膀胱癌相关蛋白对宫颈癌细胞的影响及其在细胞周期信号传导网络中的作用

摘要

目的：探讨膀胱癌相关蛋白（ BLCAP）发挥抑癌功能的分子机制及其在细胞周期信号传导网络中的作用和地位。方法应用分子克隆技术，构建BLCAP真核表达重组质粒pEF－BLCAP－3×Flag，原核表达重组质粒pGEX－KG－BLCAP和pET－32a－BLCAP。应用瞬时转染、RT－PCR和Western blot检测BLCAP的过表达引起的相关信号分子在mRNA和蛋白水平的表达差异。应用免疫共沉淀和免疫印迹技术检测和确定能与BLCAP相互作用的蛋白分子。采用大肠杆菌体外表达系统，诱导表达并纯化回收BLCAP融合蛋白，并做SDS－PAGE和Western blot分离、鉴定，大量制备留存备用。结果构建带有Flag标签的真核表达重组质粒pEF－BLCAP－3× Flag，带有GST标签的原核表达重组质粒pGEX－KG－BLCAP及带有His标签的原核表达重组质粒pET－32a－BLCAP，并经PCR、双酶切和测序鉴定，确定其插入序列和开放读码框均正确无误。 RT－PCR结果显示在转染BLCAP基因的细胞中，BLCAP的mRNA水平高表达的同时，抑癌基因Rb1的mRNA水平也显著提高。 Western blot结果证实，BLCAP过表达时，RB1蛋白的水平也明显增高，但磷酸化RB蛋白的表达水平无明显差异。免疫共沉淀和免疫印迹结果证实，在生理水平，BLCAP能够与RB1结合，同时也能与磷酸化的RB结合。利用大肠杆菌表达系统大量表达和纯化回收BLCAP融合蛋白，经SDS－PAGE和Western blot检测确为我们所需的目的蛋白。结论 BLCAP很可能通过与细胞周期调控蛋白RB1的作用而使得细胞无法通过G1／S checkpoint，从而发挥其抑制细胞生长和诱导凋亡的功能。