利用CRISPR/Cas9系统构建基因编辑猴及CRISPR/Cas9系统应用优化

摘要

当前医学及生命科学研究中，动物模型是不可或缺的组成部分。生命科学研究中每一种模式动物研究的突破，为遗传学、分子生物学、发育生物学等研究领域带来了突破式的进展。随着科学研究的不断深入，人类对复杂生命现象的不断探索，以及人类面临的重大疾病（癌症，艾滋病，心脑血管疾病，神经性疾病等）的威胁，低等的动物模型已无法满足复杂的科学研究以及模拟人类重大疾病的需求。非人灵长类动物作为人类的近亲，具有与人类相似的免疫系统、神经系统以及代谢系统，是最理想的甚至是唯一的模型动物。许多灵长类动物的研究成果可直接应用于人类疾病的预测、预防、诊断和治疗，而这些方面一直是人类健康领域关注的焦点。目前，非人灵长类动物模型构建一直受到编辑效率低、操作困难等限制，这些困难成为制约非人灵长类动物模型研究的瓶颈。
　　近年来，基因编辑技术领域发展迅速，新型基因编辑工具不断被开发，尤其是CRISPR/Cas9基因编辑系统的出现，使基因编辑技术进入了新的时代。目前基因工程定点基因编辑工具中，可设计目标序列的定点核酸内切酶主要有三种，即:ZFN（锌指核酸酶），TALEN（转录激活子样效应因子核酸酶）和CRISPR/Cas9（规律成簇的间隔短回文重复/CRISPR相关蛋白9）系统。其中CRISPR/Cas9系统，以其设计构建方便，敲除效率高，应用范围广等优势，被广泛应用于基因编辑研究中。因此，对CRISPR/Cas9技术的改造优化，并将其运用于构建非人灵长类动物基因编辑模型是生命科学所迫切需要的研究内容。
　　本文综合运用CRISPR/Cas9基因编辑系统，针对Nr0b1，Pparg-γ，Rag1三个基因共设计5个sgRNA，其中Nr0b1与早期性腺发育相关，Pparg-γ与脂肪代谢相关，Rag1与免疫系统相关。通过对食蟹猴受精卵一细胞时期显微注射Cas9 mRNA与sgRNA的混合体系，移植入代孕猴，成功构建定点基因敲除猴。通过对流产猴配子的基因鉴定，确认CRISPR/Cas9引入的基因编辑可以传递于配子，提示该基因编辑可以传递给子代。接着，针对食蟹猴Oct4（Pou5f1）基因3'UTR区设计sgRNA，并构建同源重组质粒5'Arm-IRES-hrGFP-3'Arm，通过对食蟹猴受精卵显微注射Cas9 mRNA、sgRNA与供体质粒5'Arm-IRES-hrGFP-3'Arm混合体系，移植入代孕猴，利用细胞同源重组修复机制，将外源hrGFP定点插入目的基因Oct4的3'UTR区，成功获得定点基因敲入食蟹猴。
　　在研究基因缺陷导致的疾病中，除基因缺失而直接影响基因表达以外，大数据的筛查结果显示，许多单核苷酸改变的多态性或突变位点，或者短的碱基插入删除(Indel)也与多种疾病关联。为了很好地模拟人类疾病的这类遗传学改变，以及模拟该类致病突变位点的修复。本文利用单拷贝BFP基因的293T细胞系作为研究工具，优化ssODN的设计方法。针对BFP与GFP差异位点附近设计不同的ssODN和sgRNA，利用重组后细胞荧光的比例来判断重组效率。通过综合比较不同的设计的ssODN，以及ssODN与sgRNA的不同位置组合，发现利用互补链ssODN并且突变位点位于切口位置3'方向时，重组率相对较高。随后，利用CRISPR/Cas9系统，结合单链寡核苷酸供体(ssODN)进行小鼠胚胎共注射，利用ssODN作为同源重组模板，进行同源重组修复，成功构建了Usp42，Cep41，Fbxo47三个定点突变小鼠模型，为非人灵长类动物模型基于ssODN的基因编辑奠定了基础。
　　本研究将CRISPR/Cas9基因编辑系统应用于非人灵长类动物——食蟹猴，结合显微注射技术，成功构建出定点基因编辑食蟹猴。通过对阳性流产猴配子的基因鉴定，提示CRISPR/Cas9技术产生的基因编辑在食蟹猴中可以传递给子代。利用CRISPR/Cas9技术结合同源重组技术，获得了定点基因敲入食蟹猴。并利用细胞系和小鼠模型进一步优化了以ssODN作为同源重组模板进行点突变模型构建中的设计方案，根据ssODN与sgRNA相对位置的不同设计分组实验，发现ssODN的设计以及与sgRNA相对位置与重组效率有关，为进一步在灵长类模型的应用奠定了很好的基础。

目录

声明

摘要

前言

第一部分 利用CRISPR／Cas9系统构建基因编辑食蟹猴

引言

实验材料

1．1 实验动物

1．2 主要仪器设备

1．3 克隆构建相关试剂

1．4 体外转录及扩增相关试剂

1．5 细胞培养相关试剂

实验方法

2．1 sgRNA设计与载体构建

2．2 质粒提取

2．3 体外转录sgRNA

2．4 体外转录Cas9 mRNA

2．5 细胞培养与细胞转染

2．6 细胞水平基因编辑鉴定

2．7 食蟹猴受精卵获取与原核注射

2．8 基因编辑猴鉴定

2．9 基因敲入猴同源重组载体构建

2．10 基因敲入猴基因鉴定

实验结果

3．2 NrOb1、Ppar-γ、Rag1 sgRNA在猴囊胚编辑效率验证

3．3 运用NrOb1、Ppar-γ、Rag1 sgRNA成功构建阳性编辑猴

3．4 食蟹猴基因编辑染色体来源鉴定

3．5 流产猴基因编辑鉴定

3．6 用于定点敲入的sgRNA效率及脱靶效应检测

3．7 基因定点敲入Oct4-IRES-hrGFP猴囊胚检测

3．8 基因定点敲入Oct4-IRES-hrGFP流产猴检测

3．9 基因定点敲入Oct4-IRES-hrGFP活猴检测

讨论

小结

第二部分 基于点突变小鼠模型构建的CRISPR／Cas9方法优化

引言

实验材料

1．1 实验动物

1．2 主要仪器设备

1．3 克隆构建相关试剂

1．4 体外转录相关试剂

1．5 细胞培养相关试剂

实验方法

2．1 sgRNA设计与载体构建

2．2 质粒提取

2．3 细胞培养与细胞转染

2．4 细胞电转

2．5 细胞水平基因编辑鉴定

2．6 细胞水平脱靶检测

2．7 小鼠受精卵获取与原核注射

2．8 点突变小鼠基因型鉴定

实验结果

3．1 细胞水平点突变验证

3．2 不同ssODN对重组效率的影响

3．3 ssODN与sgRNA位置关系对重组效率的影响

3．4 利用CRISPR／Cas9系统结合ssODH构建点突变小鼠

3．5 点突变小鼠设计方法总结

讨论

小结

参考文献

文献综述 基因编辑技术进展

攻读学位期间发表文章情况

致谢