羊种布鲁菌16M LPS单克隆抗体制备与鉴定

摘要

cqvip:目的提取并纯化羊种布鲁菌16M的脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS),制备抗布鲁菌LPS的单克隆抗体。方法采用酚水法提取羊种布鲁菌16M的LPS,通过冷甲醇二次沉淀纯化法纯化LPS,使用脂多糖定量检测试剂盒检测LPS的含量,通过SDS-PAGE及银染显色检测LPS的纯度。使用一定剂量纯化后的LPS皮下多点注射免疫Balb/c小鼠,通过间接ELISA法检测免疫小鼠血清效价,选取效价最高的小鼠进行腹腔注射免疫。取已免疫好的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0在聚乙二醇1500的作用下进行细胞融合,利用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞株并冻存。选取10周龄雌性Balb/c小鼠腹腔注射阳性杂交瘤细胞株,待小鼠腹部明显胀大后收集腹水。对收集的腹水即获得的单克隆抗体进行效价分析,亚类测定,纯度检测及特异性试验。结果提取的羊种布鲁菌16M的LPS浓度为1 mg/mL,纯度较高。制备的两株单克隆抗体的亲和常数分别为1.12×109和1.11×109,效价分别为1∶6400和1∶12800;亚类分别G3和G1,轻链类型均为κ型;纯度大于90%;均可以识别布鲁菌A、M抗原位点;均可与标准试管凝集抗原形成明显的凝集物;免疫荧光试验结果显示筛选的单抗均具有良好的反应原性,与羊种布鲁菌16M、牛种布鲁菌2308以及猪种布鲁菌S2孵育1 h后可见免疫荧光。结论成功获得了2株羊种布鲁菌16M LPS单克隆抗体,其效价高、纯度好、敏感性高、反应原性强,为后续研究这2株单克隆抗体的特性,建立布鲁菌快速病原及抗体检测方法及研制布鲁菌快检试剂盒奠定基础。