羊布鲁菌BCSP31蛋白的表达、纯化及其单克隆抗体的制备和鉴定

摘要

布鲁菌是引起人兽共患布鲁菌病的病原菌。布鲁菌有7个生物种型，其中羊、牛、猪三个种既可感染家畜也可以感染人类。布鲁菌可通过多种途径感染人和动物，致病性强，流行范围广，危害十分严重。此外，布鲁菌还是一种潜在的生物战剂。　　布鲁菌病临床症状轻重不一，个体表现差异大，容易误诊，治疗不当会导致病情迁延，影响人畜健康并导致经济损失。此外，现有的布鲁菌检测方法仍不理想，存在特异性不高，不能区分疫苗免疫和自然感染，容易误诊和漏诊。随着近年来布鲁菌病日益增高的流行趋势，发展快速敏感特异的检测方法对控制布鲁菌病疫情，及时处置病畜、治疗患者有重要意义。　　布鲁菌细菌表面31kDa蛋白BCSP31具有抗原性强、在不同种间同源性高的特点。本研究拟通过纯化BCSP31蛋白，制备其单克隆抗体（mAb），为建立布鲁菌病ELISA检测方法奠定基础。　　1.主要方法　　将质粒pGEX-4T-1-BCSP31转化至大肠杆菌并诱导表达，采用GST亲和层析纯化的方法，分别获得GST-BCSP31融合蛋白和BCSP31纯化蛋白。用纯化的BCSP31蛋白免疫小鼠，将小鼠脾细胞与骨髓瘤Sp2/0细胞融合，ELISA间接法筛选阳性克隆，3次克隆化后建立杂交瘤细胞系。采用小鼠腹腔接种杂交瘤细胞制备腹水，正辛酸－硫酸铵法纯化mAb。采用Western-blot、ELISA以及表位相加试验等方法鉴定mAb特性。建立用于检测布鲁菌感染血清的ELISA间接夹心法。　　2.主要结果　　GST-BCSP31融合蛋白在25℃诱导时为可溶性表达，经亲和层析纯化，分别获得GST-BCSP31融合蛋白2.48mg/mL和BCSP31纯化蛋白0.5mg/mL；Western-blot检测结果显示所获蛋白可与兔抗布鲁菌血清特异性反应。获得2株杂交瘤细胞系，1F1和1E5，均为IgG1亚类；2株mAb均可与羊布鲁菌BCSP31蛋白特异性反应，而不与HCVAS3蛋白、结核分枝杆菌DAF44a蛋白和RPF蛋白、汉坦病毒GP和NP以及人IgG1等无关蛋白反应，也不与大肠杆菌裂解液反应，表明这两株mAb具有较高的特异性。并且这两株mAb在BCSP31蛋白上的抗原位点不同；mAb1F1与BCSP31蛋白的相对亲和力高于1E5。ELISA间接夹心法的工作条件是以10μg/mL包被mAb，包被量为100μl/孔；抗原最佳浓度为20μg/mL，加入量为100μl/孔；HRP-羊抗兔最佳工作浓度为1:50000，加入量为100μl/孔。对相应参数进行评估，特异性、敏感性及重复性均良好。　　BCSP31的纯化及其mAb的获得以及ELISA检测方法的建立，不仅有助于进一步了解与布鲁菌感染和免疫相关的抗原成分及其作用机制，也为进一步研制布鲁菌检测试剂盒提供了基础。

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文献回顾

1 布鲁菌的致病机制及与其致病性相关的基因和蛋白

2 布鲁菌病检验诊断方法

3 布鲁菌的免疫机制

4 布鲁菌疫苗的研究

研 究 内 容

1 实验材料

2 实验方法

3 结 果

4 讨 论

小结

参考文献

个人简历

致谢