DN-AMPK腺病毒载体的构建及其在小鼠成肌细胞系C2C12肌管分化中的影响

摘要

在研究AMPK的调控网络时,通常利用过表达显性失活突变型AMPK(dominant negative AMPK,DN-AMPK)作为研究手段来验证AMPK在某些重要生理病理调节通路中的关键作用.旨在利用Ad5腺病毒载体体系构建Ad-DN-AMPK表达载体,并在成肌细胞系C2C12中检测无活性AMPK高表达后对C2C12细胞分化为肌管细胞的影响.通过构建AMPKα1(D159A)和AMPKα2(K45R)的腺病毒表达载体,在HEK293细胞中成功包装并扩增出完整的腺病毒,待其感染能力基本稳定后,将腺病毒感染C2C12,利用激光定量成像仪检测其感染滴度,感染效率能高达100％,并且能够持续表达6d.DN-AMPK高表达后,AMPK常用激活剂A769662(SN-5)不能激活AMPK,表现为AMPK下游蛋白活性丧失,如ACC磷酸化无变化.通过实时定量PCR的方法,检测DN-AMPK对C2C12分化为肌管细胞的影响,结果表明过表达DN-AMPK能够促进C2C12细胞分化为肌管细胞的标记蛋白(Myod 和Myogenin)的表达,即促进C2C12分化为肌管细胞.