利用CRISPR/Cas9系统构建低DCPC杂质含量的CPC工业高产菌种

摘要

以头孢菌素C(CPC)工业生产菌株顶头孢霉1-D1为研究对象,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术降低杂质脱乙酰头孢菌素C(DCPC)累积,提高CPC产量与质量。首先,构建了CPC乙酰水解酶敲除菌株Ac-ΔcahB以期减少CPC水解。然后通过导入含cefG基因表达盒的Donor DNA,构建Ac-ΔcahB::cefG菌株以期提高DCPC转化效率。通过摇瓶发酵验证表明Ac-ΔcahB效价没有提高但杂质含量略有下降,而Ac-ΔcahB::cefG不仅产量比对照提高约32.6%,达6072μg/mL,而且DCPC杂质含量(DCPC峰面积/CPC峰面积)显著降低到6.81%。从cefG转录水平来看,Ac-ΔcahB::cefG菌株在96 h转录量提高了5倍。可以发现,cefG基因在强启动子PgpdA作用下可提高表达量,促进DCPC转化,从而提高CPC产量。此外,在工业顶头孢霉中,结合Donor DNA共同作用的CRISPR/Cas9系统是一个更为高效的基因编辑方法。