人前脑啡肽原基因修饰的永生化大鼠星形胶质细胞株的构建

摘要

目的:构建人前脑啡肽原(hPPE)基因修饰的永生化大鼠星形胶质细胞株.方法:采用DNA重组技术将质粒pCMVhPPE.SEQ中的人前脑啡肽原基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)上,经酶切鉴定和测序分析后,采用脂质体介导法将重组质粒pcDNA3.1(+)-hPPE和空质粒pcD-NA3.1(+)分别转染永生化大鼠星形胶质细胞株(IAST).经G418(600μg/ml)筛选,挑选阳性克隆并扩大培养.采用免疫细胞化学法、RT-PCR和放射免疫法检测转染细胞亮氨酸脑啡肽(L-EK)的表达及分泌,同时检测Neo基因的存在以证实转染成功.结果:重组质粒经酶切后分别出现5.4kb和950bb片段,测序分析与文献报道结果一致,表明重组质粒pcDNA3.1(+)-hPPE亚克隆成功.Neo基因检测显示重组质粒和空质粒已成功转染至IAST中,筛选获得IAST/hPPE和IAST/Neo两个细胞株,L-EK免疫染色均阳性,但平均光密度结果显示IAST/hPPE的L-EK表达明显强于IAST/Neo和IAST(P＜0.01).IAST/hPPE细胞与IAST/Neo和IAST细胞相比,hPPE mRNA表达水平和培养上清液中L-EK的分泌量明显增高(P＜0.01),而IAST与IAST/Neo细胞相比无显著性差异(P＞0.05).结论:成功构建了人前脑啡肽原基因修饰的永生化大鼠星形胶质细胞株(IAST/hPPE),为该细胞移植用于镇痛的研究奠定了基础.