嗜热厌氧杆菌Ana.Pif1解旋酶核心结构域蛋白与DNA底物结合的反应特性

摘要

目的:探究嗜热厌氧杆菌的Ana.Pif1解旋酶核心结构域蛋白(Ana.Pif1-HD)与DNA底物结合的反应特性.方法:利用DNAman、CluxtalX等软件,对Ana.Pifl的核心结构域蛋白进行系统进化树分析与同源序列比对;Ana.Pif1-HD表达载体构建后转入大肠杆菌进行原核表达,并通过Ni-NTA、SUMO酶切、S200分子筛等层析柱纯化获得Ana.Pif1-HD蛋白;利用Stopped-flow FRET技术监测Ana.Pif1-HD蛋白的解旋活性,利用荧光偏振检测技术分析Ana.Pif1-HD与不同长度、不同结构DNA底物的结合反应各向异性值,并进行拟合分析与统计.结果:Ana.Pif1的核心结构域蛋白为靠近N-端的448氨基酸,通过原核表达与纯化获得纯度为97％、浓度为5 g/L的Ana.Pif1-HD蛋白,并利用Stopped-flow FRET与荧光偏振等技术验证其具有Ana.Pif1全长蛋白90％的解旋活性与95％的结合活性;Ana.Pif1-HD的最佳结合反应条件是42℃在pH 6.0含20 mmol/L NaCl及3 mmol/L MgCl2的溶液中进行;Ana.Pif1-HD与不同长度ssDNA底物结合时的解离速率常数递增,并明确其ss-DNA的binding-size为10.34 nt;研究首次揭示Ana.Pif1-HD与不同复制中间体DNA结合反应的底物特异性ss-G4 DNA＞ G4 DNA＞ 3'-ssDNA-dsDNA≈Y-型＞其它底物.结论:成功表达纯化具有全长活性的Ana.Pif1解旋酶核心结构域蛋白,首次揭示该解旋酶核心蛋白与各类不同DNA底物的结合反应特性.