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第九届海内外生命科学论坛

第九届海内外生命科学论坛

  • 召开年：2006
  • 召开地：北京
  • 出版时间： 2006-09-25

主办单位：军事医学科学院

会议文集：第九届海内外生命科学论坛会议论文集重要病毒性传染病的相关基础研究

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  • 摘要：以质粒pSilencer2.1-U6 Hygro为基础,设计并构建了针对狂犬病病毒(RV)糖蛋白和核蛋白mRNA的共9个siRNA表达载体,转染BHK-21细胞系后,在潮霉素-B的筛选压力下,获得9个稳定转录相关siRNA的BHK-21细胞株.1000TCID50的RV分别感染24孔板内的上述9株细胞,48h后以直接免疫荧光法检测各株细胞上RV的增殖,结果显示,RV增殖水平最低者为对照细胞的1％,即RNA干扰效应最高可阻断99％RV的感染.针对其中阻断水平超过90％的靶序列G69和N19,人工合成其双链siRNA,瞬时转染BHK-21细胞后,仍可达到80％以上的感染阻断率.针对靶序列G69的siRNA表达质粒300ug肌注小鼠后肢,再以350 LD50狂犬病病毒同部位注射攻毒,保护率为80％.本试验为有效阻断RV早期感染提供了新选择,为通过RNAi研究RV的基因组功能奠定了基础.
  • 摘要：本研究利用原核表达系统和杆状病毒表达系统分别表达了亨得拉和尼帕病毒核蛋白(N),以此免疫Balb/C小鼠,成功地制备了4株N蛋白单抗(2株抗NiV和2株抗HeV).Western Blot及间接免疫荧光检测表明4株单抗对2种病毒的N蛋白具有较强的交叉反应性,说明它们识别2种病毒上共同的抗原表位.随后,利用随机肽库技术和分段表达的N蛋白重叠多肽对4株单抗进行识别表位鉴定.结果发现了2个新的线性表位.它们的序列分别是KLxR,FxxEM,分别位于N蛋白的17～20 aa和446～450 aa.表位序列在2种病毒间高度保守,说明是他们的共同表位.本研究为更好地了解亨尼帕病毒核蛋白的抗原结构和制备有效的免疫检测试剂打下了基础.
  • 摘要：目的:了解河南省HIV耐药性毒株的进化演变规律.方法:将河南省南部某乡74名接受AZT+ddI+NVP联合抗病毒治疗的艾滋病患者纳入研究队列,分别在抗病毒治疗后3个月、6个月、12个月、18个月进行随访调查,通过逐一访谈了解一般情况、服药方案、服药依从性及保障措施、抗病毒治疗前后的临床表现等,同时采集14 ml EDTA抗凝静脉血,检测CD4/CD8细胞数、病毒载量及基因型耐药性.结果:核苷类逆转录酶抑制剂中,发生频率最高的耐药突变位点是:67、118、151和215.治疗3个月、6个月、12个月、18个月时AZT耐药发生率分别为6.76％、13.51％、14.86％和9.46％,ddI的耐药发生率分别为2.70％、6.76％、8.11％和5.45％,AZT的耐药发生率高于ddI,核苷类逆转录酶抑制剂的耐药性呈现出先上升后下降的趋势;非核苷类逆转录酶抑制剂的耐药发生率高于核苷类逆转录酶抑制剂,发生频率最高的耐药突变位点是:103和181.治疗3个月、6个月、12个月、18个月时,NVP耐药发生率分别为9.46％、18.92％、22.97％和32.43％,非核苷类逆转录酶抑制剂呈现出持续上升的耐药发生趋势.耐药和不耐药患者的病毒载量和CD4+T淋巴细胞计数没有显著性差异.服药依从性差可能是耐药发生的主要影响因素.结论:河南服药人群已经大量出现了对非核苷类逆转录酶抑制剂的高度耐药,服药依从性是耐药发生的主要影响因素.应及时为耐药患者更换治疗方案,并加强服药的监督管理.
  • 摘要：引发SARS世界流行的人类SARS病毒的起源问题一直受到广泛关注,本研究目的在于应用适应性进化研究方法来研究人类SARS病毒的起源问题,通过对SARS病毒Spike蛋白和N蛋白正选择位点的研究,来检验果子狸是否是人类SARS病毒的天然宿主.对人类SARS病毒Spike蛋白的研究发现3个正选择氨基酸,N蛋白发现1个正选择氨基酸,这些正选择氨基酸只出现在SARS病毒感染人类的早期病例中,而在中晚期病例都被选择掉了,因而可以看成是SARS病毒刚进入人体时的标志性氨基酸;其中而Spike蛋白75R和N蛋白25Ⅰ在果子狸SARS样病毒中没有出现,提示最初感染人类的SARS病毒可能不是直接来源于果子狸.同时果子狸SARS样病毒的Spike蛋白正选择压力位点与人类SARS病毒显著不同,提示果子狸的SARS样病毒在果子狸体内具有与人类完全不同的适应过程,它对于果子狸也可能是一种新感染病毒,因而不是SARS病毒的天然宿主.此适应性进化的研究结果支持2003/2004年SARS病例不是来源于人类SARS病毒的感染,而是由果子狸SARS样病毒感染而来的结论,也验证了通过本研究方法分析确定的正选择位点的正确性.上述研究表明:果子狸可能不是人类SARS病毒的天然宿主,但可以是中间宿主或保存宿主.
  • 摘要：HCV核心蛋白在HCV致癌过程中具有重要意义.本研究利用抑制性消减杂交方法和RT-PCR方法筛选并检测了稳定表达全长核心蛋白的L02细胞与正常L02细胞之间差异表达的基因,经过生物信息学分析,共获得了46个已知基因序列和8个未知功能基因序列.这些差异表达基因基本可以归为六类,分别为与细胞迁移、细胞增殖、物质运输、信号转导、细胞代谢和抗氧化反应有关的基因,表明核心蛋白的致癌作用于这六方面有密切关系.
  • 摘要：根据口蹄疫病毒(FMDV)基因组的结构特点以及Genebank上公布的FMDV全序列,用DNAMAN分别设计了涵盖整个基因组序列的3对引物,从接种口蹄疫病毒WFL株的细胞培养液中提取了病毒基因组RNA,采用RT-PCR方法和RACE法分别扩增了3条基因片段,并将扩增片段分别与T载体连接,在体外分别进行了5'半分子和3'半分子的构建.最后将5'半分子和3'半分子连接成基因组全长cDNA分子.经PCR鉴定、酶切鉴定及全长cDNA测序,证实成功构建了口蹄疫病毒WFL株基因组全长cDNA分子.序列分析结果表明,供试FMDV基因组全长为8155nt,5'UTR长1059nt;具有一个大的读码框,其核苷酸长度为6969nt,包括201aa的前导蛋白基因和2122aa的聚合蛋白基因;3'UTR长127nt,包括34nt的poly(A).
  • 摘要：目的:本研究通过筛选丙型肝炎病毒第一高变区(HVR1)序列,组成多靶点抗原组合,分析HCV患者体内HVR1抗体的异质性,并对其临床初步应用进行评价.方法:采用生物信息学对现有HVR1序列筛选,并进一步克隆表达,用间接ELISA法研究上述HVR1抗原对HCV阳性血清的交叉反应性,挑选多靶点HVR1抗原组合,并进行临床初步应用.结果:确立了由17条具有株特异性重组HVR1作为多靶点抗原组合,92.68％的慢性患者血清与多靶点抗原具有高交叉反应性,HVR1抗体异质程度高;而急性患者血清仅有39.29％,两者差异显著(P＜0.05).结论:HVR1抗体的多靶点检测对确定HCV感染疾病急性、慢性分期具有一定的意义.
  • 摘要：丙型肝炎病毒是引起慢性肝脏疾病的主要病原,亟需发展一种有效的药物或疫苗,但由于病毒高度变异性等因素,HCV疫苗研究成为当今生命科学研究中的难题.本研究在以往研究的基础上,通过大量的文献和网上有关数据库检索,在HCV基因较保守的区段,选出了多段T细胞表位较密集的片段,加以连接组合,获得了具有HLA-A1,A2,A3,A24,B7和HLA-DR等多种表位的嵌合基因(HCV-T),经克隆到原核表达载体pBVIL1获得HCV-T重组蛋白质免疫原;克隆到真核表达载体pcDNA3.1,并经鉴定证明在Sp2/0可有效表达,获得了符合要求的pcDNA/HCV-T质粒免疫原.以Balb/c小鼠为实验动物,随机分组免疫动物,结果证明两种免疫原均具有免疫原性.尤其重组HCV-T在和抗HCV-C单克隆抗体(抗免疫原中的一个片段)一起注射时,通过抗体的介导作用,可以有效地激发机体的细胞免疫(CTL)反应;以pcDNA/HCV-T质粒免疫原首次免疫后再以重组HCV-T加强免疫组,也可以有效激发免疫机体的细胞免疫反应.总之,成功获得了HCV多表位嵌合重组蛋白质免疫原和重组质粒免疫原,为进一步研究HCV疫苗奠定基础.
  • 摘要：目的：了解北京市近年来肾综合征出血热(HFRS)空间分布,初步探讨其发生的危险因素.方法：收集北京市2004年至2005年HFRS病例个案资料,分析HFRS的空间、人群、时间分布特征.以北京市乡镇级行政边界矢量图层为背景,根据患者的家庭住址,建立病人发病地点矢量图层;应用SaTScan 6.0软件,标化性别构成,对各乡镇HFRS的发病情况进行空间聚类分析,确定HFRS发生的高流行区域范围.在ENVI 4.0遥感影像处理软件和ArcGIS 9.0地理信息系统软件的支持下,从2005年6月2 3日的Land Sat 7 TM卫星影象图中建立北京市2005年土地利用图;建立北京市植被影像图.分别叠加北京市乡镇行政边界图层于土地利用图、植被影像图、高程图,提取各个乡镇各土地利用类型的面积、平均校正植被指数、平均海拔高度.在SPSS 13.0中分析发病乡镇与未发病乡镇间的各地理环境因素有无统计学差异.结果：北京市HFRS病例以朝阳区最多,各乡镇年均发病率从0至33/10万不等,差异有统计学意义(x2=831.62,P=0.000).人群发病以青壮年为主,占94.3％.职业分布处于前三位的是为农民、民工和工人.发病高峰在2月至6月,占总发病例的78％.空间聚类分析结果显示北京市HFRS病例成聚集性分布;高发聚集区包括36个乡镇;城乡结合部为HFRS的高发区域.发病乡镇与未发病乡镇的建筑面积比重、水域面积比重、林地面积比重、水田面积比重、海拔、校正植被指数间存在统计学差异,在旱地面积比重、果园面积比重、水浇地面积比重间没有统计学差异.结论：北京市HFRS发病空间分布呈聚集性,HFRS发病乡镇与未发病乡镇的地理环境因素存在差异,这为预防控制HFRS提供一定依据.
  • 摘要：目的:通过体外传代培养,将我国HIV-1药物敏感毒株诱导为拉米夫定耐药毒株.方法:在MT4细胞-中国HIV-1B'亚型CNHN24毒株培养系统中加入0.008 μ mol/L拉米夫定,逐渐增加药物浓度进行传代和培养,每隔3-5代测定半数抑制浓度IC50,并用RT-PCR法扩增pol区基因,进行基因型耐药性分析.将表型和基因型耐药结果与敏感株进行比较.结果:培养6代后,IC50由野生毒株的0.018μmol/L逐渐提高到0.15μmol/L;第7代时,IC50突然增加到大于2048μmol/L;pol区的184位氨基酸由甲硫氨酸(M)突变为异亮氨酸(Ⅰ).去除药物继续培养5代,IC50仍维持＞2048μmol/L,pol区184位氨基酸仍为异亮氨酸,没有发生回复突变.结论:在国内首次用中国HIV-1毒株诱导培育成功可稳定传代的3TC耐药株,可用于HIV-1耐药性的研究和HIV-1药物的药效学评价.
  • 摘要：针对我国口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)流行情况,利用计算机软件模拟分析,构建了口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)复合多表位基因工程疫苗表达盒OAAT.该表达盒以O型、A型FMDV结构蛋白VP1全基因和Asia1型FMDV两个基因拓扑型的结构蛋白VP1基因上的5个抗原表位基因(其中2个抗原表位来源于FMDVIND63/7株,该毒株与我国新疆分离株属于同一基因拓扑型,其余3个抗原表位来源于FMDV YNBS/58株)作为主要免疫原基因,以非结构蛋白上的2个Th2细胞表位基因及结构蛋白上的1个Th2细胞表位基因作为辅助基因.将构建好的表达盒OAAT和猪IL-18基因分别插入到鸡痘病毒表达载体pUTA-16-LacZ复合启动子(ATI-P7.5×20)和单一启动子(P7.5)下游,构建了携带OAAT表达盒和猪IL-18基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL-OAAT-IL18.应用脂质体转染法,将重组鸡痘病毒转移载体质粒与282E4株鸡痘病毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),经BrdU进行三次加压蚀斑筛选后,以不同代次的细胞mRNA为模板,利用FMDV VP1基因和猪IL-18基因特异引物进行RT-PCR和IFA检测,筛选出OAAT和猪IL-18基因共表达的重组鸡痘病毒rFPV-OAAT-IL18,该重组鸡痘病毒的构建为新型FMDV活载体疫苗的研究奠定了基础.
  • 摘要：采用RT-PCR技术扩增出汉坦病毒H8205株L、M、S基因序列,利用5'-RACE和3'-RACE扩增出基因的末端,将其分别克隆于pGEM-T Easy载体上进行序列测定,利用重叠片段拼装出汉坦病毒H8205株的基因组全序.结果表明所测汉坦病毒基因的L片段长度为6533bp,最大读码框架从37到6492,共编码2151个氨基酸;M片段长度为3615bp,最大读码框架从41到3446,共编码1135个氨基酸;S片段长度为1699bp,最大读码框架从37到1324,共编码429个氨基酸.利用DNAstar进行同源性比较,汉坦病毒H8205株的L基因与汉坦病毒不同株氨基酸同源性为68.6％～98.3％,M基因与同型汉坦病毒氨基酸同源性为85.2％～99.7％,S基因与同型汉坦病毒氨基酸同源性为97.2％～99.8％.绘出了3个片段的系统发生树,进行生物信息学分析,为研究汉坦病毒H8205毒株的生物学特性、分子机制等提供了基础.
  • 摘要：本研究首先利用寡聚核苷酸将登革1-4型病毒包膜蛋白Ⅲ区依次连接起来,并将串联基因产物插入pBAD/Topo ThioFusion原核载体进行表达.表达产物纯化后,以皮下途径免疫BALB/c小鼠,通过间接免疫荧光试验和中和试验表明,小鼠抗血清含有针对登革1、2和4型病毒的特异抗体,并且针对登革2型病毒的中和抗体效价可达1:25.利用登革1、2、3和4型病毒攻击后,分别有70％、70％、18％和70％的小鼠存活,而对照组分别仅有0、10％、9％和0的小鼠存活.研究结果表明,登革病毒包膜蛋白的串联Ⅲ区在小鼠中对登革1-4型病毒均具有保护作用.通过对其编码序列的进一步优化,串联Ⅲ区将是潜在的基于单一抗原的四价登革疫苗候选株.
  • 摘要：近年来,由动物传染给人的疾病突然增多起来,特别是禽流感、口蹄疫、非典、疯牛病、副粘病毒及多种虫媒病毒病等,疫情席卷而至,传播迅速、死亡率高、对人类健康造成严重威胁,给畜牧业生产和国内外贸易造成空前打击,给社会稳定带来极大损害.本文介绍了新发传染病出现并流行新特点和新出现及新发现的可跨种传播的人兽共患病毒病.
  • 摘要：SARS-CoV属于单股正链RNA病毒,其刺突蛋白S为其最重要的结构蛋白,参与病毒与细胞受体的结合以及入侵宿主细胞的膜融合过程,决定着病毒的组织嗜性和毒力.目前对SARS-CoV基因组中与毒力相关的位点大多为生物信息学预测,确切的毒力位点尚未得到实验验证.本研究首先运用生物信息学方法对BJ01株S蛋白的可能毒力相关位点进行了分析预测,通过对病毒亚克隆进行体外突变,构建了突变病毒全长cDNA;然后观察比较突变病毒的感染性与原型病毒的差异.结果显示,S蛋白上的受体结合位点(E452和D454)的突变明显降低了BJ01株病毒对Vero E6细胞的感染性,突变病毒的空斑滴度为2×102 PFU/ml,其感染性与原型株相比降低了3个数量级.本研究表明,SARS-CoVBJ01株S蛋白的受体结合位点与病毒的毒力及致病性密切相关,针对该部位的突变可显著影响病毒的感染性,这一结果为深入探索SARS-CoV的致病机制及设计抗病毒策略提供了理论依据.
  • 摘要：目的：确定我国大林姬鼠中是否存在Amur类汉坦病毒.方法：针对Amur类汉坦病毒M和S基因分别设计引物,从我国毗邻俄罗斯远东的吉林边境地区捕获的大林姬鼠肺组织标本中,用RT-PCR法扩增M和S基因部分片段,目的片段直接进行核苷酸序列测定,获得序列用BLAST,ClustalX 1.83和MEGA3.1软件进行同源性比对和系统发育分析.结果：从我国东北大林姬鼠肺标本JilinAP06中分别扩增出长度383nt(M基因)和350nt(S基因)大小的目的cDNA片段,JilinAP06 M片段序列两两比对结果显示:其与汉滩病毒原型株76-118同源性仅为83.7％,与最近从吉林地区大林姬鼠中分离获到的Cjilin93株同源性为80.8％;而与我国病人来源B78株同源性最高,为97.2％,其次为我国人源株H5,Liu和H8205,同源性为:96.3％-95.2％;另外与俄罗斯大林姬鼠源的Amur类病毒AP63和AP1168同源性约为92％.系统发育分析结果显示JilinAP06与Amur类汉坦病毒构成一个相对独立的分支.S基因片段的同源性比较和系统发育分析结果与基于M基因片段得到的结果一致.结论：我国大林姬鼠中存在Amur类病毒,并和俄罗斯远东地区Amur类病毒接近,很可能为我国Amur类病毒的自然宿主和人群Amur类病毒感染的重要来源.
  • 摘要：目的：2005年5月我国青海湖发生H5N1型禽流感,导致6 345只野生禽类死亡.一年后,对2 006年5月青海疫区内死亡的斑头雁等禽类样本进行实验室分离与鉴定,以探索禽流感病毒在野生禽类中的存亡规律、序列及致病性变化.方法：应用鸡胚接种、血细胞凝集、RT-PCR等实验技术分离、鉴定病原,应用接种收获的鸡胚尿囊液对SPF鸡及Balb/c小鼠进行致病性实验,并应用DNAstar MegAlign及GenBank Blaster对测得的病毒序列进行分析.结果：6份样本中分离得到4株病毒,经实验确定为高致病性H5N1禽流感病毒,病毒对小鼠也有极高致病性,感染动物死亡率为100％.病毒基因序列分析符合高致病性禽流感毒株特点.结论：H5N1毒株仍存在于青海湖迁徙的野生禽类中,野生禽类作为病毒的"传播器"需要有效监控,病毒对禽类及哺乳动物致病性需要进一步研究.
  • 摘要：本实验将进行分子设计的人免疫缺陷病毒(HIV-1)抗原基因MEGp24插入至鸡痘病毒(FPV)转移载体pUTA2复合启动子的下游,与构建的HIV-2鸡痘病毒转移载体pUTA2-gag-gp105连接,构建出2个启动子方向相反的鸡痘病毒转移载体,与鸡痘病毒282E4同源重组后筛选出一株共表达HIV-1 MEGP24与HIV-2 Gag-gp105抗原蛋白的rFPV,并进行了小鼠实验免疫研究,成功实现同时针对HIV-1和HIV-2两个亚型的HIV二价重组疫苗,为HIV疫苗研究提供了新的参考.
  • 摘要：目的:研究山东省SEO型汉坦病毒(Hantavirus,HV)最新的基因变异情况,探讨重组NP的抗原性.方法:从三份出血热病毒抗原阳性的鼠肺标本中RT-PCR扩增两个病毒株(ZB8和GM04-38株)的M片段和一个病毒株(JUN5-14株)的S片段.将PCR产物分别克隆测序.将获得的病毒序列与GenBank已有的SEO病毒序列进行同源性分析和系统发生树分析.并且将获得的S片段的NP基因在BHK21细胞中进行表达,间接免疫荧光法和免疫印记法观察NP的表达情况,并评价重组NP为抗原检测出血热病人血清中抗体的效果.结果:两株HVM片段与SEO病毒的核苷酸和氨基酸同源性分别在84.4～97.5％,96.9～99.7％之间,JUN5-14株S片段与SEO病毒的核苷酸和氨基酸同源性分别在87.5～97.8％,97.9～99.8％之间,系统发生分析显示三株山东SEO病毒株均为3亚型SEO型HV.NP在BHK21细胞中得到了高效表达,重组NP与病人血清具有良好的免疫反应性.结论:三株HV均为第3亚型SEO病毒,与非山东分离SEO病毒有一定的差异.重组JUN5-14株NP可以作为HV的血清学检测的良好的抗原.
  • 摘要：目的：制备登革2型病毒中国分离株(DEN2-43)的衣壳蛋白缺失突变病毒.方法：在DEN2-43株病毒感染性全长cDNA克隆的基础之上,利用融合PCR技术构建衣壳蛋白基因缺失的全长cDNA,将其线性化并体外转录成RNA后,经电穿孔法导入宿主细胞获得衣壳蛋白缺失突变病毒.结果：序列比对表明,所获得的恢复病毒带有与预期一致的缺失突变.结论：衣壳蛋白缺失突变病毒的制备,为进一步研究衣壳蛋白基因突变对登革病毒生物学特性的影响奠定了基础.
  • 摘要：为了解戊型肝炎病毒在我国鹿群和牛群中的流行情况,收集15个鹿场798份鹿血样和长春地区的牛血样80份,常规分离血清,采用北京万泰生物药业有限公司提供的抗HEV抗体酶联免疫试剂盒(双抗原夹心法),对血清样品进行抗HEV总抗体检测,用X2检验比较不同养殖场鹿血清HEV抗体阳性率的差异.调查发现,鹿血清总体抗体阳性率为43.61％.13个鹿场中有5个鹿场血清样品抗体呈现阳性,阳性率分别为48.02％、47.25％.牛血清抗体阳性率为20％.结果表明:我国鹿群,尤其是散养鹿群中普遍存在HEV的感染;牛群中也存在较高的HEV感染率.
  • 摘要：目的:从F基因的氨基酸序列上分析仙台病毒天津株的种系发生进化地位.方法:以仙台病毒天津株的基因组RNA为模板,根据GenBank中仙台病毒全基因组序列用GeneRunner设计出两对引物,通过RT-PCR方法扩增出包括F基因全长的两段首尾相连的序列,并进行测序,根据测序结果推导出F基因氨基酸序列,与GenBank中公布的15株仙台病毒相应序列进行同源性比较,并绘制系统发生树.结果:F基因核苷酸和氨基酸序列同源性分析表明,仙台病毒天津株与BB1株同源性最高,分别为94.5％和95.4％,与其他仙台病毒株相比较,核苷酸序列同源性在85.3％～90.5％,氨基酸序列同源性在90.4％～94.5％,均有较大差异.从系统发生树来看,仙台病毒天津株与BB1株亲缘关系比较接近,而与其他仙台病毒株距离比较远.结论:从F基因氨基酸序列分析来看,仙台病毒天津株很可能不属于Ohita株和Z株分别代表的两个进化分支,而是和BB1株一起属于独立于这两个分支之外的第三个分支.
  • 摘要：构建重组杆状病毒的转座质粒pFastBac-3AB,再将该重组质粒转化DH10 Bac感受态细菌,在体内进行重组,并经三重抗性与蓝白斑筛选,得到杆状病毒重组杆粒Bacmid-3AB;将Bacmid-3AB转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒.用重组杆状病毒表达的3AB蛋白为抗原建立鉴别口蹄疫感染与免疫动物的ELISA诊断方法,并对各种反应条件进行优化,包括抗原包被时间、包被浓度、封闭剂、酶标抗体工作浓度等,制定了检测抗体的间接ELISA操作程序,确定检测样品的临界值.

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