DPF2下调OCT4蛋白水平促进胚胎干细胞向神经外胚层分化

摘要

背景：胚胎干细胞（Embryonic stem cell，ESC）可定向分化为神经外胚层（Neuroectoderm，NE），为NE形成研究提供体外平台。NE是神经系统的起源，是中枢神经系统特定区域神经细胞形成的先决条件，体外获得NE为神经退行性疾病的细胞替代治疗提供了细胞来源，因此了解涉及NE分化的内在和外在的因素有重要意义。OCT4是保持胚胎干细胞多能性和自我更新的关键调控因子，OCT4蛋白水平对胚胎干细胞的分化有着至关重要的作用。DPF2，是植物同源结构域（Plant homeodomain，PHD）锌指蛋白的一种，作为转录因子参与细胞内的各种调控过程。DPF2也是潜在的泛素连接酶，负责降解特定靶蛋白。已知DPF2和OCT4或者含有OCT4的蛋白复合物结合，但是对OCT4蛋白水平的影响尚不十分清楚。
　　目的：本文旨在研究：1) DPF2和OCT4体内、外相互结合；2) DPF2下调OCT4蛋白水平是否参与ESC向NE分化；3)细胞密度对诱导ESC分化为NE的影响；4) DPF2在小鼠脊髓和海马中的表达情况。
　　方法：1)选取人ESC系H9细胞，按不同细胞密度接种，并用RA诱导H9细胞向NE分化，再分别应用IF和IB技术检测衍生细胞内NE标记蛋白PAX6的表达情况；2)选取小鼠P19细胞，通过Co-IP和IF技术验证OCT4和DPF2相互结合；3)选取P19细胞转染DPF2小干扰RNA（small interference RNA，siRNA）并诱导NE分化，同时用携带DPF2siRNA的慢病毒感染H9细胞并以RA诱导分化，通过IB技术检测DPF2与OCT4的表达以及NE特征性蛋白的表达；4)选取C57/BL6胚胎小鼠(E13.5)和成年小鼠（10~12周，体重25~30g）为研究对象，应用免疫组织化学技术，检测胎鼠脊髓、成年小鼠脊髓和海马中DPF2和PAX6蛋白的表达情况。
　　结果：
　　1)高细胞接种密度可以协同SB431542和NOGGIN，显著增加PAX6阳性的H9衍生NE细胞，减少OCT4阳性H9衍生细胞。上述NE细胞经诱导可进一步分化为神经元；
　　2)在P19细胞内，DPF2和OCT4可相互结合；
　　3) RA诱导正常H9细胞分化过程中，DPF2上调伴随OCT4下调；在DPF2敲低H9细胞内，RA不再诱导DPF2上调和OCT4下调；
　　4）在正常P19细胞内，RA可以显著上调PAX6表达和下调OCT4表达，同时伴随DPF2的显著上调。而在敲低DPF2的P19细胞内，RA不再下调OCT4和上调PAX6；
　　5)在E13.5胎鼠脊髓，成鼠的脊髓和海马中均检测到DPF2的表达，且多分布在神经细胞核胞核内；在成鼠海马，CA1区 DPF2的表达明显多于海马其它区域；脊髓的中央管室管膜细胞和海马的齿状回细胞内均可检测到较丰富的DPF2表达。
　　结论：
　　1)高细胞接种密度可促进NE分化；
　　2) DPF2细胞内可以结合OCT4，下调OCT4蛋白水平，促进胚胎干细胞NE分化，可能与早期神经分化有关；
　　3) DPF2在中枢神经系统表达，可能与新生神经细胞的发生有关。

目录

声明

缩略语表

1前言

2材料与方法

2.1材料

2.1.1细胞系及动物模型

2.1.2 主要仪器

2.1.3 主要试剂及耗材

2.1.4 试剂盒

2.1.5 抗体

2.1.6 针对小鼠DPF2siRNA的靶序列

2.1.7 针对人LV-DPF2 siRNA的慢病毒

2.1.8 试剂的配制及使用

2.2方法

2.2.1 细胞培养

2.2.2 转染或感染siRNA

2.2.3 H9细胞诱导神经分化

2.2.4 P19细胞诱导神经分化

2.2.5 Western blot实验

2.2.6免疫共沉淀（Co-IP）

2.2.7免疫荧光（IF）

2.2.8 HE染色

2.2.9免疫组织化学（IHC）

2.2.10 统计方法

3 结果

3.1 高细胞接种密度促进H9细胞NE分化

3.2 H9衍生的NE细胞分化成神经元

3.3 P19细胞中OCT4和DPF2的相互结合

3.4 携带DPF2siRNA的慢病毒感染H9细胞

3.5 DPF2siRNA上调OCT4蛋白水平抑制RA诱导H9分化

3.6 DPF2促进P19细胞向NE分化

3.7 胎鼠脊髓DPF2的表达情况

3.8 成鼠脊髓和海马DPF2的表达情况

4 讨论

5 结论

参考文献

附录

致谢

综述:DPF2的作用及其在神经系统的表达情况研究进展