牛细小病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA方法的建立

摘要

为建立一种快速检测牛细小病毒(BPV)的方法,本研究通过PCR扩增BPV VP2基因,构建pProHTa-BPV-VP2重组表达载体,转化后获得重组大肠杆菌,通过诱导表达获得VP2重组蛋白,将其纯化后免疫小鼠(100 μg/只),经细胞融合、克隆和筛选共获得了5株阳性杂交瘤细胞株,分别命名为5G9、2B5、6A3、7E8和2B6.经鉴定,其分泌抗体亚型分别为IgG2a、IgG2b、IgM、IgM和IgA.间接免疫荧光结果显示,5株单克隆抗体(MAb)与BPV均可发生特异性反应.同时,将纯化后的BPV VP2重组蛋白免疫新西兰兔,制备兔抗BPV VP2多抗.利用制备的2B5作为检测抗体,BPV VP2多抗作为捕获抗体,初步建立检测BPV的双抗体夹心ELISA方法.该方法的特异性试验结果显示,除BPV外,与牛轮状病毒、猪伪狂犬病毒、猪传染性肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、牛病毒性腹泻病毒均不发生反应.敏感性试验结果显示,该方法对BPV最低检出量为3.125×102.8TCID50/mL.重复性试验结果显示,该方法批内、批间变异系数均小于10％.利用该方法对269份临床猪腹泻病料样品进行检测,检出BPV阳性样品14份,与PCR方法符合率达100％.综上,本研究利用抗BPV VP2蛋白的MAb和兔抗BPV VP2多抗建立了双抗体夹心ELISA方法,该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,为BPV感染的快速诊断提供一种有效的检测方法,并为流行病学研究和疫病防控提供一种可靠的手段.