人鞘磷脂合酶干扰载体的构建与鉴定

摘要

目的 构建沉默人鞘磷脂合酶1 (SMS1)和鞘磷脂合酶2(SMS2)基因表达的重组干扰载体,为进一步研究人SMS1和SMS2基因与动脉粥样硬化及其他疾病发生的关系提供研究基础.方法 根据基因序列数据库中报道的人SMS1和SMS2基因序列及短发夹RNA (shRNA)设计原则,设计并合成用于构建人SMS沉默载体的DNA寡核苷酸,应用基因重组技术分别和线性化pSUPER干扰载体连接,构建了pSUPER-SMS1和pSUPER-SMS2重组干扰载体,并用EcoRⅠ和HindⅢ限制性内切酶同时处理重组载体pSUPER-SMS1和pSUPER-SMS2,随后测序,以鉴定重组干扰载体含有目的序列.同时为检测重组干扰载体对人SMS1和SMS2基因的干扰效率,本研究利用脂质体(Lipofectamine 2000)分别转染肝癌细胞HepG2,于48 h后分别检测HepG2细胞SMS1和SMS2mRNA的转录水平与SMS酶活(薄层层析法,TLC).结果 所筛选到的重组质粒pSUPER-SMS1和pSUPER-SMS2经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后获得了281 bp DNA片段,且测序结果和理论设计的DNA寡核苷酸一致;随后检测转染HepG2细胞后SMS1和SMS2的mRNA表达水平.实验结果显示SMS1和SMS2的表达分别下降了45％和67％(P＜0.001,n=3),而TLC法的酶活结果检测显示,SMS1和SMS2干扰后的SMS酶活均有显著下降,分别下降了56％和63％(P＜0.001,n=3).结论 成功构建了人SMS1以及SMS2基因的沉默载体即pSUPER-SMS1和pSUPER-SMS2.