721作为研究对象，其编码的蛋白(S187-GHS)和己经解析出的嗜热放线菌Thermobifida Fusca内切纤维素酶(Endoglucanase Cel5a)晶体结构(PDB:2CKS)具有63%的相似性，推测此蛋白序列由单独的α/β桶状催化结构域构成，不具有纤维素结合结构域。以pET28a为载体对该基因进行表达，发现以E. coli BL21(DE3)为宿主菌时，蛋白表达提前终止于18.5KDa，序列分析发现，Arg149的密码子是AGG，为E.coli的稀有密码子，推测由于该密码子的存在提前终止了翻译。更换宿主菌为E.coli Rosetta 2(DE3)，在SmM IPTG诱导条件下实现了可溶性表达，SDS-PAGE分析表明表达产物分子量约为36KDa，后续酶学性质分析正在进行中。
  • 摘要：自噬是维持细胞正常分化和发育过程中非常保守的胞内物质降解回收途径。昆虫病原真菌在体壁寡营养条件下萌发是建立其有效侵染的重要环节。本研究分离了昆虫病原真菌球抱白僵菌的自噬相关基因BbATG5，并研究该基因在菌株生长发育致病过程中的功能。通过比对发现基因BbATG5与真菌中同类基因具有高度的同源性。本研究使用同源重组技术构建了该基因缺失的敲除菌株。自噬体荧光染色观察标明真菌不能有效形成自噬体，其自噬途径被阻断。流式细胞术分析显示自噬基因的缺失可使真菌分生抱子形态发育失常，导致分生抱子群体均质性下降20%左右。生物学表型测定显示基因BbATG5敲除菌株表现出分生抱子和芽生抱子的产量下降、分生抱子在寡营养条件下萌发率降低以及对寄主的毒力下降。所有这些由基因敲除引起非正常表型，均可以由重组完整BbATGS基因得以回复。这表明敲除基因BbATG5可以引起野生菌株表型发生异常变化。这些结果证明菌体自噬途径参与真菌生长发育，从而对虫生真菌的致病力起到很重要的作用。
  • 摘要：粘球菌以复杂的子实体发育行为而著称，粘球菌的这一复杂的子实体发育行为与双组份系统紧密相关。孤儿双组份系统应答调控蛋白DidR，N端含有DNA结合结构域，C端含有信号接收结构域，该蛋白在粘球菌的子实体发育过程中发挥重要作用。DidR蛋白缺失后，菌株△MXAN1093表现出特殊的发育性状:饥饿条件下菌体早期能够聚集成不典型的子实体，但无法生成抗逆性孢子。△MXAN1093与DK1622的共发育表明didR缺失菌株的发育缺陷与胞外信号无关。与敲除菌株△MXAN1093不同的是，磷酸化定点突变菌株D128N的S运动降低，胞外多糖EPS产量降低，发育早期聚集缓慢，无法生成抗逆性孢子。磷酸化定点突变菌株D128N能够模拟蛋白非磷酸化形式的功能，D128N与△MXAN1093的差异表明DidR的磷酸化形式和非磷酸化形式在子实体发育过程中均发挥重要作用。D128N的EPS产量降低为野生菌株的52%，这表明DidR的非磷酸化形式具有抑制EPS的功能。D128N在发育早期的聚集迟缓，而△MXAN1093早期聚集正常，D128N和△MXAN1093的生孢能力均降低，这表明DidR在发育早期的聚集过程和发育后期的生抱过程均发挥与重要作用。
  • 摘要：本文对BrlA基因参与斜卧青霉孢子发生和胞外糖苷水解酶的分泌的功能进行了研究。研究结果表明:(1) brlA基因参与了斜卧青霉抱子发生:brlA的缺失阻碍了菌丝末端帚状分支的形成，无分生孢子的生成，菌落由绿色变为白色，其菌丝分支单位长度(Lhgu，mm/tip)由野生株的50.7 mm/tip下降为24.2 mm/tip，显示其菌丝分支增加。(2)荧光定量PCR和胞外蛋白质SDS-PAGE分析表明，brlA基因的缺失导致葡萄糖淀粉酶蛋白的显著表达和多种胞外蛋白表达的上调，至少包含有3种主要的纤维素外切酶(CBHⅠA，CBHⅠB和CBHⅡ)、两种主要的纤维素内切酶(EGⅠ和EGⅡ)、两种主要的木聚糖酶、两种几丁质酶、一种淀粉酶、一种半乳糖苷酶和一种阿拉伯呋喃糖酶。发酵4天后，在brlA缺失株中，葡萄糖淀粉酶蛋白、CBHⅠB, CBHⅡ, EGⅠ和EGⅡ的基因的表达量较野生株分别上调2.55、2.29、1.68、2.88和2.37倍。同时，对敲除株胞外酶活力的测定结果也显示了纤维素酶活力的上升。(3)brlA的缺失带来了两种主要胞外蛋白酶(中性蛋白酶和酸性蛋白酶)表达的大幅下调，发酵3天后，中性蛋白酶基因和酸性蛋白酶基因在brlA缺失株中的表达仅分别为野生株的2.1/100和56/100。(4)brlA基因参与了多个次级代谢基因簇的上调或下调。
  • 摘要：为了尽可能系统全面地挖掘S.malaysiensis LZ35的次级代谢资源，开展了以下几方面工作:1.连续敲除野生型中高产化合物geldanamycin,nigericin,elaiophylin的合成基因簇，为其它微量成分的分离创造较低的化合物背景；2.扩大发酵规模，增加微量化合物的分离机会；3.通过组成型表达可能的正调控基因如LAL.SARP或/和敲除可能的负调控基因如tetR等尝试激活沉默基因簇；4.使用组成型启动子如ermE*对PKS操纵子进行启动子替换。截止目前，从LZ35中分离鉴定了11类次级代谢产物(Fig 1.)，包括安莎、聚醚、二萜、对三联苯、二重内酯和多烯等多种结构类型，其中部分产物的生物合成工作正在开展中。

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