卵形鲳鲹主要致病链球菌多重PCR诊断技术的建立

摘要

[目的]快速、准确地检测卵形鲳鲹(Trachinoms ovatus)感染无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)、海豚链球菌(Streptococcus iniae)和格式乳球菌(Lactococcusgarvieae)4种主要的致病菌,为卵形鲳鲹的健康养殖提供依据.[方法]针对4种致病菌的特异基因设计特异性引物cfb-F/cfb-R,tuf-F/tuf-R,Si-F/Si-R,PLG-F/PLG-R,建立多重PCR反应体系,通过调试各引物对之间的最佳比例以及最适退火温度,对反应体系进行优化及灵敏度测试.2014年6～8月,应用该体系对北海及湛江各养殖场的发病卵形鲳鲹进行检测,然后用通用引物扩增16S rRNA基因,经测序、比对检测体系的准确性.[结果]反应体系中cfb-F/cfb-R,tuf-F/tuf-R,Si-F/Si-R,PLG-F/PLG-R的最适浓度分别为0.2 μmol/L,0.08 μmol/L,1.6 μmol/L和0.4 μmol/L;最优退火温度为54.3℃;4种目标菌的检测灵敏度为5×10-2 ng/μL;11份病原样品检测中,2份出现海豚链球菌的目的条带,4份出现无乳链球菌的目的条带,5份未见目的条带,和测序分析结果一致.[结论]多重PCR方法能代替传统的微生物检测方法特异、快速、灵敏地检测4种致病菌.