牛干扰素诱导蛋白-10单克隆抗体的制备及其流式检测方法的建立

摘要

为制备针对牛干扰素诱导蛋白-10(BoIP-10)的高亲和力单克隆抗体(MAb),并建立基于胞内染色技术的BoIP-10流式检测方法,本研究以纯化的原核表达融合蛋白rHis-BoIP-10为免疫原,使用纯化的rGST-BoIP-10为筛选抗原,利用淋巴细胞杂交瘤技术制备并筛选针对BoIP-10的MAb,结果显示,筛选获得8株稳定分泌BoIP-10 MAb的细胞株,分别为3E11、2A5、1C6、3B12、3E12、2D5、2H8和3A12;通过间接ELISA鉴定MAbs与真核BoIP-10的反应性,结果显示2A5、2D5、2H8等3株MAb与毕赤酵母表达的BoIP-10有较好的反应性;进一步采用阻断ELISA方法评价MAbs是否结合血浆中的天然BoIP-10,结果表明MAb 2D5可以识别血浆中的天然BoIP-10.将MAbs进行荧光标记后建立BoIP-10流式检测方法,结果显示建立的BoIP-10流式检测方法最佳刺激剂为ConA,最优刺激浓度为20μg/mL,最佳MAb株为2D5,MAb的最优使用浓度为4μg/mL.采用该BoIP-10流式方法检测BCG诱导牛外周血单核细胞BoIP-10的表达水平,结果显示BCG体外感染牛外周血单核细胞12h时表达较高水平的BoIP-10.本研究制备并筛选出针对天然BoIP-10的特异性MAb 2D5,基于此建立的流式检测方法为进一步研究BoIP-10在牛机体免疫应答评价、牛结核病等传染性动物疫病诊断中的应用提供新的技术手段.