牛pAcGFP-FADD融合蛋白真核表达载体构建及在CHO-K1细胞中的表达

摘要

FADD是Fas/FasL系统的一个信号连接蛋白,通过传递凋亡信号,介导细胞凋亡.为了揭示FADD在牛卵泡发育过程中的调控作用,采用RT-PCR从牛卵巢组织中扩增FADD基因,将其cDNA终止密码子删除,采用定向克隆技术连接到带有水母绿色荧光蛋白(AcGFP)报告基因的真核表达载体pAcGFP-N1中,构建融合蛋白重组质粒,经BglⅡ/EcoR Ⅰ酶切、测序鉴定后,用脂质体介导质粒转染CHO-K1细胞,观察有无荧光的表达及用RT-PCR和Western blotting方法检测基因转录、表达情况.结果表明,成功克隆牛FADD基因,通过PCR方法在FADD阅读框两端引入了Bgl Ⅱ和EcoR Ⅰ克隆位点,并于起始位点前加入Kozak序列,成功构建pAcGFP- bFADD融合蛋白真核表达载体,重组质粒转染CHO-K1 24 h后在荧光显微镜下观察到绿色荧光,转染效率可达65%,通过RT-PCR扩增出654 bp的转录产物,并用Western blotting检测到51.4 kD目的蛋白的表迭.